一种高效纯化水溶性纳米银颗粒链霉亲和素偶联物的方法
【专利摘要】本发明公开了一种适合规模化高效纯化水溶性纳米银颗粒链霉亲和素偶联物的新方法，属生物【技术领域】。针对目前纳米银颗粒链霉亲和素偶联物纯化工艺复杂，回收率低，难以实现规模化生产的弊端，本发明通过采用单端氨基化聚乙二醇封闭纳米银颗粒链霉亲和素偶联物的残留羧基，降低偶联产物的表面ζ电位，通过调整溶液pH值至4.5，进一步降低偶联产物在溶液中的净电荷含量、实现普通高速离心法规模化高效纯化纳米银颗粒链霉亲和素偶联物。本发明简化了纳米银颗粒链霉亲和素偶联物的实验操作流程，降低了对分离设备的要求，适合大批量纯化纳米银颗粒链霉亲和素偶联物，得率在90%以上，且偶联产物的光特性以及生物活性未见明显变化。
【专利说明】一种高效纯化水溶性纳米银颗粒链霉亲和素偶联物的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，涉及纳米材料生物学修饰以及偶联物纯化的新方法。【背景技术】
[0002]链霉亲和素是一种与亲和素有相似生物学特性的蛋白质，可以高度特异性地结合一种水溶性的维生素:D_生物素，其与生物素的亲和力非常强，它们之间的Kd值接近IO-15M0完整的链霉亲和素是由四条相同肽链组成的四聚体，总分子量约为66.5kDa，并且每一个链霉亲和素分子可以紧密结合四个生物素分子，平均每条肽链(单体)可以结合一个生物素分子。完整的四聚体链霉亲和素还具有热稳定性好，对强酸、十二烷基磺酸钠、尿素、盐酸胍的耐受性强等特点，这些特点使得生物素-链霉亲和素系统具有高亲和力、灵敏度高、特异性强、稳定性好，信号放大作用等众多优势，此外生物素具有非常易于与种类繁多的生物活性分子(如蛋白，核酸和糖类等)发生偶联的优点，使得生物素-链霉亲和素广泛应用于免疫学、分子生物学和组织化学等领域，并已经取得较好的效果。
[0003]以金、银纳米颗粒为代表的贵金属纳米颗粒，具有特殊的光、电、磁等性质，已经发展为一种非常有效的生物探针。目前，金纳米颗粒以其良好的生物相容性和光学稳定性，非常高的消光系数，散射光强等优势代替了传统的荧光标记物，在细胞成像、DNA杂交、蛋白质相互作用等领域具有广泛的应用价值。银纳米颗粒(Sliver nanoparticle, SNP)是一种金属胶体，它和金纳米颗粒一样具有相当强的消光系数，散射信号强，但是与之相比，同等粒径的两种纳米颗粒，银纳米颗粒的消光系数更高，一般是其100倍左右。以20 nm的金、银纳米颗粒为例，金纳米颗粒的消光系数为8.78X IO8 M—1.cm—1，而银纳米颗粒达到了
2.87X IO10 M-1.cnT1。如此强的散射信号为检测提供了良好的信噪比，有效的降低了检测限、提高了单分子检测的灵敏度，为DNA/RNA、活体病毒样本的医疗检验等微量以及痕量的检测提供了良好的标记探针。`
[0004]金属纳米颗粒及其表面表现出多样且复杂的光学特性。包括贵金属纳米颗粒的强色彩，薄金属层的表面等离子共振吸收，以及对金属表面附近受激发染料的淬灭等。最近发现，荧光标记物与金属纳米颗粒或者贵金属表面的相互作用被用于获得荧光信号的增强、基于金纳米胶体淬灭的分析以及薄金属层附近荧光标记物的定向辐射等实验现象。银纳米颗粒在金属-增强荧光方面也表现出很大的优势。除了增强亮度外，金属-荧光标记物体系还表现出荧光寿命的缩短和稳定性的增加以及光漂白的减少等优点。金属纳米材料与荧光标记物间的距离直接决定了荧光增强的效率，一般认为，10 nm是一个荧光增强效率的距离最优值。但是，在一些大分子蛋白如绿色荧光蛋白以及免疫体系中，银纳米颗粒也存在着金属-增强荧光的特性。总之，作为一种新型的生物标记物，纳米银颗粒结合有机染料或突光染料后，在细胞标记、活体细胞成像、活体动物体内突光显微成像以及突光标记的免疫学快速诊断技术等领域具有更为显著的优势。其中羧基功能团表面的水溶性纳米银颗粒应用最为广泛，采用多羧基以及疏水链的两性聚合物是油溶性纳米银颗粒转化为羧基表面的水溶性纳米银颗粒最常用方法。[0005]由于链霉亲和素结合生物素类似于化学偶联的亲和效果，因此纳米银颗粒链霉亲和素偶联产物被认为制备各类生物荧光探针的共同载体得到了广泛的应用。羧基化纳米银颗粒链霉亲和素偶联常用方法为EDC/NHSS介导的活泼酯方法。在纳米银颗粒与链霉亲和素偶联过程中，将纳米银颗粒链霉亲和素偶联物与溶液中游离链霉亲和素进行高效分离，是保证纳米银颗粒链霉亲和素偶联物使用效率的前提。目前，纳米银颗粒链霉亲和素偶联物纯化方法主要包括以下几种。第一，超速离心方法。由于水溶性纳米银颗粒纳米粒子粒径小，比表面积大，纳米材料与链霉亲和素偶联物表面含有大量的羧基，因此采用常规离心(低于30000 g离心力)，纳米银颗粒链霉亲和素偶联物回收效率普遍偏低(小于50%)，若要将纳米银颗粒链霉亲和素偶联物回收效率提高至90%以上，离心速度一般需大于50，000go第二种常见纯化方法为凝胶色谱法。该方法利用纳米银颗粒链霉亲和素偶联物与链霉亲和素的分子量差异(表现为光学以及水化粒径的差异)，利用排阻层析原理进行分离。第三种常用分离方法为超滤分离法。该法利用超滤管的超滤膜截流分子量差异将链霉亲和素与纳米银颗粒链霉亲和素偶联物进行分离的一种方法。同时还有基于琼脂糖凝胶以及琼脂糖-聚丙烯酰胺杂合凝胶电泳等的纯化分离方法。总之，利用以上纯化方法虽然可以获得较高质量的纳米银颗粒链霉亲和素偶联物，但仍存在操作条件苛刻，流程复杂，得率低等缺陷，很难实现规模化生产。
【发明内容】
[0006]水溶性纳米银颗粒是一种良好的纳米荧光标记材料,该材料通过与抗体、链霉亲和素、蛋白A、蛋白G以及配体或受体分子偶联，可广泛应用于细胞标记、活体细胞成像、活体动物体内荧光显微成像以及免疫快速诊断等诸多领域。但是传统的纳米银颗粒链霉亲和素偶联物纯化方法存在操作条件苛刻，流程复杂，得率低以及很难实现规模化生产等缺陷。
[0007]本发明的目的是提供一种操作简便、分离效率高、大批量纯化纳米银颗粒链霉亲和素偶联物的新方法，具体包括以下步骤:
一种高效纯化水溶性纳米银颗粒链霉亲和素偶联物的新方法，其特征在于包括以下步骤:(I)将水溶性羧基修饰的纳米银颗粒活化，加入链霉亲和素溶液，调整溶液pH至7.0~
9.0后，偶联反应；(2)偶联反应结束后，溶液中加入单端氨基化聚乙二醇封闭偶联产物中纳米银颗粒表面残留的羧基，将反应溶液PH值调整至弱酸性；(3)高速离心，弃上清液，取沉淀。
[0008]步骤(3)后，还有将沉淀用含25%甘油，0.01% NaN3的0.05 mol/L pH 7.0~7.5
磷酸盐缓冲液溶解步骤。
[0009]所用的水溶性纳米银颗粒为核壳结构的纳米银颗粒，壳层由双亲聚合物组成，外部为大量亲水羧基表面，内层为长链疏水基团通过与三辛基氧化磷的疏水作用将油溶性纳米银颗粒包裹在壳层内部。
[0010]所述步骤(1)中活化为将水溶性羧基修饰的纳米银颗粒溶解于pH 5.0~6.0，
0.05 mol/L硼酸盐缓冲液中，分别加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺以及N-羟基硫代琥珀酰亚胺，37°C反应2小时，活化纳米银颗粒羧基。
[0011]所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺以及N-羟基硫代琥珀酰亚胺与纳米银颗粒的摩尔比均为10·0~200:1，优选为150:1 ;所述链霉亲和素与纳米银颗粒的摩尔比为I~10:1。
[0012]偶联反应结束后，溶液中加入单端氨基化聚乙二醇至单端氨基化聚乙二醇终浓度为I~2%，充分混匀15~30分钟。
[0013]步骤(2)中将反应溶液pH值调整至弱酸性为将pH值调整至4.5~5.0，优选为
4.5。
[0014]步骤(3)所述高速离心离心力为28,000~30,000g。
[0015]还包括将沉淀用含25%甘油，0.01% NaN3的0.05 mol/L pH 7.0~7.5磷酸盐缓冲液溶解备用的步骤。
[0016]步骤(1)用0.1~1.0 M NaOH溶液调整溶液pH至7.5~8.5。
[0017]原理见图1。
[0018]所述水溶性羧基修饰的纳米银颗粒制备方法为:
将浓度为98%浓硫酸(H2SO4)和浓度为30%双氧水(H2O2)以体积比(1:3)均匀混合后，置电炉丝加热至沸腾。取一定量的石英和硅晶片缓缓加入到上述沸溶液中，反应20 min后，用大量的蒸馏水漂洗。漂洗后的石英和硅晶片浸入到聚二烯丙基二甲基氯化铵水溶液(PDDA,1.0 mg/mL)中，反应20 min。将上述反应溶液加入到10 mM Ti (SO4)2水溶液(0.1 MH2SO4)中，反应5 min。然后将反应基质转移到磷酸缓冲液(pH 4.0)中，放置几秒后又转移到另一磷酸缓冲液(pH 4.0)中，放置5 min。最后，用大量的蒸馏水漂洗并置于氮气(N2)中干燥，形成硅基片。在50°C下，将上述硅基片浸入于10 mM AgNO3溶液，反应24 h后用蒸馏水漂洗I min并置于氮气(N2)中干燥，形成银离子掺杂的磷酸肽基质片。将上述基质片浸入于新鲜制备的10 mM NaBH4溶液中5 min，然后用蒸馏水漂洗I min并置于氮气(N2)中干燥，即得到纳米银颗粒。分别取I g聚马来酸酐十八醇酯、1.2 g 2-(2-氨基乙氧基)乙醇和1.26 g纳米银颗粒溶解于5 mL 96%乙醇溶液中，置于70°C下反应I h，加热挥发乙醇，最后得到水溶性羧基化纳米银颗粒。
[0019] 水溶性羧基修饰的纳米银颗粒为核壳结构的纳米银颗粒，壳层由双亲聚合物组成，外部为大量亲水羧基表面，内层为长链疏水基团，通过与三辛基氧化磷的疏水作用将油溶性纳米银颗粒包裹在壳层内部。将纳米银颗粒溶解于pH 6.0,0.05 mol/L硼酸盐缓冲液中，加入摩尔比为100~200:1的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺以及N-羟基硫代琥珀酰亚胺，37°C反应2小时，将纳米银颗粒表面羧基转化为酸性条件下稳定的活泼酯。加入链霉亲和素溶液，其中链霉亲和素与纳米银颗粒摩尔比为10:1，用I M NaOH溶液调整溶液pH至8.0~9.0。在pH 8.0~9.0条件下，链霉亲和素氨基酸残基中的氨基易于质子化，而纳米银颗粒表面活泼酯化的羧基在弱碱性条件下发生水解，与质子化氨基偶联形成稳定的酰胺键，从而将链霉亲和素偶联至纳米银颗粒表面。纳米银颗粒与链霉亲和素偶联后，由于空间位阻的原因，纳米银颗粒表面仍会残留大量未被偶联的羧基，因此纳米银颗粒链霉亲和素偶联物仍旧保持较大的(电位，因此采用普通离心方法无法将纳米银颗粒链霉亲和素偶联物与未标记链霉亲和素进行有效分离。为了降低纳米银颗粒链霉亲和素偶联物表面的(电位，本发明通过单端氨基化聚乙二醇的氨基与纳米银颗粒表面游离羧基发生离子交换，使纳米银颗粒链霉亲和素偶联物残留羧基转换为羟基，提高纳米银颗粒链霉亲和素偶联物等电点，同时进一步通过高浓度单端氨基化聚乙二醇(1%~2%)破坏链霉亲和素表面的水化层，当将溶液PH值调整至4.5时，纳米银颗粒链霉亲和素偶联物在普通高速离心下(18，OOO g~20，000 g)即可与溶液中未偶联链霉亲和素实现有效分离，其中纳米银颗粒与链霉亲和素偶联物的回收率大于90%。
[0020]为了验证单端氨基化聚乙二醇是否能有效降低羧基化纳米银颗粒的ζ电位，我们以羧基化的水溶性纳米银颗粒为原料，以单端氨基化聚乙二醇为封闭剂，采用EDC法封闭纳米银颗粒表面羧基。然后采用0.1M HCl或NaOH调整羧基化的纳米银颗粒(浓度为0.1μΜ) pH分别至2，3，4，5，6和7，同时加入同等量的0.1M HCl或NaOH溶液至相同浓度的羟基化纳米银颗粒溶液中。以上两类不同PH值的纳米银颗粒经马尔文表面电位粒径仪分析，结果见表1。从表1可知，在相同PH值下，单端氨基化聚乙二醇修饰的羟基化纳米银颗粒表面电位显著低于羟基化纳米银颗粒，当溶液PH值降至4~5之间，羟基化纳米银颗粒ζ电位下降明显。
[0021]表1不同pH条件下，羧基化以及羟基化纳米银颗粒的表面电位
【权利要求】
1.一种高效纯化水溶性纳米银颗粒链霉亲和素偶联物的方法，其特征在于包括以下步骤:(I)将水溶性羧基修饰的纳米银颗粒活化，加入链霉亲和素溶液，调整溶液pH至7.0~9.0后，偶联反应；(2)偶联反应结束后，溶液中加入单端氨基化聚乙二醇封闭偶联产物中纳米银颗粒表面残留的羧基，将反应溶液PH值调整至弱酸性；(3)高速离心，弃上清液，取沉淀。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)后，还有将沉淀用含25%甘油，0.01%NaN3的0.05 mo I/L pH 7.0~7.5磷酸盐缓冲液溶解步骤。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于水溶性纳米银颗粒为核壳结构的纳米银颗粒，壳层由双亲聚合物组成，外部为大量亲水羧基表面，内层为长链疏水基团通过与三辛基氧化磷的疏水作用将油溶性纳米银颗粒包裹在壳层内部。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中活化为将水溶性羧基修饰的纳米银颗粒溶解于pH 5.0~6.0,0.05 mol/L硼酸盐缓冲液中，分别加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺以及N-羟基硫代琥珀酰亚胺，37°C反应2小时，活化纳米银颗粒羧基。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺以及N-羟基硫代琥珀酰亚胺与纳米银颗粒的摩尔比均为100~200:1，优选为150:1 ;所述链霉亲和素与纳米银颗粒的摩尔比为I~10:1。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于偶联反应结束后，溶液中加入单端氨基化聚乙二醇至单端氨基化聚乙二醇终浓度为I~2%，充分混匀15~30分钟。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中将反应溶液pH值调整至弱酸性为将PH值调整至4.5~5.0，优选为4.5。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)所述高速离心离心力为28，000~30，OOOg0
【文档编号】C07K1/13GK103665117SQ201310637210
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月3日 优先权日:2013年12月3日
【发明者】许恒毅, 熊勇华, 罗微, 魏华, 赖卫华, 黄小林 申请人:南昌大学