一种提取淡水鱼背侧肌肌球蛋白的方法
【专利摘要】本发明涉及一种提取淡水鱼背侧肌肌球蛋白的方法，属于水产品【技术领域】。本发明方法的步骤是先把活鱼放入装有新鲜清水的周转箱内静置1～2h；快速采取活鱼背侧肌；将鱼肉丁用冰水冲洗；再用缓冲溶液漂洗；最后制得肌球蛋白溶液。本发明在提取家鱼背侧肌肌球蛋白时通过消除组织蛋白酶L的影响，获得较高纯度的鱼肉肌球蛋白。
【专利说明】一种提取淡水鱼背侧肌肌球蛋白的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种提取淡水鱼背侧肌肌球蛋白的方法，尤其涉及一种提取淡水鱼背侧肌肌球蛋白时消除组织蛋白酶L影响的方法，属于水产品【技术领域】。
【背景技术】
[0002]肌球蛋白是鱼肉中含量最高也是食品加工中最重要的蛋白质，约占鱼肉总蛋白质的三分之一，占肌原纤维蛋白的55%~60%。肌球蛋白可形成具有立体网络结构的热诱导凝胶和高压诱导凝胶。肌球蛋白形成热诱导凝胶是非常重要的工艺特性，直接影响鱼糜类制品的质地、保水性和感官品质等。
[0003]溶酶体中存在多种组织蛋白酶，目前已从鱼贝类肌肉和内脏中纯化并鉴定出10种组织蛋白酶，即组织蛋白酶A、B、C、D、E、H、L、L-1ike及X。溶酶体组织蛋白酶L属于木瓜蛋白酶超家族，具有内肽酶活，是溶酶体型半胱氨酸蛋白内肽酶。
[0004]鱼肉肌肉内源组织蛋白酶L活性高，组织蛋白酶L的性质与鱼糜制品品质密切相关，组织蛋白酶L分子质量24ku，最适于在pH3.0~6.5环境下降解肌球蛋白。有的组织蛋白酶与肌原纤维紧密结合，仅漂洗难以洗脱鱼肉组织蛋白酶L，而其他组织蛋白酶可以从肌原纤维蛋白上洗脱下来。低PH值范围内发生的蛋白质自溶主要是由组织蛋白酶L引起的，导致凝胶形成能力差，直接影响鱼糜品质。
[0005]目前提取淡水鱼背侧肌肌球蛋白时的前处理通常是将鱼肉直接采肉、切丁、于冰水溶液中漂洗，再进行匀浆、提取肌球蛋白。而组织蛋白酶L主要存在于鱼肉的肝脏、溶酶体和血液中，低pH值和高温会促进溶酶体的破裂，而使溶酶体中的组织蛋白酶L释放出来，与肌球蛋白接触并使其降解。提取肌球蛋白时通常是直接采肉，就可以避免肝脏中组织蛋白酶L对肌球蛋白的影响，根据弱碱性和低温协同作用使溶酶体稳定来减少组织蛋白酶L的活性；对于血液中的组织蛋白酶L，`通过快速漂洗鱼肉来减少组织蛋白酶L的活性。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种提取淡水鱼背侧肌肌球蛋白的方法，使用该方法可以有效减小提取淡水鱼背侧肌肌球蛋白时组织蛋白酶L的活性，提高肌球蛋白的浓度。
[0007]本发明解决其技术问题所采用的方法包括如下步骤:
(O活鱼放入周转箱内静置I~2 h，周转箱中注入干净新鲜的自来水，注水量以没过鱼体为准，并不断向周转箱中充入氧气；
(2)将活鱼放在工作台上，从活鱼头背连接处开刀快速采取背侧肌，马上将采好的背侧肌置于冰水比w/v =1:5的冰水中漂洗10~20s，随即将鱼块捞出切成I~5cmXl~5cmX I~5cm鱼肉丁,此步骤时间控制在I min之内；
(3)将鱼肉丁置于干净滤网上,马上用冰水比w/v=l:5的冰水冲洗I~1.5 min ；
(4)鱼肉丁于5~8倍、温度为O~4°C、pH值为7.2~7.6、20mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液中漂洗10~20 min ；(5)将鱼肉丁组织捣碎，放在10倍体积的缓冲溶液A中漂洗20min, 1000Xg离心5-15min ;取出沉淀，放在沉淀5倍体积的缓冲溶液B中悬浮，加ATP至终浓度为IOmmol/L，2-6°C下放置0.5-1.5h, 15000Xg离心5-15 min ;上清液用5倍体积IMmol KHCO3溶液稀释，放置10-20min，12000Xg离心5_15min ;沉淀于5倍体积缓冲溶液C中匀浆，放置5-15min ;再用3倍体积lmmol/LKHC03溶液稀释，添加无水MgCl2至浓度为10mmol/L, 2_6°C下放置8-12h ;25000Xg离心15-25min ;沉淀物用2倍体积的缓冲溶液C溶解，得到肌球蛋白溶液；制备好的肌球蛋白溶液置于2-6°C温度下；
(6)测定肌球蛋白溶液组织蛋白酶L的活性和肌球蛋白溶液的浓度。
[0008]所述步骤(5)中缓冲溶液A为0.1M KClUmM PMSF和0.02% NaNj^20mM Tris-HCl缓冲液，pH为7.5。
[0009]所述步骤(5)中缓冲溶液B为0.45M KCl、5mM β _巯基乙醇、0.2 M醋酸镁、ImM乙二醇-双-(2-氨基乙基)四乙酸的20mM Tris-HCl缓冲液，pH为6.8。
[0010]所述步骤(5)中缓冲溶液C为0.5M KCl、5mM β -巯基乙醇的20mM Tris-HCl缓冲液，pH为7.5。
[0011]所述步骤(1)- (5)的环境温度控制在10°C以下。
[0012]本发明的有益效果:
(1)将活鱼静养I~2h后再快速采肉，避免了因活鱼过分挣扎而导致机体应激反应而使溶酶体破裂，使组织蛋白酶L释放到鱼肉中，初步达到控制组织蛋白酶L活性的效果，为下一步提供了便利；
(2)采肉后马上用冰水冲洗，同时时间控制在Imin之内，在溶酶体和血液释放组织蛋白酶L的同时迅速用流动水冲洗，使释放出来的组织蛋白酶L来不及与肌球蛋白结合，有效减小鱼肉中组织蛋白酶L的活性；
(3)根据组织蛋白酶L的最适合pH是3.0~6.5，低pH值和高温会促进溶酶体的破裂，而pH过高会破坏肌球蛋白的结构，因此将鱼肉丁在pH值为7.2~7.6、温度为O~4°C、20mM的Tris-HCl缓冲溶液中漂洗10~15 min,既有效地防止溶酶体破裂，又抑制了组织蛋白酶L的活性，进一步控制了提取鱼肉肌球蛋白时组织蛋白酶L的活性。
【具体实施方式】
[0013]实施例1:
一种提取鲢鱼背侧肌肌球蛋白的方法，该方法包括如下步骤:
(1)活鲢鱼放入周转箱内静置Ih，周转箱中注入干净新鲜的自来水，注水量以没过鱼体为准，并不断向周转箱中充入氧气；
(2)将活鲢鱼放在工作台上，从鲢鱼头背连接处开刀快速采取背侧肌100克，马上将采好的背侧肌置于1000 mL冰水比w/v =1:5的冰水中漂洗10s，随即将鱼块捞出切成2cmX 2cmX 2cm鱼肉丁,此步骤时间控制在I min之内；
(3)将鱼肉丁置于干净滤网上,马上用冰水比w/v=l:5的冰水冲洗I min ；
(4)鱼肉丁于5倍、温度为O~4°C、pH值为7.2、20mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液中漂洗 IOmin ；
(5)将鱼肉丁组织捣碎，放在10倍体积的pH为7.5、0.1M KCl、ImM PMSF和0.02% NaN3的20mM Tris-HCl缓冲液中漂洗20 min，1000 X g离心5min ;取出沉淀，放在沉淀5倍体积的pH为6.8、0.45Μ KCl、5mM β-巯基乙醇、0.2 M醋酸镁、ImM乙二醇-双-(2-氨基乙基)四乙酸的20mM Tris-HCl缓冲液中悬浮，加ATP至终浓度为10mmol/L，2°C下放置0.5h，15000 Xg离心5min ;上清液用5倍体积IMmolKHCO3溶液稀释,放置IOmin, 12000 Xg离心5min ;沉淀于5倍体积pH为7.5,0.5M KCl、5mM β -巯基乙醇的20mM Tris-HCl缓冲液中匀浆，放置5min ;再用3倍体积1臟01/1腿0)3溶液稀释，添加无水MgCl2至浓度为lOmmol/L，2°C下放置8h ;25000Xg离心15min ;沉淀物用2倍体积的pH为7.5,0.5M KCl、5mM β-巯基乙醇的20mM Tris-HCl缓冲液溶解，得到肌球蛋白溶液；制备好的肌球蛋白溶液置于2V温度下；
(6)测定肌球蛋白溶液组织蛋白酶L的活性和肌球蛋白溶液的浓度如表1所示。
[0014]所述步骤(1) - (5)的环境温度控制在10°C以下。
[0015]
【权利要求】
1.一种提取淡水鱼背侧肌肌球蛋白的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤: (O活鱼放入周转箱内静置I~2 h，周转箱中注入干净新鲜的自来水，注水量以没过鱼体为准，并不断向周转箱中充入氧气； (2)将活鱼放在工作台上，从活鱼头背连接处开刀快速采取背侧肌，马上将采好的背侧肌置于冰水比w/v =1:5的冰水中漂洗10~20s，随即将鱼块捞出切成I~5cmXl~5cmX I~5cm鱼肉丁,此步骤时间控制在I min之内； (3)将鱼肉丁置于干净滤网上,马上用冰水比w/v=l:5的冰水冲洗I~1.5 min ； (4)鱼肉丁于5~8倍、温度为O~4°C、pH值为7.2~7.6、20mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液中漂洗10~20 min ； (5)将鱼肉丁组织捣碎，放在10倍体积的缓冲溶液A中漂洗20min, 1000Xg离心5-15min ;取出沉淀，放在沉淀5倍体积的缓冲溶液B中悬浮，加ATP至终浓度为IOmmol/L，2-6°C下放置0.5-1.5h, 15000Xg离心5-15 min ;上清液用5倍体积IMmol KHCO3溶液稀释，放置10-20min，12000Xg离心5_15min ;沉淀于5倍体积缓冲溶液C中匀浆，放置5-15min ;再用3倍体积lmmol/LKHC03溶液稀释，添加无水MgCl2至浓度为10mmol/L, 2_6°C下放置8-12h ;25000Xg离心15-25min ;沉淀物用2倍体积的缓冲溶液C溶解，得到肌球蛋白溶液；制备好的肌球蛋白溶液置于2-6°C温度下； (6)测定肌球蛋白溶液组织蛋白酶L的活性和肌球蛋白溶液的浓度。
2.根据权利要求1所述的提取淡水鱼背侧肌肌球蛋白的方法，其特征在于，所述步骤(5)中缓冲溶液 A 为 0.1M KClUmM PMSF 和 0.02% NaN3 的 2OmM Tris-HCl 缓冲液，pH 为7.5。
3.根据权利要求1所述的提取淡水鱼背侧肌肌球蛋白的方法，其特征在于，所述步骤(5)中缓冲溶液B为0.45M KCl、5mM β-巯基乙醇、0.2 M醋酸镁、ImM乙二醇-双_(2_氨基乙基)四乙酸的20mM Tris-HCl缓冲液，pH为6.8。
4.根据权利要求1所述的提取淡水鱼背侧肌肌球蛋白的方法，其特征在于，所述步骤(5)中缓冲溶液C为(λ 5M KCl、5mM β -巯基乙醇的20mM Tris-HCl缓冲液，pH为?.5。
5.根据权利要求1所述的提取淡水鱼背侧肌肌球蛋白的方法，其特征在于，所述步骤(O- (5)的环境温度控制 在10°C以下。
【文档编号】C07K14/46GK103554243SQ201310550300
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年11月8日 优先权日:2013年11月8日
【发明者】彭增起, 李君珂, 徐萌, 张雅玮, 王复龙 申请人:南京农业大学