细菌毒素疫苗的制作方法
【专利摘要】使用植物细胞高效地生产志贺毒素蛋白质等的细菌毒素蛋白质。志贺毒素蛋白质等细菌毒素蛋白质是这样生产的：用含有下述DNA的DNA构建物转染植物细胞，使植物细胞生产上述细菌毒素蛋白质，所述DNA是编码介由具有以下特征（A）和（B）的肽而串联连接的杂化蛋白质的DNA，（A）氨基酸的个数为12～30个；（B）脯氨酸的含有率为20～35％。
【专利说明】细菌毒素疫苗
[0001]本申请是基于以下中国专利申请的分案申请:
[0002]原案申请日:2009年4月28日
[0003]原案申请号:CN200980116606.9 (PCT/JP2009/058345)
[0004]原案申请名称:细菌毒素疫苗
【技术领域】
[0005]本发明涉及用于应对由志贺毒素、霍乱毒素、大肠杆菌易热性毒素等细菌毒素引起的疾病的疫苗的杂化蛋白质以及用于生产该杂化蛋白质的DNA构建物。
【背景技术】
[0006]志贺毒素(Stx、~口毒素)是病原性大肠杆菌中肠管出血性大肠杆菌(enterohemorrhagic Escherichia coli)产生的蛋白质性外毒素。志贺毒素引起出血性肠炎、溶血性尿毒症症候群、脑病等。
[0007]志贺毒素大致分为Stxl和Stx2，分别还可以再分成小类。Stx2可以例举引起猪水肿病的Stx2e。已知猪水肿病高发于断奶后I~2周的幼猪。水肿病菌的感染导致的致死率高达50~90%。
[0008]此外,霍乱毒素(CT)是霍乱杆菌(Vibrio cholerae)产生的蛋白质性外毒素。已知CT引起剧烈的腹泻和呕吐。
·[0009]此外，大肠杆菌易热性毒素(LT)是毒素原性大肠杆菌(enterotoxigenicEscherichia coli)产生的蛋白质性内毒素。已知LT引起腹湾和呕吐。
[0010]已知Stx、LT、CT中任何一种细菌毒素均是由与细胞附着有关的B亚单位5倍体和具有毒性的A亚单位I倍体构成。此外，已知LT和CT在结构上和功能上都很类似。
[0011]作为由这些细菌毒素引起的疾病的预防方法，已知的有通过注射或经鼻喷雾的方式给予疫苗或者口服疫苗的方法。
[0012]例如，已知有用重组大肠杆菌生产无毒化的Stx2e蛋白质、通过注射投予给猪的技术(非专利文献I)。但是，存在以下问题:利用重组大肠杆菌的无毒化Stx2e蛋白质的产量不够；通过注射投予疫苗需要花费人力等。
[0013]此外，从减轻劳动力的观点，口服投予疫苗的方法在畜产领域受到高度专注。在这样的背景下，开发了使用转基因技术使植物产生细菌毒素蛋白质的技术。例如，记载了含有编码LT蛋白质的B亚单位(LTB)的DNA、表达该DNA的转基因植物(专利文献1、专利文献2)。此外，还记载了表达编码LT蛋白质或CT蛋白质的DNA的转基因植物(专利文献3)。但是，这些技术存在蛋白质的产量不足的问题。此外，报告了让莴苣生产LTB的例子(非专利文献2)。在该研究中，使用植物高表达启动子一花椰菜花叶病毒(力U 7 9 7 — --Μ夕々^ ^ ^ ) 35S RNA启动子(CaMV35S)和增强子一Kozak序列，在莴苣内表达改变了密码子的LT蛋白质的B亚单位的基因。结果，报告LT蛋白质的B亚单位蓄积了莴苣的总可溶性蛋白质的约2.0质量％。但是，以这种程度的蛋白质的蓄积量，对于利用转基因植物有效地防除细菌病还是不够。即，有必要使目的细菌毒素蛋白质在植物细胞内有效地生产、蓄积。
[0014]发明人发现:通过用来自植物的醇脱氢酶基因的5'-非翻译区(ADH5’UTR)来表达来自植物的分泌信号肽加成在氨基末端的Stx2e蛋白质，可以使莴苣等植物有效地生产Stx2e蛋白质、在植物体内高浓度蓄积,并申请了专利(专利文献4)。
[0015] 【专利文献I】日本专利特表平10-507916号公报
[0016]【专利文献2】日本专利特开2000-166411号公报
[0017]【专利文献3】日本专利特表2002-533068号公报
[0018]【专利文献4】国际公开第2009/ 004842号小册子
[0019]【非专利文献I】Makino 等,Microbial Pathogenesis, 31 卷,N0.1, 2001 年 7月,pp.1-8(08)
[0020]【非专利文献2】Kim 等，Protein Expression and Purification, 51卷，N0.1, 2006 年 I 月，pp.22-27 (06)
【发明内容】
[0021]本发明的课题是，用植物细胞来更有效地生产Stx蛋白质以及具有与Stx蛋白质类似的高次结构的其他细菌毒素蛋白质。
[0022]发明人使植物细胞生产杂化蛋白质，所述杂化蛋白质是2或3个Stx2e、CT等细菌毒素的蛋白质介由特定序列的肽串联连接的杂化蛋白质，结果成功地做到细菌毒素的蛋白质在植物细胞内高浓度蓄积，并完成了本发明。
[0023]SP，本发明如下所述。
[0024](I) 一种杂化蛋白质，是2或3个志贺毒素蛋白质、霍乱毒素蛋白质或大肠杆菌易热性毒素蛋白质分别介由具有以下特征(A)和(B)的肽而串联连接的杂化蛋白质，
[0025](A)氨基酸的个数为12~30个；
[0026](B)脯氨酸的含有率为20~35%。
[0027](2)如(I)记载的杂化蛋白质，上述肽还具有以下特征(C)，
[0028](C)脯氨酸是每隔2氨基酸配置或每隔3氨基酸配置。
[0029](3)如(2)记载的杂化蛋白质，上述肽含有序列号2、82或84所示的氨基酸序列。
[0030](4)如(3)记载的杂化蛋白质，2个志贺毒素蛋白质、霍乱毒素蛋白质或大肠杆菌易热性毒素蛋白质介由含有序列号2所示的氨基酸序列的肽串联连接。
[0031](5)如(I)~(4)任意一项记载的杂化蛋白质，志贺毒素蛋白质是志贺毒素蛋白质的B亚单位。
[0032](6)如(I)~(5)任意一项记载的杂化蛋白质，志贺毒素蛋白质是Stx2e蛋白质。
[0033](7)如(I)~(4)任意一项记载的杂化蛋白质，霍乱毒素蛋白质是霍乱毒素蛋白质的B亚单位。
[0034](8)如(4)记载的杂化蛋白质，具有序列号10、12、14或16所示的氨基酸序列。
[0035](9)如(3)记载的杂化蛋白质，具有序列号86、88、90、92、94、96、98或100所示的
氨基酸序列。
[0036](10)如(I)~(9)任意一项记载的杂化蛋白质，来自植物的分泌信号肽加成在氨
基末端。[0037](11)如(10)记载的杂化蛋白质，内质网残留信号肽加成在羧基末端。
[0038](12) (I)~(9)任意一项记载的杂化蛋白质，叶绿体转移信号肽加成在氨基末端。
[0039](13)—种DNA构建物，含有编码(I)~(12)任意一项记载的杂化蛋白质的DNA。
[0040](14)如(13)记载的DNA构建物，含有具有序列号9、11、13或15所示的碱基序列的 DNA。
[0041](15)如(13)记载的DNA构建物，含有具有序列号85、87、89、91、93、95、97或99所不的喊基序列的DNA。
[0042](16)如(13)~(15)任意一项记载的DNA构建物，编码杂化蛋白质的DNA在来自植物的醇脱氢酶基因的5’ -非翻译区可表达地连接。
[0043](17)如(16)记载的DNA构建物，上述来自植物的醇脱氢酶基因的5’ -非翻译区来自烟草。
[0044](18)如(17)记载的DNA构建物，具有序列号24~29任意一项所示的碱基序列。
[0045](19)如(17)记载的DNA构建物，具有序列号101~111任意一项所示的碱基序列。
[0046](20)—种重组载体，含有(13)~(19)任意一项记载的DNA构建物。
[0047](21) —种转染子(形质转换体，transfectant)，被(20)记载的重组载体转染。
[0048](22)如(21)记载的转染子，转染子是转染植物细胞或转染植物。
[0049](23)由(21)或(22)记载的转染子得到的种子。
[0050](24)由序列号2、82或84所示的氨基酸序列构成的肽。
【专利附图】
【附图说明】
[0051]【图1】表示Stx2eB表达载体的图案的图。图中，一表示翻译开始点、▽表示翻译后被切断的部位。
[0052]【图2】在使用了莴苣原生质体的一时性表达实验中得到的、表示Stx2eB的蓄积水平的照片。
[0053]【图3】在使用了莴苣原生质体的一时性表达实验中得到的、表示CTB的蓄积水平的照片。
[0054]【图4】表示编码Stx2eB_YFP的融合蛋白质的DNA构建物的图案的图。图中，一表示翻译开始点、▽表示翻译后被切断的部位。
[0055]【图5】在使用了烟草培养细胞原生质体的一时性表达实验中得到的、表示Stx2eB-YFP的融合蛋白质的局部存在的照片。
[0056]【图6】在使用了烟草培养细胞原生质体的一时性表达实验中得到的、表示Stx2eB-YFP的融合蛋白质的局部存在的照片。
[0057]【图7】在使用了烟草培养细胞原生质体的一时性表达实验中得到的、表示ARFlpWT与ARFlpDN的共表达中的、液胞型GFP和Stx2eB_YFP的融合蛋白质的局部存在的照片。
[0058]【图8】在使用了烟草培养细胞(BY2)的转染实验中得到的、表示Stx2eB的蓄积水平的照片。各竖条的数字表示无性繁殖系(无性繁殖)编号。[0059]【图9】在使用了烟草培养细胞(BY2)的转染实验中得到的、表示Stx2eB的蓄积水平的照片。各竖条的数字表示无性繁殖系(无性繁殖)编号。[0060]【图10】在使用了烟草培养细胞(BY2)的转染实验中得到的、表示Stx2eB的蓄积水平的照片。各竖条的数字表示无性繁殖系编号。
[0061]【图11】在使用了烟草培养细胞(BY2)的转染实验中得到的、表示Stx2eB的蓄积水平的照片。各数字表示无性繁殖系编号。
[0062]【图12】表示Stx2eB的mRNA水平和Stx2eB的蓄积水平的关系的图。
[0063]【图13】表示编码Stx2eB的DNA构建物的图案的图。A表示内质网型、B表示细胞质型、C表示叶绿体型的DNA构建物的图案。
[0064]【图14】表示编码CTB的DNA构建物的图案的图。A表示内质网型、B表示细胞质型、C表示叶绿体型的DNA构建物的图案。
[0065]【图15】在使用了莴苣原生质体的一时性表达实验中得到的、表示Stx2eB的蓄积水平的照片。
[0066]【图16】在使用了莴苣原生质体的一时性表达实验中得到的、表示CTB的蓄积水平的照片。
[0067]【图17】在使用了烟草培养细胞(BY2)的转染实验中得到的、表示Stx2eB的蓄积水平的照片。各竖条的数字表示无性繁殖系编号。
[0068]【图18】在使用了烟草植物体的转染实验得到的、表示Stx2eB的蓄积水平的照片。各竖条的数字表示无性繁殖 系编号。
[0069]【图19】在使用了烟草植物体的转染实验得到的、表示Stx2eB的蓄积水平的照片。各竖条的数字表示无性繁殖系编号。
[0070]【图20】表示编码Stx2eB的DNA构建物的图案的图。
[0071 ]【图21】表示编码CTB的DNA构建物的图案的图。
[0072]【图22】在使用了烟草培养细胞(BY2)的转染实验中得到的、表示Stx2eB的蓄积水平的照片。
[0073]【图23】在使用了烟草培养细胞(BY2)的转染实验中得到的、表示CTB的蓄积水平的照片。
【具体实施方式】
[0074]本发明的杂化蛋白质，是2或3个志贺毒素(Stx)蛋白质、霍乱毒素(CT)蛋白质或大肠杆菌易热性毒素(LT)蛋白质分别介由具有以下特征(A)和(B)的肽而串联连接。
[0075](A)氨基酸的个数为12~30个；
[0076](B)脯氨酸的含有率为20~35%。
[0077]志贺毒素(Stx)分为I型(Stxl)和2型(Stx2)。Stxl还分为a~d亚单位、Stx2还分为a~g亚单位。志贺毒素蛋白质由作为毒性主体的一个A亚单位和与侵入肠管粘膜有关的5个B亚单位构成。
[0078]其中，例如，已知Stx2e是猪水肿病毒素，其A亚单位(Stx2eA)如序列号4的氨基酸序列所示、B亚单位(Stx2eB)如序列号6的氨基酸序列所示。
[0079]Stx2eA和Stx2eB，只要是投与猪后能够引起免疫应答，则序列号4或序列号6所示的氨基酸序列中的I个或数个氨基酸可以分别被取代、缺失、插入或加成。上述“数个”，例如，Stx2eA中，优选2~30个、更优选2~20个、进一步优选2~10个，Stx2eB中，优选2~10个、更优选2~5个、进一步优选2~3个。[0080]此外，Stx2eA和Stx2eB分别可以是与序列号4或序列号6所示的氨基酸序列优选具有85%以上、更优选90%以上、进一步优选95%以上的同一性，且投与猪后能够引起免疫应答的物质。
[0081]霍乱毒素(CT)蛋白质由作为毒性主体的I个A亚单位(CTA)和序列号8的氨基酸序列所示的与侵入肠管粘膜有关的5个B亚单位(CTB)构成。
[0082]CTB，只要是投与动物能够引起免疫应答，序列号8所示的氨基酸序列中的I个或数个氨基酸可以被取代、缺失、插入或加成。上述“数个”，优选2~10个、更优选2~5个、进一步优选2~3个。
[0083]此外，CTB可以是与序列号8所示的氨基酸序列具有优选85%以上、更优选90%以上、进一步优选95%以上的同一性、且投与动物后能够引起免疫应答的物质。
[0084]大肠杆菌易热性毒素(LT)蛋白质由作为毒性主体的I个A亚单位和与侵入肠管粘膜有关的5个亚单位构成。
[0085]本说明书中，将志贺毒素、霍乱毒素、大肠杆菌易热性毒素统称为“细菌毒素”。
[0086]上述肽的氨基酸的个数优选12~25个、更优选12~22个。此外，上述肽的脯氨酸的含有率优选20~27%、更优选20~25%。
[0087]此外，上述肽中优选每隔2个或每隔3个配置脯氨酸。但是，这种情况下，肽的末端中也可以连接5个以内、优选4个以内的脯氨酸以外的氨基酸。
[0088]此外，上述肽中，脯氨酸以外的氨基酸中，丝氨酸、甘氨酸、精氨酸、赖氨酸、苏氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、组氨酸和天冬氨酸的合计含有率优选70%以上、更优选80%以上、进一步优选90%以上。此外，上述肽中，脯氨酸以外的氨基酸中，丝氨酸、甘氨酸和天冬酰胺的合计含有率优选70%以上、更优选80%以上、进一步优选90%以上。此外，上述肽中，脯氨酸以外的氨基酸中，丝氨酸和甘氨酸的合计含有率优选70%以上、更优选80%以上、进一步优选90%以上。这是因为，含有较多这些氨基酸的肽难以获得二维结构(β-片结构或螺旋结构)。
[0089]另一方面，上述肽中，脯氨酸以外的氨基酸中，丙氨酸、蛋氨酸和谷氨酸的合计含有率优选30%以下、更优选20%以下、进一步优选10%以下。这是因为，含有较多这些氨基酸的肽容易获得螺旋结构。此外，上述肽中，脯氨酸以外的氨基酸中，色氨酸、白氨酸、异白氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸的合计含有率优选20%以下、更优选10%以下、进一步优选5%以下。这是因为，含有较多这些氨基酸的肽容易获得β_片结构和螺旋结构。
[0090]上述肽优选选自由序列号2所示的氨基酸序列构成的肽(PG12)、序列号82所示的氨基酸序列构成的肽(PGl7)、或由序列号84所示的氨基酸序列构成的肽(PG22)。
[0091]本发明的杂化蛋白质可以是2个或3个A亚单位与B亚单位的杂化蛋白质介由上述肽而串联连接，也可以是2个或3个A亚单位介由上述肽而串联连接，还可以是2个或3个B亚单位介由上述肽而串联连接。但是，本发明的杂化蛋白质，当含有A亚单位时，优选A亚单位被无毒化。本发明的杂化蛋白质优选2个或3个B亚单位介由上述肽而串联连接。此外，本发明的杂化蛋白质优选2个B亚单位介由PG12而串联连接。
[0092]此外，本发明的杂化蛋白质进而优选在其C末端上加成上述肽。尤其，本发明的杂化蛋白质优选在其C末端上加成PG12。[0093]本发明的杂化蛋白质具有例如，序列号10、12、14、16、86、88、90、92、94、96、98或
100所示的氨基酸序列。具有序列号10所示的氨基酸序列的杂化蛋白质，其2个Stx2eB介由PG12而串联连接。具有序列号12所示的氨基酸序列的杂化蛋白质，其2个CTB介由PG12而串联连接。具有序列号14所示的氨基酸序列的杂化蛋白质，其2个Stx2eB介由PG12而串联连接，进而，其C末端连接有PG12。具有序列号16所示的氨基酸序列的杂化蛋白质，其2个CTB介由PG12而串联连接，进而其C末端连接有PG12。具有序列号86所示的氨基酸序列的杂化蛋白质，其3个Stx2eB分别介由PG12而串联连接。具有序列号88所示的氨基酸序列的杂化蛋白质，其3个Stx2eB分别介由PG12而串联连接，进而其C末端连接有PG12。具有序列号90所示的氨基酸序列的杂化蛋白质，其2个Stx2eB介由PG17而串联连接，进而其C末端连接有PG12。具有序列号92所示的氨基酸序列的杂化蛋白质，其2个Stx2eB介由PG22而串联连接，进而其C末端连接有PG12。具有序列号94所示的氨基酸序列的杂化蛋白质，其3个CTB分别介由PG12而串联连接。具有序列号96所示的氨基酸序列的杂化蛋白质，其3个CTB分别介由PG12而串联连接，进而其C末端连接有PG12。具有序列号98所示的氨基酸序列的杂化蛋白质，其2个CTB介由PG17而串联连接，进而其C末端连接有PG12。具有序列号100所示的氨基酸序列的杂化蛋白质，其2个CTB介由PG22而串联连接，进而其C末端连接有PG12。
[0094]通过使用上述PG12、PG17或PG22等的肽作为连接上述细菌毒素蛋白质的连接物，增大了该细菌毒素蛋白质在植物细胞中的蓄积水平。
[0095]本发明的杂化蛋白质优选在其氨基末端加成来自植物的分泌信号肽或叶绿体转移信号肽。这里，“加成”这个概念包括上述分泌信号肽直接结合在介由上述肽连接的2个或3个上述细菌毒素蛋白质的氨基末端直接的情况和介由其他肽结合的情况。
[0096]分泌信号肽优选来自爺科(Solanaceae)、十字花科(Brassicaceae)、菊科(Asteraceae)的植物,进一步优·选属于烟草属(Nicotiana)、拟南芥属(Arabidopsis)、莴苣属(Lactuca)等的植物，更优选来源于烤烟(Nicotiana tabacum)、拟南芥(Arabidopsisthaliana)、萬苣(Lactuca sativa)等。
[0097]此外,优选来自烟草的β-D葡聚糖外水解酶(β-D-glucan exohydrolase)、烟草的 38kDa 过氧化物酶(GenBank Accession D42064)。
[0098]上述分泌信号肽可以例举，来自烟草的β -D葡聚糖外水解酶的肽、具有序列号18所示的氨基酸序列的肽。
[0099]叶绿体转移信号肽有例如，来自莴苣Rbcs (二磷酸核酮糖氧合酶小亚单位，RuBisCO small subunit, ^ ^^ ^ 乇一卟寸 7'二二 '乂卜)(GenBank ACCESSION D14001)的叶绿体转移信号肽(转运肽、T.P.、序列号79)。此外，编码来自莴苣Rbcs的叶绿体转移信号肽的DNA的碱基序列例如序列号80所示。本说明书中，也将氨基末端加成有叶绿体转移信号肽的杂化蛋白质称为叶绿体型(Chl)的杂化蛋白质，将编码该叶绿体型的杂化蛋白质的DNA构建物称为叶绿体型的DNA构建物。叶绿体型的杂化蛋白质尤其是在烟草等叶绿体发达的植物有效蓄积。
[0100]此外，将在氨基末端既没有加成分泌信号肽也没有加成叶绿体转移信号肽的杂化蛋白质称为细胞质型(Cyt)的杂化蛋白质，将编码该细胞质型的杂化蛋白质的DNA构建物称为细胞质型的DNA构建物。细胞质型的杂化蛋白质中尤其优选3个细菌毒素的B亚单位介由上述肽而串联连接。
[0101]进而，本发明的杂化蛋白质也可以在羧基末端加成内质网残留信号肽、液胞转移信号肽等信号肽。这里，“加成”的概念包括信号肽直接结合以及介由其他肽结合在上述杂化蛋白质的羧基末端。本说明书中，将在氨基末端加成了分泌信号肽、且羧基末端加成了内质网残留信号肽的杂化蛋白质称为内质网型(ER)的杂化蛋白质，编码该内质网型的杂化蛋白质的DNA构建物称为内质网型的DNA构建物。内质网型的杂化蛋白质尤其在莴苣等中有效蓄积。
[0102]本发明的杂化蛋白质优选在其羧基末端加成内质网残留信号肽。内质网残留信号肽可以例举含有KDEL序列(序列号19)、HDEL序列(序列号20)、KDEF序列(序列号21)或HDEF序列(序列号22)的内质网残留信号肽。 [0103]液胞转移信号肽优选属于爺科(Solanaceae)、十字花科(Brassicaceae)、菊科(Asteraceae)的植物，更优选属于烟草属(Nicotiana)、拟南芥属(Arabidopsis)、辣根属(Armoracia)等的植物，进一步优选来自烤烟(Nicotiana tabacum)、拟南芥(Arabidopsisthaliana)、辣根(Armoracia rusticana)等。此外,优选来自几丁质酶。来自烟草几丁质酶的液胞转移信号肽的氨基酸序列如序列号76所示。此外，编码来自烟草几丁质酶的液胞转移信号肽的DNA的碱基序列例如序列号75所示。
[0104]此外，优选来自辣根过氧化物酶Cla同工酶。来自辣根过氧化物酶Cla同工酶的液胞转移信号肽的氨基酸序列如序列号78所示。此外，编码来自辣根过氧化物酶Cla同工酶的液胞转移信号肽的DNA的碱基序列例如如序列号77所示。本说明书中，也将氨基末端加成了分泌信号肽且羧基末端加成了液胞转移信号肽的杂化蛋白质称为液胞型(Vac)的杂化蛋白质，将编码该液胞型的杂化蛋白质的DNA构建物称为液胞型的DNA构建物。
[0105]本发明的杂化蛋白质可以化学合成也可以通过基因工程生产。通过基因工程生产的方法如后所述。
[0106]本发明的DNA构建物，其特征在于，含有编码本发明的杂化蛋白质的DNA。
[0107]即，本发明的DNA构建物含有这样的DNA，所述DNA由2个或3个编码细菌毒素蛋白质的DNA介由编码上述肽的DNA而串联连接而得。编码上述肽的DNA例如如序列号I(PG12)、序列号81 (PG17)、序列号83(PG22)所示。编码细菌毒素蛋白质的DNA例如有编码Stx2eA的DNA (序列号3)、编码Stx2eB的DNA (序列号5)或编码CTB的DNA (序列号7)。编码上述肽的DNA与编码细菌毒素蛋白质的DNA除终止密码子外将阅读框也一并连接。
[0108]编码细菌毒素蛋白质的DNA例如可以基于序列号3、5、7的喊基序列通过一般的基因工程的方法获得。具体而言，由生产各细菌毒素的细菌依常规方法配制cDNA库(9 4 7'7 U —)、使用基于上述碱基序列由该库制作的探针选择希望的无性繁殖系。此外，可以通过以上述碱基序列为基础的化学合成、以上述碱基序列的5’和3’末端的碱基序列为引物、以染色体组DNA为模型的PCR等来合成。
[0109]编码本发明的杂化蛋白质的DNA例如如序列号9、11、13、15、85、87、89、91、93、95、97或99所示。
[0110]编码杂化蛋白质的DNA优选，根据生产该蛋白质的宿主细胞，为了增大杂化蛋白质的翻译量，适宜改变构成杂化蛋白质的氨基酸的密码子。
[0111]改变密码子的方法例如可以参考Kang等(2004)的方法。此外，还可以例举宿主细胞中选择使用频率高的密码子、选择GC含量高的密码子，在宿主细胞的日常管理基因中选择使用频率高的密码子的方法。
[0112] 此外，编码杂化蛋白质的DNA可以是具有序列号9、11、13、15、85、87、89、91、93、95,97或99的碱基序列的DNA和在严格条件下杂化的DNA。“严格条件”是指形成所谓的特异混合而不形成非特异混合的条件。例如，同一性高的两个DNA之间，优选具有80%以上、进一步优选90%以上、特别优选95%以上的同一性的2个DNA进行杂化而同一性比它们低的2个DNA不进行杂化的条件。例如可以例举2XSSC (330mM NaCl、30mM柠檬酸)、42°C，优选 0.1XSSC (330mM NaCl、30mM 柠檬酸)、60°C。
[0113]本发明的DNA构建物中，优选编码上述杂化蛋白质的DNA与增强子可表达地连接。这里，“可表达”是指，本发明的DNA构建物被插入含有适宜启动子的载体中、该载体被导入合适的宿主细胞时，在宿主细胞内生产上述杂化蛋白质。此外，“连接”的概念包括2个DNA直接结合以及介由其他的碱基序列结合。
[0114]增强子可以例举Kozak序列或来自植物的醇脱氢酶基因的5’-非翻译区。特别优选编码上述杂化蛋白质的DNA与来自植物的醇脱氢酶基因的5’ -非翻译区可表达地连接。
[0115]醇脱氢酶基因的5’ -非翻译区是指包括从编码醇脱氢酶的基因的转录开始点到翻译开始点(ATG、蛋氨酸)前为止的碱基序列的区域。该区域具有翻译量增大功能。“翻译量增大功能”是指被结构基因编码的信息在转录后、被翻译产生蛋白质时，使通过翻译产生的蛋白质量增大的功能。上述区域可以来自植物，优选属于爺科(Solanaceae)、十字花科(Brassicaceae)、菊科(Asteraceae)的植物,更优选属于烟草属(Nicotiana)、拟南芥属(Arabidopsis)、莴苣属(Lactuca)等的植物，进一步优选来自烟草(Nicotiana tabacum)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、莴苣(Lactuca sativa)等。
[0116]上述醇脱氢酶基因的5’-非翻译区特别优选例如来自烟草(Nicotiana tabacum)的醇脱氢酶基因的5’ -非翻译区(NtADH5' UTR)、由序列号23所示的碱基序列构成的区域。
[0117]来自植物的醇脱氢酶基因的5’ -非翻译区例如可以从高表达醇脱氢酶的植物培养细胞的醇脱氢酶基因中分离(参照日本专利特开2003-79372号公报)。此外，关于烟草的醇脱氢酶基因的5’ -非翻译区等、其碱基序列确定的物质，可以通过化学合成或以该区域的5’和3’末端的碱基序列为引物、以染色体组DNA为模型的PCR等合成。此外，可以通过以碱基序列确定的上述区域的一部分作为探针、探索其他植物的醇脱氢酶基因的5’ -非翻译区、将其分离。
[0118]此外，如序列号23的碱基序列所示的上述醇脱氢酶基因的5’ -非翻译区，只要保持翻译量增大功能，也可以有I或数个碱基的取代、缺失、插入或加成。上述“数个”优选2~10个、更优选2~5个、特别优选2~3个。
[0119]此外，也可以使用与上述醇脱氢酶基因的5’ -非翻译区具有85%以上、特别优选90%以上的同一性、且保持翻译量增大功能的DNA。
[0120]上述区域是否具有作为目的的翻译量增大功能，可以通过例如在烟草培养细胞中以⑶S ( β -葡糖醛酸酶)基因或荧光素酶基因为报告基因的过渡相试验、通过编入染色体的转染细胞的分析等确认。
[0121]本发明的DNA构建物具有例如，序列号24~29、序列号101~111任意一项所示的碱基序列。
[0122]具有序列号24所示碱基序列的DNA构建物是在来自烟草的醇脱氢酶基因的5 ’ -非翻译区(NtADH5 ’ UTR、序列号23 )上连接了下述DNA (序列号9 )的DNA构建物，所述DNA (序列号9)是编码介由PG12串联连接2个Stx2eB蛋白质的杂化蛋白质的DNA。此外，具有序列号25所示的碱基序列的DNA构建物是在NtADH5丨UTR上连接了下述DNA (序列号11)的DNA构建物，所述DNA (序列号11)是编码介由PG12串联连接2个CTB蛋白质的杂化蛋白质的DNA。
[0123]具有序列号26所示的碱基序列的DNA构建物是在NtADH5丨UTR上连接下述DNA的DNA构建物，所述DNA是编码介由PG12串联连接2个Stx2eB蛋白质且在氨基末端加成分泌信号肽在羧基末端加成内质网残留信号肽的杂化蛋白质的DNA。此外，具有序列号27所示的碱基序列的DNA构建物是在NtADH5丨UTR上连接下述DNA的DNA构建物，所述DNA是编码介由PG12串联连接2个CTB蛋白质且在氨基末端加成分泌信号肽在羧基末端加成内质网残留信号肽的杂化蛋白质的DNA。
[0124]具有序列号28所示的碱基序列的DNA构建物是在NtADH5丨UTR上连接下述DNA的DNA构建物，所述DNA是编码介由PG12串联连接2个Stx2eB蛋白质、且在氨基末端加成分泌信号肽、在羧基末端连接PG12、进而在羧基末端加成内质网残留信号肽的杂化蛋白质的DNA。此外，具有序列号29所示的碱基序列的DNA构建物是在NtADH5' UTR上连接下述DNA的DNA构建物，所述DNA是编码介由PG12串联连接2个CTB蛋白质且在氨基末端加成分泌信号肽、在羧基末端连接PG12、进而在羧基末端加成内质网残留信号肽的杂化蛋白质的 DNA。
[0125]具有序列号101所示碱基序列的DNA构建物是在NtADH5丨UTR上连接下述DNA的DNA构建物，所述DNA是编码介由PG12串联连接2个Stx2eB蛋白质且在羧基末端连接PG12的杂化蛋白质的DNA。
[0126]具有序列号102所示碱基序列的DNA构建物是在NtADH5 ' UTR上连接下述DNA的DNA构建物，所述DNA是编码介由PG17串联连接2个Stx2eB蛋白质且在羧基末端连接PG12、在氨基末端加成分泌信号肽、进而在羧基末端加成内质网残留信号肽的杂化蛋白质的DNA。此外，具有序列号103所示的碱基序列的DNA构建物是在NtADH5丨UTR上连接下述DNA的DNA构建物，所述DNA是编码介由PG22串联连接2个Stx2eB蛋白质、且在氨基末端加成分泌信号肽、在羧基末端连接PG12、进而在羧基末端加成内质网残留信号肽的杂化蛋白质的DNA。
[0127]具有序列号104所示的碱基序列的DNA构建物是在NtADH5' UTR上连接下述DNA的DNA构建物，所述DNA是编码介由PG12串联连接2个Stx2eB蛋白质、且在氨基末端加成叶绿体转移信号肽、在羧基末端连接PG12的杂化蛋白质的DNA。
[0128]具有序列号105所示的碱基序列的DNA构建物是在NtADH5' UTR上连接下述DNA的DNA构建物，所述DNA是编码分别介由PG12串联连接3个Stx2eB蛋白质且在羧基末端连接PG12的杂化蛋白质的DNA。
[0129]具有序列号106所示的碱基序列的DNA构建物是在NtADH5' UTR上连接下述DNA的DNA构建物，所述DNA 是编码分别介由PG12串联连接3个Stx2eB蛋白质、且在氨基末端加成分泌信号肽、在羧基末端连接PG12、进而在羧基末端加成内质网残留信号肽的杂化蛋白质的DNA。
[0130] 具有序列号107所示的碱基序列的DNA构建物是在NtADH5' UTR上连接下述DNA的DNA构建物，所述DNA是编码分别介由PG12串联连接3个Stx2eB蛋白质、且在氨基末端加成叶绿体转移信号肽、在羧基末端连接PG12的杂化蛋白质的DNA。
[0131 ] 具有序列号108所示的碱基序列的DNA构建物是在NtADH5' UTR上连接下述DNA的DNA构建物，所述DNA是编码介由PG12串联连接2个CTB蛋白质、且在羧基末端连接PG12的杂化蛋白质的DNA。
[0132]具有序列号109所示的碱基序列的DNA构建物是在NtADH5丨UTR上连接下述DNA的DNA构建物，所述DNA是编码介由PG17串联连接2个CTB蛋白质、且在氨基末端加成信号肽、在羧基末端连接PG12、进而在羧基末端加成内质网残留信号肽的杂化蛋白质的DNA。此外，具有序列号110所示的碱基序列的DNA构建物是在NtADH5' UTR上介由PG22串联连接2个CTB蛋白质、且在氨基末端加成信号肽、在羧基末端连接PG12、进而在羧基末端加成内质网残留信号肽的杂化蛋白质的DNA。
[0133]具有序列号111所示的碱基序列的DNA构建物是在NtADH5丨UTR上连接下述DNA的DNA构建物，所述DNA是编码介由PG12串联连接2个CTB蛋白质、且在氨基末端加成叶绿体转移信号肽、在羧基末端连接PG12的杂化蛋白质的DNA。
[0134]本发明的DNA构建物可以通过一般的基因工程方法制作，通过用适当的限制酶分别将来自植物的醇脱氢酶基因的5’-非翻译区、编码来自植物的分泌信号肽的DNA、编码叶绿体转移信号肽的DNA和编码细菌毒素蛋白质的DNA、编码内质网残留信号肽的DNA等各DNA切断、用适当的连接酶连接来建构。
[0135]本发明的重组载体的特征是含有本发明的DNA构建物。本发明的重组载体中，为了能够在载体被导入的宿主细胞 中表达，编码本发明的杂化蛋白质的DNA可以插入载体内。载体只要能够在宿主细胞中复制则无特别限制，例如，质粒DNA、病毒DNA等。此外，载体优选含有耐药性基因等选择标记。质粒DNA可以通过碱提取法(Birnboim, H.C.&Doly, J.(1979)Nucleic acid Res 7:1513)或其变法等从大肠杆菌或土壤杆菌属配制。此外，市售的质粒可以使用例如pBI221、pBI121、pBIlOl、pIG121Hm等。病毒DNA可以使用例如pTB2 (Donson 等，1"1)等(参照 Donson J., Kerney CM., Hilf ME., Dawson W0.Systemicexpression of a bacterial gene by a tobacco mosaic virus-based vector.Proc.Natl.Acad.Sc1.(1991)88:7204-7208。)
[0136]载体内使用的启动子可以根据导入载体的宿主细胞适宜选择。优选使用例如花椰菜花叶病毒35S启动子(Odell等.1985 Nature 313:810)、稻的肌纤蛋白启动子(Zhang等.1991Plant Cell 3:1155)、玉米的泛素启动子(Cornejo 等.1993 Plant Mol.Biol.23:567)等。此外，载体内使用的终止子同样地也可以根据导入载体的宿主细胞适宜选择。优选使用例如，蓝曙红(胆脂碱，胭脂碱)合成酶基因转录终止子、花椰菜花叶病毒35S终止子等。
[0137]本发明的重组载体可以例如以下制作。
[0138]首先，用适当的制限酶切断本发明的DNA构建物或用PCR加成制限酶部位、插入到载体的制限酶部位或多克隆位点。
[0139]本发明的转染子的特征是，被本发明的重组载体转染。转染使用的宿主细胞可以是真核细胞和原核细胞的任一种。
[0140]真核细胞优选使用植物细胞,其中优选使用属于菊科(Asteraceae )、爺科、十字花科、藜科的植物的细胞。进而优选使用莴苣属(Lactuca)植物的细胞、其中优选使用莴苣(Lactuca sativa)细胞。使用莴苣细胞作为宿主细胞时，载体可以使用花椰菜花叶病毒35SRNA启动子等。
[0141]原核细胞可以使用大肠杆菌(Escherichia coli)、土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)等。
[0142]本发明的转染子可以通过使用一般的基因工程手法将本发明的载体导入宿主细胞来制作。例如，可以使用利用了土壤杆菌的导入方法(Hood，等,1993, Transgenic, Res.2:218, Hiei,等，1994 Plant J.6:271 )、电穿孔法(Tada,等，1990，Theor.Appl.Genet, 80:475)、聚乙烯醇法(Lazzeri,等，1991，Theor.Appl.Genet.81:437)、粒子枪法(Particle Gun) (Sanford,等,1987, J.Part.Sc1.tech.5:27)、聚阳离子法(Ohtsuki)等方法。
[0143]将本发明的载体导入宿主细胞后，可以根据选择标记的表现型选拔本发明的转染子。此外，可以通过培养选拔的转染子生产上述细菌毒素蛋白质。用于培养的培养基和条件可以根据转染子的种类适宜选择。
[0144]此外，宿主细胞是植物细胞时，通过依常规方法培养选拔的植物细胞可以使植物体再生，可以在植物细胞内或植物细胞的细胞膜外蓄积上述细菌毒素蛋白质。例如，虽然也会由于植物细胞的种类有所不同，马铃薯的话可以例举Visser等(Theor.Appl.Genet78:594 (1989))的方法、烟 草的话可以例举Nagata和Takebe (Planta 99:12 (1971))的方法。
[0145]莴苣的情况下，用含有0.lmg/1的NAA(萘乙酸)、0.05mg/l的BA (苄基腺嘌呤)以及0.5g/l的聚乙烯吡咯烷酮的MS培养基能够实现花茎('> Λ —卜)的再生、用含有0.5g/I聚乙烯吡咯烷酮的1/2MS培养基培养再生的花茎('> 二一卜)可以生根。
[0146]此外，本发明的种子可以与上述一样从再生的植物体中采取种子来获得。通过用适当的方法播种栽培本发明的种子，可以成为生产上述细菌毒素蛋白质的植物体，这样的植物体也包含在本发明的转染子中。
[0147]【实施例】
[0148]< I >一时性表达实验
[0149](l)Stx2eB —时性表达载体的构建
[0150]如下制作含有编码Stx2e蛋白质的B亚单位(Stx2eB)的DNA (序列号5)连接在烟草醇脱氢酶基因的5'非翻译区(NtADH5' UTR)的DNA构建物的载体。
[0151]载体的图案如图1所示。
[0152]I X Stx2eB (PG12)表示含有编码Stx2eB的DNA上连接有编码PG12的DNA的DNA的DNA构建物。2XStx2eB(PG12)表示含有以编码PG12的DNA作为隔离物连接2个编码Stx2eB的DNA的DNA的DNA构建物。
[0153]此外，也制作以编码PG12的DNA作为隔离物连接3个编码Stx2eB的DNA的DNA构建物、即3XStx2eB(PG12)，以及以编码PG12的DNA作为隔离物连接4个编码Stx2eB的DNA 的 DNA 构建物、即 4XStx2eB (PG12)。[0154]具体方法如下所示。
[0155]使用Kozak-stx2eb-F引物(序列号30)和stx2eb_R引物(序列号31)进行PCR,扩增编码Stx2eB的成熟区域(除朝向胞质(细菌细胞壁和内膜之间的间隙)的分泌信号肽、Alal9~Asn87)的DNA片段。将得到的DNA片段克隆到pBluescript II SK的EcoRV间隙。用HindIII切断得到的质粒、用T4DNA聚合物酶处理后进行自我连接、将HindIII位点变换为NheI位点(质粒I)。
[0156]如下所示将Stx2eB插入到植物细胞的一时性表达用载体、pBI221 (Clontech社)的多克隆位点(MCS)。
[0157]为了在MCS中导入Sail、KpnI和SmaI位点，克隆SalKpnSma-F (序列号32)和SalKpnSma-R (序列号33)后，使用T4多聚核苷酸激酶(T4PNK) (TaKaRa社)磷酸化，插入PBI221的SacI间隙(质粒2)。用XbaI和KpnI从Plasmidl切出Stx2eB片段、插入质粒2、配置在花椰菜花叶病毒35S RNA启动子(35S pr0.)和蓝曙红合成酶基因转录终止子(NOS-T)之间(质粒3)。
[0158]通过使用ADH Xba1-F引物(序列号34)和ADH Nsi1-R引物(序列号35)的PCR,以ADH-221(Sato等，2004 (参照下述))为模型，对烟草醇脱氢酶基因的5 '非翻译区(NtADH5，UTR、序列号23)进行扩增。使用β? Nsi1-F引物(序列号36)和β? BamH1-R引物(序列号37)，以烟草染色体组DNA为模型，对编码β-D葡聚糖外水解酶(GenBankACCESSION AB017502)的分泌信号肽(序列号18)的DNA区域(序列号17)进行扩增。用NsiI (Τ0Υ0Β0社制)处理得到的NtADH 5 ' UTR和分泌信号肽的各DNA片段，使用高效连接试剂盒(Ligation High, Τ0Υ0Β0社)连接后，使末端平滑化,在pBluescript IISK(Stratagene社制)的EcoRV间隙中克隆(质粒4)。
[0159]Satoh 等,The5 ' -untranslated region of the tobacco alcoholdehydrogenase gene functions as an effective translational enhancer in plant.J.Biosc1.Bioeng.(2004)98，1-8
[0160]用NsiI处理质粒4，用T4DNA聚合物酶(Τ0Υ0Β0社制)使末端平滑化后，自我连接，连接成NtADH的开始密码子(atg)与分泌信号肽的开始密码子一致(质粒5)。
[0161]用ADH Xba1-F引物(序列号34)和β D BamH1-R引物(序列号35)，以质粒5为模型，对NtADH 5' UTR片段和分泌信号肽的连接DNA进行扩增。用XbaI和BamHI处理得到的DNA片段、插入质粒3的Xba1-BamHI间隙(质粒6)。
[0162]为了加成内质网残留信号(序列号38)，对HDEL-F引物(序列号39)和HDEL-R引物(序列号40)进行热处理(7 二一 U >々'')，用Τ4ΡΝΚ磷酸化、插入用碱性磷酸酶(AP)(TaKaRa社)脱磷酸化处理后的质粒6的BglII间隙中(质粒7)。
[0163]加成HA标签作为Stx2eB检测用肽标签。为了加成HA标签，对HA-F引物(序列号41)和HA-R引物(序列号42)热处理，用T4 PNK磷酸化。将得到的磷酸化HA片段插入质粒7的BglII间隙中(质粒8)。
[0164]在Stx2eB和HA标签之间插入PG12间隔物(序列号2)。对PG12-F引物(序列号43)和PG12-R引物(序列号44)热处理，用T4 PNK磷酸化。将得到的磷酸化DNA片段插入质粒 8 的 BglII 间隙(lXStx2eB(PG12))。
[0165]用BamHI 和 BglII 从 I X Stx2eB (PG12)中切出 2eB_PG12 片段，插入lXStx2eB(PG12)的 BamHI 间隙(2XStx2eB(PG12))。此外，使用 BamHI 和 BglII从 lXStx2eB(PG12)切出 Stx2eB_PG12 片段、插入 2 X Stx2eB (PG12)的 BamHI 间隙(3XStx2eB(PG12))。此外，使用 BamHI 和 BglII 从 2XStx2eB(PG12)中切出2X (Stx2eB-PG12)片段，插入 2XStx2eB(PG12)的 BamHI 间隙(4XStx2eB(PG12))。
[0166](2) CTB —时性表达载体的构建
[0167]如下制作含有编码CT蛋白质的B亚单位(CTB)的DNA连接在烟草醇脱氢酶基因的5'非翻译区的DNA构建物(2XCTB(PG12))的载体。
[0168]制作编码CTB的成熟区域(除朝向胞质(细菌细胞壁和内膜之间的间隙)的分泌信号肽、Thr22~Asnl24)(序列号8)的DNA(序列号7)。首先，制作以下的10种引物。
[0169]CTBl:序列号 45
[0170]CTB2:序列号 46
[0171]CTB3:序列号 47
[0172]CTB4:序列号 48
[0173]CTB5:序列号 49
[0174]CTB6:序列号 50
[0175]CTB7:序列号 51
[0176]CTB8:序列号 52
[0177]CTB9:序列号 53
[0178]CTBlO:序列号 54
[0179]使用上述合成的引物，在Kang等(2004)记载的条件下，进行PCR。即，以CTBl和CTB2、CTB3 和 CTB4、CTB5 和 CTB6、CTB7 和 CTB8、CTB9 和 CTBlO 的组合进行 PCR，分别合成72bp (I + 2)、74bp (3 + 4)、67bp (5 + 6)、82bp (7 + 8)、68bp (9 + 10)的 DNA 片段。接着，以 CTBl + 2 和 CTB3 + 4、CTB3 + 4 和 CTB5 + 6、CTB5 + 6 和 CTB7 + 8、CTB7 + 8 和CTB9 + 10 的组合进行第二次 PCR，合成 135bp (I + 2 + 3 + 4)、132bp (3 + 4 + 5 + 6),138bp (5 + 6 + 7 + 8)和 141bp (7 + 8 + 9 + 10)的 DNA 片段。接着，以 CTBl + 2 +3 十 4 和 CTB3 + 4 + 5 + 6、以及 CTB5 + 6 + 7 + 8 和 CTB7 + 8 + 9 + 10 的组合进行第三次 PCR，合成 194bp (1 + 2 + 3 + 4 + 5 +6)和 198bp (5 + 6 + 7 + 8 + 9 + 10)的DNA 片段。最后，以 CTBl + 2 + 3 + 4 + 5 + 6 和 CTB5 + 6 + 7 + 8 + 9+10 的组合进行PCR，合成在315bp的CTB编码区域加成BamHI位点和BglII位点的DNA片段。
[0180]用BamHI和BglII处理如上制作的DNA片段，插入质粒8的BamH1-BglII间隙(质粒9)。
[0181]CTB和HA标签之间插入PG12间隔物(序列号2)。对PG12-F引物(序列号43)和PG12-R引物(序列号44)进行热处理，用T4PNK磷酸化。将得到的磷酸化DNA片段插入质粒 9 的 BglII 间隙(I X CTB (PG12))0
[0182]使用BamHI 和 BglII 从 1XCTB(PG12)切出 CTB-PG12 片段，插入 IXCTB(PG12)的BamHI 间隙(2 X CTB (PG12))。
[0183](3)使用了莴苣原生质体的一时性表达实验
[0184]将种植在鉢中的莴苣(Lactuca sativa) (green web ； ^ 'J 一 >々工一 7'')的叶约Ig用手术刀切成0.5cm四方程度，制作叶盘。将叶盘浸溃在500mM甘露醇中，振荡I小时。将叶盘浸溃在50ml的原生质体化酶溶液(1.0%纤维素RS( Y々 > 卜本社)、0.25%离析酶R-1O ( ^ ^ 卜本社)、400mM 甘露醇、8禮 CaCl2JP5IiiM Mes-KOH, pH5.6)中，室温下振荡 2小时。使原生质体悬浊液通过100 μ m和40 μ m的筛孔，除去叶盘。60g原生质体悬浊液离心
5分钟，使原生质体沉淀。在含有167mM甘露醇和133mM CaCl2的水溶液中再悬浊原生质体、取40g离心5分钟。在含有333mM甘露醇和66.7mM CaCl2的水溶液中再悬浊原生质体、取40g 离心 5 分钟。在 W5 溶液(154mM NaCl, 125mM CaCl2, 5mM KCl, 2mM Mes-KOH, pH5.6)中悬浊原生质体、在冰上静置I小时。对原生质体悬浊液40g离心5分钟，在MaMg溶液(400mM甘露醇，15mM MgCl2,和4mM Mes-KOH, ρΗ5.6)中悬浊，使原生质体浓度为2X IO6个/ml。
[0185]使如上制作的各Stx2eB—时性表达载体、CTB —时性表达载体分别与120 μ I的原生质体悬浊液混合后，加入140 μ I的PEG溶液(400mM甘露醇，IOOmM Ca (NO3) 2和40%PEG)，慢慢混和，恒温7分钟。用约20分钟添加Iml的W5溶液到原生质体悬浊液中。在通过离心沉淀的原生质体中，添加Iml以4:1的比例混合400mM甘露醇和W5溶液得到的溶液。在通过离心沉淀的原生质体添加含有1%蔗糖、400mM甘露醇和0.3mM羧苄西林的LS培养基lml，在暗处25°C下培养24小时。
[0186](4)韦斯登解析(western analysis)
[0187]在通过离心回收的原生质体中加入30 μ I的SDS-样品缓冲液(4%(w/v)SDS, 20%(w/v)丙三醇，0.05%(w/v)溴酚蓝，300mM β -巯基乙醇，125mM Tris-HCl, pH6.8)，在95°C下热改性2分钟，作为试样。使用15%丙烯酰胺凝胶分离蛋白质后，使用电转移装置在PVDF膜(Hybond-P;Amersham社)上印迹(blot)蛋白质。使用抗HA抗体(N0.11 867423 001，Roche)检测 Stx2eB 和 CTB。
[0188](a) Stx2eB的连接数的影响
[0189]结果如图2所示。·
[0190]当表达I X Stx2eB (PG12)时，在约8.5kDa的位置检测到信号。当表达2XStx2eB(PG12)时，在约17kDa的位置检测到与表达I XStx2eB(PG12)时同程度的信号。当表达3XStx2eB(PG12)时，在约26kDa的位置检测到比表达I X Stx2eB (PG12)时小的信号。它们都和从DNA构建物的图案推定的分子量一致。此外，当表达4XStx2eB(PG12)时，特异的信号在检测限以下。
[0191]从以上结果可知，当表达2XStx2eB(PG12)和3XStx2eB(PG12)时，可以生产连接多个Stx2eB蛋白质的杂化蛋白质。
[0192]此外，上述各DNA构建物由于各含有I分子HA标签(参照图1)，在表达2XStx2eB (PG12)时，蓄积了相当于表达I X Stx2eB (PG12)时的约2倍的Stx2eB蛋白质的蛋白质。即，介由编码PG12的DNA连接2个编码Stx2eB蛋白质的DNA时，可以非常高效地生产Stx2eB蛋白质。
[0193]另一方面，可知，介由编码PGl2的DNA连接3个编码Stx2eB蛋白质的DNA和4个编码Stx2eB蛋白质的DNA时，Stx2eB蛋白质的生产在I个Stx2eB蛋白质的同等以下。
[0194]本实验中作制的在羧基末端加成PG12的Stx2eB蛋白质(lXStx2eB(PG12))与没有加成PG12的Stx2eB蛋白质相比，蛋白质的蓄积水平由增高的趋势。由此，推测本发明的杂化蛋白质的优选形态是在羧基末端加成了 PG12。
[0195](b) CTB的连接数的影响[0196]结果如图3所示。
[0197]表达1XCTB(PG12)时，在约20kDa的位置上检测到信号。表达2XCTB(PG12)时，在约33kDa和约35kDa的位置上检测到比表达I X CTB (PG12)时更大的信号。
[0198]从以上的结果可知，表达2XCTB(PG12)的话，可以生产连接2个CTB蛋白质的杂化蛋白质。这些均与从DNA构建物的图案推定的分子量一致。
[0199]此外，上述各DNA构建物由于含有HA标签各I分子，当表达2XCTB(PG12)时，蓄积了相当于大于表达1XCTB(PG12)时的2倍的CTB蛋白质的蛋白质。即，介由编码PG12的DNA连接2个编码CTB蛋白质的DNA时，可以非常高效地生产CTB蛋白质。
[0200](5) Stx2eB的局部存在解析
[0201]为了解析细胞中的Stx2eB的局部存在，制作Stx2eB和黄色荧光蛋白质YFP的杂化蛋白质的一时性表达载体。载体的图案如图4所示。lXStx2eB(PG12)-YFP表示I个编码Stx2eB蛋白质的DNA和编码YFP的DNA连接的DNA构建物。2 X Stx2eB (PG12) -YFP表示编码2个Stx2eB蛋白质介由PG12而连接的杂化蛋白质的DNA与编码YFP的DNA相连接的DNA构建物。此外，使用RS(Arg Ser)代替PG12作为间隔物的2XStx2eB(RS)_YFP。以下表示具体的手法。
[0202]首先，通过以pEYFP (Clontech)为模型、使用YFP-F引物(序列号55)和YFP-R引物(序列号56)的PCR，对YFP的DNA片段进行扩增。用BamHI和BglII处理得到的DNA片段，插入质粒8的BamH1-BglII间隙(ER-YFP)。
[0203]使用BamHI和 BglII从质粒I切出Stx2eB片段，插入上述I X Stx2eB (PG12)的BamHI 间隙(2 X Stx2eB (RS))。
[0204]使用BamH1-BglII 从 I XStx2eB(PG12)、2XStx2eB(RS)和 2XStx2eB(PG12)中分别切出5七乂268-?612片段、2父(Stx2eB-RS)片段和2X (Stx2eB_PG12)片段，插入ER-YFP的BamHI 间隙(I X Stx2eB (PG12) _YFP、2 X Stx2eB (RS)-YFP 和 2 X Stx2eB (PG12)-YFP)。
[0205]另一方面，作为使内质网可视化的载体，制作内质网局部存在型的红色荧光蛋白质(mRFP、Campbell R.E.等(2002)(参照下述))的表达载体。使用mRFP_F引物(序列号57)和mRFP-R引物(序列号58)进行PCR0用BamHI和BglII处理得到的DNA片段，插入质粒 8 的 BamH1-BglII 间隙(ER-mRFP)。
[0206]Campbell R.E.等，A monomeric red fluorescent protein(2002)Proc.Nat.Acad.Sc1.99:7877-7882
[0207]与上述方法同样将上述Stx2eB的表达载体与mRFP表达载体导入烟草培养细胞(BY2)的原生质体，用共焦显微镜观察(LSM510，Zeiss)进行观察。
[0208]结果示于图5和6。
[0209]图5表示Stx2eB_YFP杂化蛋白质的局部存在。表达2XStx2eB(PG12)-YFP时，观察到Stx2eB-YFP杂化蛋白质以100个/细胞程度、颗粒状局部存在。表达lXStx2eB (PG12)-YFP 和 2X Stx2eB (RS)-YFP 时，没有观察到颗粒。
[0210]图6中，最左列的图象A表示某原生质体的mRFP的局部存在。mRFP的局部存在反映了内质网的位置。中列的图象B表示同一原生质体中的Stx2eB-YFP杂化蛋白质的局部存在。最右列的图象是图象A和B的合成图象。从合成图象可以判断出Stx2eB-YFP杂化蛋白质在内质网以颗粒状局部存在。[0211](6)小胞输送功能的影响
[0212]调查2XStx2eB(PG12)的蓄积和凝集在蛋白质翻译后的哪个过程中发生。
[0213]使2XStx2eB(PG12)_YFP与拟南芥的小胞输送调节蛋白质ARFl或其显性失活突变体ARFl (Q71L) (ARFlDN)共表达。此外，通过ARFlDN的共表达，作为阻碍向高尔基体输送蛋白质的报告子，进行液胞型GFP (vacuole-GFP)和各ARFl的共表达。各ARFl的表达载体的构建如下进行。此外，液胞型GFP表达载体的制作可以参考下述文献进行。
[0214]Di Sansebastiano 等,Specific accumulation of GFP in a non-acidicvacuolar compartment via a C—terminal propeptide-mediated sorting pathway.PlantJ.(1998) 15，449-457
[0215]构建拟南芥ARFl (GenBank Accession N0.M95166)和其显性失活突变体ARFl (Q71L) (Masaki Takeuchi等，2002 (参照下述))的表达载体作为小胞输送调节蛋白质。以从拟南芥幼植物体配制的cDNA为模型，使用ARFl-F引物(序列号59)和ARFl-R引物(序列号60)进行PCR。将得到的DNA片段亚克隆到pBluescript (Stratagene)的EcoRV间隙。此外，使用ARFQL-F引物(序列号61)和ARFQL-R引物(序列号62)进行PCR,第71号的谷氨酰胺残基被取代为白氨酸残基。将得到的各ARFl片段亚克隆到一时性表达用载体 PBI221 中。
[0216]将制作的各载体按照与上述同样的方法导入烟草培养细胞的原生质体，共表达各蛋白质，调查2XStx2eB(PG12)的局部存在。
[0217]结果如图7所示。
[0218]2XStx2eB(PG12)-YFP与ARFl共表达时和与ARF1(Q71L)共表达时，都和单独表达2XStx2eB(PG12)-YFP时一样观察到颗粒。另一方面，与ARF(Q711)的共表达阻碍液胞型GFP从内质网移出。由此，推测颗粒的形成不依赖于从内质网向高尔基体的小胞输送过程。
[0219]< 2 >使用了烟草培养细胞的转染实验
[0220](I)转染用载体的构建
[0221]与上述同样，制作lXStx2eB(PG12)、2XStx2eB(PG12)、3XStx2eB(PG12)、4XStx2eB (PG12)。
[0222]进而，按照以下方法制作使用RS(Arg Ser)、PG7 (序列号63)或SG12(序列号64)代替PG12作为间隔物的DNA构建物，即2XStx2eB (RS)、2X Stx2eB (PG7)、2XStx2eB(SG12)。
[0223]在上述质粒8的Stx2eB和HA标签之间插入PG7间隔物(序列号63)。对PG7-F引物(序列号65)和PG7-R引物(序列号66)进行热处理，用T4PNK磷酸化。得到的磷酸化DNA片段插入质粒8的BglII间隙(质粒10)。`
[0224]此外，在Stx2eB和HA标签之间插入SG12间隔物(序列号64)。对SG12-F引物(序列号67)和SG12-R引物(序列号68)进行热处理，用T4PNK磷酸化。将得到的磷酸化DNA片段插入质粒8的BglII间隙(质粒11)。
[0225]使用BamHI 和 BglII 从质粒 I 切出 Stx2eB 片段，插入 I X Stx2eB (PG12)的 BamHI间隙(2X Stx2eB (RS))。使用BamHI和BglII从质粒10切出Stx2eB_PG7片段，插入!XStx2eB(PG12)的 BamHI 间隙(2XStx2eB(PG7))。使用 BamHI 和 BglII 从质粒 11 切出Stx2eB-SG12 片段，插入 I X Stx2eB (PG12)的 BamHI 间隙(2 X Stx2eB (SG12))。
[0226]为了使用植物的稳定转染子进行Stx2eB的生产，将上述各Stx2eB的DNA构建物亚克隆到转染用载体(载体的图案参考图1)。使用XbaI和SacI将lXStx2eB(PG12)、2XStx2eB (PG12)、3XStx2eB (PG12)、4X Stx2eB (PG12)、2XStx2eB (RS)、2XStx2eB (PG7)和2XStx2eB(SG12)插入pBI121 (Clontech社)，配置在花椰菜花叶病毒35S RNA启动子(35S pr0.)和蓝曙红合成酶基因转录终止子(NOS-T)之间。
[0227](2)烟草培养细胞的转染
[0228]用电穿孔法将制作的转染用载体导入土壤杆菌(Agrobacterium tumefacienceEHA105)。将含有卡那霉素100mg/l的5ml的LB培养基中在28°C下培养2晚的土壤杆菌培养液100 μ I和培养了第4日的烟草培养细胞(Nicotiana tabacum, cv BY2)的悬池液5~IOml放入浅底盘中混合，25°C下在暗处静置2晚，共存培养。为了除去土壤杆菌，将浅底盘中的培养液移入15ml的离心管离心(lOOOrpm，5分钟，4°C )，除去上清液。放入改变LS培养基中离心分离(lOOOrpm，5分钟，4°C )，清洗细胞。重复4次该清洗操作，除去土壤杆菌。将残留的BY2细胞置于放入了卡那霉素(100mg/l)的改变LS琼脂培养基中，25°C黑暗中静置培养。约2-3周后，将愈伤组织化的细胞移植到新的盘中，选择增殖的克隆。
[0229](3)使用韦斯登解析(western analysis)的Stx2eB蛋白质的半定量
[0230]将用平板培养基培养的烟草培养细胞回收到离心管中，相对于细胞的重量Img添加I μ I的SDS-样品缓冲液。95°C下热改性2分钟作为电泳用的试样。使用15%丙烯酰胺凝胶分离蛋白质后，使用电转移装置在PVDF膜(Hybond-P;Amersham)上印迹(blot)蛋白质。用抗HA抗体(N0.11867423001，Roche)检测Stx2eB蛋白质。制作浓度已知的带HA标签的Stx2eB的稀释系列，装在凝胶上，制作以信号强度为基准的标准曲线，计算各样品中的Stx2eB蛋白质量。
[0231]结果如下所 示。
[0232](a) Stx2eB的连接数的影响
[0233]结果如图8和9所示。
[0234]表达lXStx2eB(PG12)时，在约IOkDa和约17kDa的位置检测到信号。推定分别为信号肽被切断的Stx2eB和信号肽未被切断的Stx2eB。表达2XStx2eB(PG12)时，在约19kDa的位置检测到与表达lXStx2eB(PG12)时同程度的信号。表达3X Stx2eB (PG12)时，在约26kDa的位置检测到小于表达lXStx2eB(PG12)时的信号。都与从DNA构建物的图案推定的分子量一致。此外，表达4XStx2eB(PG12)时特异的信号在检测限以下(数据未公开)。
[0235]由此可知，比起lXStx2eB (PG12)和 3 X Stx2eB (PG12)，2 X Stx2eB (PG12)蓄积的Stx2eB 高。
[0236](b)间隔物的影响
[0237]结果如图10和图11所示。
[0238]从Stx2eB对应的信号强度可知，Stx2eB的蓄积水平在使用PG12作为间隔物时最多。次之，使用PG7和SG12时一样多。此外，使用RS时最少。由此可知，2个Stx2eB之间的间隔物的长度和氨基酸序列对2XStx2eB蛋白质的蓄积水平有影响。
[0239](4)使用实时PCR的mRNA定量[0240]调查蛋白质的蓄积水平是否受到转录水平的影响。
[0241]使用RN简易迷你试剂盒(RNeasy Mini Kit) (Qiagen)从上述得到的各转染BY2细胞配制RNA。进行DN酶(DNase)处理、使用逆转录酶(Transcriptor ReverseTranscriptase) (Roche)进行逆转录。使用 SYBR Green PCR Master Mix (AppliedBiosystems)进行实时PCR。Stx2eB mRNA的定量使用在各建构物间通用的序列即对含有NtADH 5' UTR和信号肽的区域进行扩增的引物组(序列号69和序列号70)。使用UBQ-F引物(序列号71)和UBQ-R引物(序列号72)对BY2泛素基因的表达量进行定量，修改stx2eB基因的mRNA水平。lXStx2eB(PG12)mRNA水平通过将定量值取1/2来计算。
[0242]结果如图12所示。
[0243]每个mRNA的Stx2e蛋白质的蓄积水平中，表达2XStx2eB(PG12)的细胞有大于表达2XStx2eB(RS)或I XStx2eB(PG12)的细胞的倾向。由此可知，间隔物的不同不影响转录水平，而影响翻译水平或翻译后的蛋白质的稳定性。此外，将2XStx2eB蛋白质以颗粒状局部存在的结果一并考察的话，间隔物影响翻译后的蛋白质的稳定性。
[0244]< 3 >一时性表达实验
[0245](I) Stx2eB 一时性表达载体的构建
[0246]用上述< I >(1)的方法构建 lXStx2eB(PG12)、2XStx2eB(PG12)、3XStx2eB(PG12)、4XStx2eB(PG12)的一时性表达载体(图13-A)。以下，将这些载体分别称为 ER-lXStx2eB(PG12)、ER-2XStx2eB(PG12)、ER-3XStx2eB(PG12)、ER-4XStx2eB (PG12)。此外，“ER”表示内质网型。
[0247]此外，按照以下的方法构建含有细胞质型(Cyt)的DNA构建物的一时性表达载体(图13-B)、和含有叶绿体型(Chl·)的DNA构建物的表达载体(图13-C)。此外，出于具有与内质网型的杂化蛋白质有尽可能接近的结构的杂化蛋白质这样一个目的，这些DNA构建物被设计成含有编码内质网残留信号肽的DNA。但是，该DNA构建物由于不含编码分泌信号肽的DNA，因此在生产的杂化蛋白质中，内质网残留信号肽不发挥这个功能(蛋白质残留在内质网上)。
[0248]通过使用ADH Xba1-F引物(序列号34)和ADH BamH1-R引物(序列号112)的PCR对NtADH 5 ; UTR片段进行扩增，用XbaI和BamHI处理得到的DNA片段。将NtADH5 ' -UTR 的 Xba1-BamHI 片段插入 ER-1 X Stx2eB (PG12)、ER-2 X Stx2eB (PG12)、ER-3XStx2eB(PG12)和 ER-4XStx2eB(PG12)的各个 Xba1-BamHI 间隙中，制作细胞质型Stx2eB 载体一Cyt-1 X Stx2eB (PG12)、Cyt_2 X Stx2eB (PG12)、Cyt_3 X Stx2eB (PG12)和Cyt-4XStx2eB (PG12)。
[0249]通过使用了 ADH Xba1-F引物(序列号34)和ADH Nsi1-R引物(序列号35)的PCR对NtADH 5’-UTR片段进行扩增。以莴苣叶cDNA为模型，用TP Nsi1-F引物(序列号113)和TP BamH1-R引物(序列号114)通过PCR对编码来自莴苣Rbcs (二磷酸核酮糖氧合酶小亚单位)(GenBank ACCESSION D14001)叶绿体转移信号肽(运输肽、T.P.)的DNA片段(序列号80)进行扩增。用NsiI (Τ0Υ0Β0社制)处理得到的NtADH 5 ' -UTR和分泌信号肽的各DNA片段，用高效连接试剂盒(Ligation High) (T0Y0B0社)连接后，末端平滑化，在 pBluescript II SK(Stratagene 社制)的 EcoRV 间隙克隆(质粒 12)。用 NsiI处理质粒12，在用T4 DNA聚合物酶(Τ0Υ0Β0社制)末端平滑化后自我连接，进行融合以使NtADH的开始密码子和Rbcs的开始密码子一致(质粒13)。用XbaI和BamHI从质粒13切出 NtADH 5' -UTR-T.P.融合片段，插入 ER-1 X Stx2eB (PG12)、ER-2 X Stx2eB (PG12)、ER-3 X Stx2eB (PG12)和 ER-4 X Stx2eB (PG12)的各 Xba1-BamHI 间隙中，制作叶绿体型Stx2eB 载体 Chl-lXStx2eB(PG12)、Chl-2XStx2eB(PG12)、Chl-3XStx2eB(PG12)和Chl-4XStx2eB (PG12)。
[0250](2) CTB —时性表达载体的制作
[0251]用上述< 1>(2)的方法构建1父0^(?612)、2父0^(?612)的一时性表达载体(图14-A)。以下，将这些载体分别称为 ER-1 X CTB (PG12)、ER-2 X CTB (PG12)。
[0252]此外，用以下的方法构建含有细胞质型(Cyt)的DNA构建物的一时性表达载体(图14-B)和含有叶绿体型(Chl)的DNA构建物的表达载体(图14-C)。
[0253]使用BamHI和BglII从ER-1 X CTB (PG12)切出CTB-PG12片段，插入按上述< 3 XI)制作的 Cyt-lXStx2eB(PG12)的 BamH1-BglII 间隙和 Chl-1 XStx2eB(PG12)的BamH1-BglII间隙，制作细胞质型和叶绿体型的1XCTB(PG12) (Cyt_l XCTB(PG12)、Chl-1XCTB (PG12))。
[0254]接着，使用BamHI 和 BglII 从 ER-2XCTB(PG12)切出 2X (CTB-PG12)片段，插入Cyt-lXStx2eB (PG12)的 BamH1-BglII 间隙和 Chl-1 X Stx2eB (PG12)的 BamH1-BglII 间隙，制作细胞质型和叶绿体型的 2XCTB(PG12) (Cyt-2XCTB(PG12)、Chl-2XCTB(PG12))。
[0255](3) 一时性表达实验和韦斯登解析(western analysis) [0256]与上述< I >(3)同样，使用莴苣的原生质体进行一时性表达实验。接着，与< I> (4)同样检测 Stx2eB、CTB0
[0257](a) Stx2eB的连接数的影响
[0258]结果如图15所示。
[0259]表达ER_lXStx2eB(PG12)时，在约IOkDa的位置检测到信号。表达ER-2XStx2eB (PG12)时，在约19kDa的位置检测到比表达ER-1 X Stx2eB (PG12)时大的信号。表达ER-3XStx2eB(PG12)时，在约27kDa的位置检测到比表达ER-1 X Stx2eB (PG12)时大的信号。这些都和从DNA构建物的图案推定的分子量一致。此外，表达ER-4X Stx2eB (PG12)时，特异的信号在检测限以下。
[0260]表达Cyt_lXStx2eB(PG12)时，特异的信号在检测限以下。表达Cyt-2XStx2eB(PG12)时，在约 20kDa 的位置检测到信号。表达 Cyt_3XStx2eB(PG12)时，在约30kDa的位置检测到信号。这些都与从DNA构建物的图案推定的分子量一致。此外，表达Cyt-4 X Stx2eB (PG12)时，特异的信号在检测限以下。
[0261]表达Chl-1 X Stx2eB (PG12)时，在约14kDa的位置检测到微弱的信号。表达 Chl-2XStx2eB (PG12)时，在约 22kDa 的位置检测到与表达 ER-3X Stx2eB (PG12)时同程度的信号。表达Chl-3 X Stx2eB (PG12)时，在约30kDa的位置检测到与表达Chl-2XStx2eB(PG12)时同程度的信号。这些都与从DNA构建物的图案推定的分子量一致。此外，表达Chl-4XStx2eB(PG12)时，在约34kDa的位置检测到微弱的信号。
[0262]通常认为，上述各DNA构建物由于各含有I分子HA标签(图13参照)，表达编码2个Stx2eB的DNA时，表达编码3个Stx2eB的DNA时，各蓄积了相当于表达编码I个Stx2eB的DNA时约2倍、约3倍的Stx2eB蛋白质的蛋白质。[0263]因此，可以看出，表达内质网型(ER)、细胞质型(Cyt)、叶绿体型(Chl)的任一个DNA构建物时，与表达I个Stx2eB蛋白质时相比，表达介由作为间隔物将2个或3个Stx2eB串联连接的蛋白质更能够高效地蓄积Stx2eB。[0264](b) CTB的连接数的影响
[0265]结果如图16所示。
[0266]表达ER-1 X CTB (PG12)时，在约17kDa的位置检测到信号。表达ER_2 X CTB (PG12)时，在约28kDa和30kDa的位置检测到比表达ER-1 X Stx2eB (PG12)时大的信号。这些都与从DNA构建物的图案推定的分子量一致。
[0267]表达Cyt-1 X CTB (PG12)时，在约14kDa的位置检测到微弱的信号。表达Cyt-2 X CTB (PGl2)时，在约26kDa的位置检测到与表达ER-2 X CTB (PGl2)时同程度的信号。这些都与从DNA构建物的图案推定的分子量一致。
[0268]表达Chl-1XCTB(PG12)时，在约14kDa的位置检测到信号。表达Ch1-2 X CTB (PG12)时，在约26kDa的位置检测到与表达ER-2 X CTB (PG12)时同程度的信号。这些都与从DNA构建物的图案推定的分子量一致。
[0269]由上述可知，表达内质网型(ER)、细胞质型(Cyt)、叶绿体型(Chl)的任一个DNA构建物时，比起表达I个CTB蛋白质，表达介由间隔物将2个CTB而串联连接的蛋白质时更能够高效地蓄积CTB。
[0270]< 4 >使用了烟草培养细胞的转染实验
[0271](I)转染用载体的构建
[0272]使用如上制作的ER_2XStx2eB(PG12)、Cyt_lXStx2eB(PG12)、Cyt-2 X Stx2eB (PG12)、Cyt-3 X Stx2eB (PG12)，进行转染实验。
[0273]转染用载体的制作与上述< 2 >(1)的方法同样进行。
[0274](2)烟草培养细胞的转染和韦斯登解析
[0275]转染实验和韦斯登解析与上述< 2 > (2)、(3)的方法同样进行。
[0276]结果如图17所示。
[0277]表达ER-2XStx2eB(PG12)时，在约19kDa、21kDa和23kDa的位置检测到信号。表达Cyt-lXStx2eB(PG12)时，特异的信号在检测限以下。表达Cyt_2XStx2eB(PG12)时，在约19kDa的位置检测到信号。表达Cyt-3XStx2eB(PG12)时，在约27kDa的位置检测到比表达Cyt-2XStx2eB(PG12)时大的信号。
[0278]由上述可知，烟草培养细胞的转染子中，比起表达I个Stx2eB蛋白质,表达介由间隔物将2个或3个Stx2eB串联连接的蛋白质时更能够高效地蓄积Stx2eB。此外，烟草培养细胞的转染子中，表达细胞质型的DNA构建物时，尤其是表达介由间隔物将3个Stx2eB串联连接的蛋白质时，更能够高效地蓄积Stx2eB。
[0279]此外，烟草培养细胞的转染子中，比起表达细胞质型的DNA构建物，表达内质网型的DNA构建物时更能够高效地蓄积Stx2eB。
[0280]< 5 >使用了烟草植物体的转染实验
[0281](1)转染用载体的构建
[0282]使用上述制作的ER_2XStx2eB(PG12)、Chl_lXStx2eB(PG12)、Ch1-2 X Stx2eB (PG12)、Ch1-3 X Stx2eB (PG12)进行转染实验。[0283]转染用载体的制作按照与上述< 2 >(1)同样的方法进行。
[0284](2)烟草植物体的转染
[0285]使用上述制作的载体，按照以下的方法进行烟草植物体的转染。
[0286]对烟草植物体(Nicotianatabacum L.cv.Petit habana SRl)的种子进行灭菌，播种到MS培养基中。从无菌烟草的叶部切取I X Icm左右大小使其不含叶脉，放置在加入无菌水的浅底盘上使叶的内表面朝上，将上述< 2 >(2)中得到的用含有100mg/l卡那霉素的LB培养基培养2晚的土壤杆菌悬浊液注入浅底盘中浸溃3~5分钟。取出叶片，用灭菌毛巾擦去剩余的菌液，置于愈伤组织形成培养基中在25°C下进行培养。2~3日后，培养基上可以看到土壤杆菌后，将叶片转移到50ml试管中，用无菌水清洗5次后，置于愈伤组织形成培养基(含有卡那霉素100mg/l、羧苄青霉素250mg/l)上，25°C下培养I~2周。当叶片与最初相比变圆、表面生出凹凸后，转移到花茎形成培养基(含有卡那霉素100mg/l、羧苄青霉素250mg/l)上。再在4~6周后切取茎叶部发达的花茎转移到根形成培养基(含有卡那霉素100mg/l、羧苄青霉素250mg/l)上，25°C下培养到可以看到长根为止。植物体成长到一定程度的移植到花盆中。
[0287](3)韦斯登解析
[0288]取上述制作的基因重组烟草植物体的叶作为样品，每Img质量添加1μ I的SDS-样品缓冲液。95°C下热改性2分钟，作为电泳用的试样。使用15%丙烯酰胺凝胶分离蛋白质后，用电转移装置在PVDF膜(Hybond-P;Amersham)上印迹(blot)蛋白质。用抗HA抗体(N0.11 867 423 001，Roche) 检测 Stx2eB 蛋白质。
[0289]结果如图18和19所示。
[0290]在用ER-2XStx2eB(PG12)、Chl-lXStx2eB(PG12)、Chl-2XStx2eB(PG12)和Chl-3XStx2eB(PG12)转染的植物体中，得到高效蓄积了 Stx2eB的克隆。此外，关于叶绿体型的DNA构建物也是一样，比起表达I个Stx2eB的蛋白质，表达2个或3个Stx2eB介由间隔物而串联连接的蛋白质时，可以高概率得到有效蓄积了 Stx2eB的克隆。
[0291]此外，在约15kDa、约19kDa和约22kDa的位置检测到表达ER_2XStx2eB(PG12)时的信号。在约12kDa的位置检测到表达Chl-lXStx2eB(PG12)时的信号。在约19kDa的位置检测到表达Chl-2 X Stx2eB (PG12)时的信号。在约27kDa的位置检测到表达Chl-3XStx2eB(PG12)时的信号。这些都与从DNA构建物的图案推定的分子量一致。
[0292]< 6 >使用了烟草培养细胞的转染实验
[0293](l)Stx2eB转染用载体的构建
[0294]用上述< I > (I)的方法制作 ER-2 X Stx2eB (PG12)。ER-2 X Stx2eB (PG17)、ER-2XStx2eB(PG22)通过以下的方法制作。DNA构建物的图案如图20所示。
[0295]热处理PG7-F引物(序列号65)和PG7-R引物(序列号66)，用T4PNK磷酸化。得到的磷酸化DNA片段插入< I XI)中得到的ER-lXStx2eB(PG12)的BglII间隙(质粒14)。
[0296]此外，热处理PG12-F引物(序列号43)和PG12-R引物(序列号44)，用T4 PNK磷酸化。得到的磷酸化DNA片段插入ER-1 X Stx2eB (PG12)的BglII间隙(质粒15)。
[0297]使用BamHI和BglII从质粒14中切取Stx2eB_PG17片段，插入ER-lXStx2eB(PG12)的 BamHI 间隙(2XStx2eB(PG17))。使用 BamHI 和 BglII 从质粒 15切取 Stx2eB-PG22 片段，插入 ER-lXStx2eB(PG12)的 BamHI 间隙(ER-2X Stx2eB (PG22))。
[0298]为了进行Stx2eB的生产，使用植物的稳定转染子在转染用载体上亚克隆上述各Stx2eB 的 DNA 构建物。即，使用 XbaI 和 SacI 将 ER-2 X Stx2eB (PG12) ,ER-2 X Stx2eB (PG17)、ER-2XStx2eB (PG22)插入pBI121 (Clontech社)，配置在花椰菜花叶病毒35S RNA启动子(35S pr0.)和蓝曙红合成酶基因转录终止子(NOS-T)之间。
[0299](2) CTB转染用载体的构建
[0300]用上述< I > (2)的方法制作ER_2XCTB(PG12)。按照以下的方法制作ER-2XCTB(PG17)、ER-2XCTB(PG22)。各 DNA 构建物的图案如图 21 所示。
[0301 ] 对PG7-F引物(序列号65)和PG7-R引物(序列号66)进行热处理，用T4PNK磷酸化。将得到的磷酸化DNA片段插入< I >(2)中得到的ER-1 XCTB (PG12)的BglII间隙中(质粒16)。对PG12-F引物(序列号43)和PG12-R引物(序列号44)进行热处理，用T4PNK磷酸化。将得到的磷酸化DNA片段插入ER-1 XCTB (PG12)的BglII间隙(质粒17)。
[0302]使用BamHI 和 BglII 从质粒 16 切出 CTB-PG17 片段，插入 ER-1 XCTB (PG12)的BamHI 间隙(ER-2XCTB (PG17))。使用 BamHI 和 BglII 从质粒 17 切出 CTB-PG22 片段，插入ER-1 X CTB (PG12)的 BamHI 间隙(ER-2 X CTB (PG22))。
[0303]为了进行CTB的生产，使用植物的稳定转染子，在转染用载体上亚克隆上述各 CTB 的 DNA 构建物。即，使用 XbaI 和 SacI 将 ER-2XCTB(PG12)、ER-2XCTB(PG17)、ER-2XCTB (PG22)插入pBI 121 (Clontech社)，配置在花椰菜花叶病毒35S RNA启动子(35Spr0.)和蓝曙红合成酶基因转录终止子(NOS-T)之间。
[0304](3)转染实验和韦斯登解析
[0305]转染实验和韦斯 登解析按照上述< 2 > (2)、(3)的方法进行。
[0306](a)间隔物长度在Stx2eB串联连接中的影响
[0307]结果如图22所示。
[0308]表达ER_2XStx2eB(PG17)、ER_2XStx2eB(PG22)时，检测到与表达ER-2XStx2eB(PG12)时同程度的信号。由此可知，PG17、PG22都显示出与PG12同样的效
果O
[0309]此外，表达ER-2 X Stx2eB (PG12)时，在约19kDa和约22kDa的位置检测到信号，表达ER-2 X Stx2eB (PG17)时，在约19kDa和约22kDa的位置检测到信号，表达ER-2XStx2eB (PG22)时，在约20kDa和约23kDa的位置检测到信号。这些都与从DNA构建物的图案推定的分子量一致。
[0310](b)间隔物长度在CTB串联连接中的影响
[0311]结果如图23所示。
[0312]表达ER-2 XCTB (PG17)、ER-2 XCTB (PG22)时，检测到与表达 ER-2 X CTB (PG12)时同程度的信号。由此可知，PG17、PG22都显示出与PG12同样的效果。
[0313]此外，表达ER-2XCTB (PG12)时，在约32kDa、34kDa和36kDa的位置检测到信号，表达ER-2XCTB(PG17)时，在约32kDa、34kDa和36kDa的位置检测到信号，表达ER-2XCTB(PG22)时，在约32kDa、34kDa和36kDa的位置检测到信号。这些都与从DNA构建物的图案推定的分子量一致。
[0314]【产业上的可利用性】[0315]本发明的杂化蛋白质可以以高稳定性、高水平蓄积在植物细胞内。此外，通过使用本发明的DNA构建物在植物中生产本发明的杂化蛋白质，可以生产有效的志贺毒素、霍乱毒素、大肠杆菌易热性毒素的口服疫苗。
[0316]本发明能够在植物内表达对于诱导免疫性具有充分水平的细菌抗原。本发明通过将转基因植物用作为食饵，能够以低成本赋予动物对细菌抗原的免疫。有助于诸如猪水肿病疫苗、霍乱疫苗的开发。`
【权利要求】
1.一种杂化蛋白质，是2或3个志贺毒素蛋白质Stx2e蛋白质的B亚单位、霍乱毒素蛋白质的B亚单位或大肠杆菌易热性毒素蛋白质的B亚单位分别介由具有以下特征(A)、(B)、(C)和(D)的肽而串联连接的杂化蛋白质， (A)氨基酸的个数为12~30个； (B)脯氨酸的含有率为20~35%； (C)脯氨酸是每隔2氨基酸配置或每隔3氨基酸配置； (D)脯氨酸以外的氨基酸中，丝氨酸以及甘氨酸的合计含有率为70%以上。
2.如权利要求1记载的杂化蛋白质，其中，所述肽的(A)氨基酸的个数为12~22。
3.如权利要求1记载的杂化蛋白质，其中，所述肽的(B)脯氨酸的含有率为20~27%。
4.如权利要求1记载的杂化蛋白质，其中，所述肽的(D)脯氨酸以外的氨基酸中，丝氨酸以及甘氨酸的合计含有率为80%以上。
5.如权利要求1~4中任意一项记载的杂化蛋白质，其中，所述肽的(F)脯氨酸以外的氨基酸中，丙氨酸、蛋氨酸和谷氨酸的合计含有率为10%以下。
6.如权利要求1~4中任意一项记载的杂化蛋白质，其中，所述肽的(G)脯氨酸以外的氨基酸中，色氨酸、白氨酸、 异白氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸的合计含有率为5%以下。
7.如权利要求1~4中任意一项记载的杂化蛋白质，其中，所述肽的(H)脯氨酸以外的氨基酸中，丝氨酸、甘氨酸以及天冬酰胺的合计含有率为90%以上。
【文档编号】C07K19/00GK103626876SQ201310566988
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2009年4月28日 优先权日:2008年5月2日
【发明者】泽田和敏, 吉田和哉, 松井健史 申请人:出光兴产株式会社, 国立大学法人奈良先端科学技术大学院大学