半程电荷互补型手性自组装短肽纳米生物医药材料及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了半程电荷互补型手性自组装短肽纳米生物医药材料及应用。其氨基酸序列的通式如下：Ac-Pro-X-Phe-Y-Phe-Asn-Phe-Gln-Pro-NH2其中X、Y为极性带电荷氨基酸，X为带负电荷氨基酸，Y为带正电荷氨基酸，组成整条肽链的氨基酸均为全D型氨基酸，氨基酸残基的数目固定为9个。本发明所述的半程电荷互补型手性短肽的二级结构稳定性较强，受外界环境因素影响不大，可通过加入NaCl或是改变NaCl的含量来调控手性短肽的自组装形貌，又可通过自组装形成纳米纤维水凝胶，对出血创面具有快速止血的作用。该材料制备工艺简单可行，成本较低，其应用丰富了纳米生物医药材料的种类。
【专利说明】半程电荷互补型手性自组装短肽纳米生物医药材料及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及自组装纳米生物医药材料领域，具体涉及一类半程电荷互补型手性自组装短肽及其快速止血的应用。
【背景技术】
[0002]源于自组装现象广泛存在于自然界中，近年来利用氨基酸残基序列设计自组装多肽纳米材料逐渐成为 热门研究领域。通过合理设计多肽链的氨基酸残基序列，多肽分子可利用静电作用、疏水作用、氢键作用和堆积作用等非共价键作用力自发或触发性地自组装形成结构与形态特异的自组装体。由于D-型氨基酸具有良好的生物相容性且不易被自然存在的氨基酸分解酶降解，因此，利用D-型氨基酸自组装构建各种功能性材料有着巨大的应用前景。近年来院前伤口止血问题成为急救医学界关注的重点，而由氨基酸组成的多肽不同于传统止血材料，它在人体内不易发生排斥或免疫反应，从而有望替代传统止血材料，达到快速止血的作用。目前，国内外已有少部分具有止血活性的短肽被报道，但也是仅限于全程电荷互补型短肽或是全L型氨基酸组成的易降解、较不稳定的短肽。
【发明内容】
[0003]本发明目的在于提供一类半程电荷互补型手性自组装短肽，该类短肽自组装形成相互交织的纳米纤维网状结构，不但可丰富以氨基酸残基构建自组装短肽的种类，而且增加了自组装短肽的应用价值。
[0004]本发明的另一目的在于提供所述半程电荷互补型手性自组装短肽作为纳米生物止血材料的应用。
[0005]本发明设计出一类能自组装的半程电荷互补型手性短肽，此手性短肽的组成氨基酸残基均为全D型氨基酸，它们的二级结构相对稳定，不易受外界环境改变的影响，并且此肽具有显著的快速止血活性。
[0006]本发明的目的通过以下技术方案实现:
[0007]一类半程电荷互补型手性自组装短肽，其氨基酸序列的通式如下=Ac-PiO-X-Phe-Y-Phe-Asn-Phe-Gln-Pro-NH2，其中Ac为乙酰化N端，NH2为酰胺化C端，X、Y为极性带电荷氨基酸，X为带负电荷氨基酸，Y为带正电荷氨基酸，组成整条肽链的氨基酸均为全D型氨基酸，含有且仅含有9个氨基酸残基。
[0008]优选地，所述带正电荷的氨基酸为HiS、Arg或Lys。
[0009]所述带负电荷的氨基酸为Glu或Asp。
[0010]所述半程电荷互补型手性自组装短肽的序列为:SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQID N0.3、SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5 和 SEQ ID N0.6 任意一种所示。
[0011]该SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5 和 SEQID N0.6分别对应如下6种:
[0012]①D-P9-1:Ac-ProD-GluD-PheD-ArgD-PheD-AsnD-PheD-GlnD-ProD-NH2[0013]②D-P9-2:Ac-ProD-GluD-PheD-Hi sD-PheD-AsnD-PheD-GlnD-ProD-NH2
[0014]③D-P9-3:Ac-ProD-GluD-PheD-LysD-PheD-AsnD-PheD-GlnD-ProD-NH2
[0015]④D-P9-4:Ac-ProD-AspD-PheD-ArgD-PheD-AsnD-PheD-GlnD-ProD-NH2
[0016]⑤D-P9-5:Ac-ProD-AspD-PheD-HisD-PheD-AsnD-PheD-GlnD-ProD-NH2
[0017]⑥D-P9-6:Ac-ProD-AspD-PheD-LysD-PheD-AsnD-PheD-GlnD-ProD-NH2 ；
[0018]所述半程电荷互补型手性自组装短肽作为纳米生物止血材料的应用。
[0019]本发明手性短肽自组装原理是利用其肽键间的氢键相互作用以及氨基酸残基之间的氢键相互作用、静电相互作用，疏水相互作用以及堆积作用等非共价键作用力自发组合形成一类结构明确，构造稳定，并且具有某种特殊理化性质和功能的分子聚集体或超分子结构。带电荷氨基酸的引入是为了产生电荷互补形成反向平行缠绕。
[0020]本发明半程电荷互补型手性自组装短肽作为纳米生物止血材料，止血时间快，SD大鼠肾脏创面平均止血时间在6s~IOs范围内；SD大鼠肝脏创面平均止血时间则在9~15s范围内。
[0021]相对于现有技术，本发明具有如下优点和有益之处:
[0022]1.提供了一类新型的半程电荷互补手性自组装短肽，丰富了自组装短肽纳米材料的种类，所述的手性短肽二级结构稳定，不易受外界环境改变的影响。
[0023]2.本发明所述半程电荷互补型手性短肽自组装纳米形貌可通过加入NaCl和改变NaCl的含量进行调控，可形成结构新颖的纳米形貌，有助于纳米形貌的可控性研究。
[0024]3.本发明所述半程电荷互补型手性短肽通过自组装可形成交织的纳米纤维网状结构，用于出血创面后可立即自组装形成透明水凝胶，良好地覆盖于伤口表面，起到快速止血和加速伤口愈合的作用。
[0025]4.本发明所述半程电荷互补型手性短肽组成成分为氨基酸残基，在体内不易发生排斥或免疫反应，组织相容性好；此外，D型氨基酸残基组成的短肽不易被体内蛋白酶水解，延长了其作用时间。
[0026]5.本发明所述半程电荷互补型手性自组装短肽纳米材料生产工艺简单可行、成本相对较低，不但可丰富以氨基酸残基构建自组装短肽的种类，而且增加了自组装短肽的应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0027]图1是本发明所述半程电荷互补型手性短肽①D-P9-1的高效液相色谱(HPLC)图。
[0028]图2是本发明所述半程电荷互补型手性短肽①D-P9-1的质谱(MS)图。
[0029]图3是本发明所述半程电荷互补型手性短肽①D-P9-1的三维分子结构模型示意图，采用的是HyperChem7.5软件基于能量最低原则绘制。
[0030]图4是本发明所述半程电荷互补型手性短肽①D-P9-1在25°C下不同浓度超纯水溶液中的CD谱图。
[0031]图5是本发明所述半程电荷互补型手性短肽①D-P9-1在25°C下不同浓度NaCl溶液中的CD谱图。
[0032]图6是本发明所述半程电荷互补型手性短肽①D-P9-1在25°C下超纯水和80mMNaCl溶液中的临界胶束浓度拟合图。[0033]图7是本发明所述半程电荷互补型手性短肽①D-P9-1在超纯水溶液中的原子力学显微镜(AFM)纳米形貌图，其中半程电荷互补型手性短肽D-P9-1样品的浓度分别为
a.0.6mM ；b.1.2mM ；c.1.8mM ；d.2.4mM ；e.6.1mM ；f.12.2mM。
[0034]图8是本发明所述半程电荷互补型手性短肽①D-P9-1在不同浓度(a、c:0mM ;b、d:80mM ；e.100mM)NaCl溶液中的AFM纳米形貌图，其中半程电荷互补型手性短肽D-P9-1样品的浓度分别为 a> c:0.2mM ；b> d、e:1.25mM。
[0035]图9是本发明所述半程电荷互补型手性短肽①D-P9-1和②D_P9_2样品用于SD大鼠肾脏和肝脏止血模型实验图:A.肾脏空白对照；B.手性短肽①D-P9-1作用于肾脏创面；C.手性短肽②D-P9-2作用于肾脏创面；D.肝脏空白对照；E.手性短肽①D-P9-1作用于肝脏创面；F.手性短肽②D-P9-2作用于肝脏创面。
【具体实施方式】
[0036]为更好地理解本发明，下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明，但本发明要求保护的范围并不局限于实施例表示的范围。
[0037]实施例1
[0038]当X为Glu，Y为Arg时，半程电荷互补型手性短肽①D_P9_1序列如下:
[0039]D-P9-1:Ac-ProD-GluD-PheD-ArgD-PheD-AsnD-PheD-GlnD-ProD-NH2。半程电荷互补型手性短肽①D-P9-1的合成:Ac为乙酰化N端，NH2为酰胺化C端
[0040]1.材料
[0041]Fmoc-Pro-OH (N-荷甲氧擬基-脑氨酸)、Fmoc-Glu (OtBu) -OH (N-荷甲氧羰基-ο-叔丁基-谷氨酸)、Fmoc-Phe-OH (N-芴甲氧羰基-苯丙氨酸)、Fmoc-Arg(pbf)-0H(N-荷甲氧羰酰基_2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃_5_磺酰-精氨酸)、Fmoc-Asn (Trt) -OH (N-荷甲氧擬基-N-三苯甲基-天冬酸胺)、Fmoc-Gln-OH (N-荷甲氧羰酰基-谷氨酰胺)、Rink Amide-MBHA Resin (树脂)。
[0042]HBTU (O-苯并三唑-1-基-N、N、N、N-四甲基尿六氟磷酸脂)和HOBT (1-羟基苯并三氮唑)购自上海科肽生化有限公司。哌啶、醋酸酐、DMF (N、N-二甲基甲酰胺)、TFA (三氟乙酸)、NMM (N-甲基吗啉)、乙醚、甲醇和DCM (二氯甲烷)购自天津市富宇精细化工有限公司。
[0043]2.制备方法
[0044]采用Fmoc (芴甲氧羰基)保护的固相合成法，其工艺步骤如下:
[0045](1)称取 20g0.5mmol/g 的 Rink Amide-MBHA Resin 于妝合成仪中，取 200ml DMF溶胀树脂30min，抽滤，再次取用300ml DMF洗涤树脂，分3次进行，每次洗涤时间为2min，抽滤出洗涤液后向肽合成器中加入100ml20%哌啶/DMF (V:V)震荡反应30min，反应结束后，再次抽滤出反应液，用400ml DMF分4次洗涤树脂，洗毕后取少量树脂做茚三酮检测试验，树脂呈阳性，向肽合成仪中加入以下原料:
[0046]
【权利要求】
1.一类半程电荷互补型手性自组装短肽，其特征在于，氨基酸序列的通式如下=Ac-PrO-X-Phe-Y-Phe-Asn-Phe-Gln-PrO-NH2，其中 Ac 为乙酰化 N 端，NH2 为酰胺化 C 端，X、Y 为极性带电荷氨基酸，X为带负电荷氨基酸，Y为带正电荷氨基酸，组成整条肽链的氨基酸均为全D型氨基酸，含有且仅含有9个氨基酸残基。
2.根据权利要求1所述半程电荷互补型手性自组装短肽，其特征在于，所述带正电荷的氨基酸为His、Arg或Lys。
3.根据权利要求1所述半程电荷互补型手性自组装短肽，其特征在于，所述带负电荷的氨基酸为Glu或Asp。
4.根据权利要求1所述半程电荷互补型手性自组装短肽，其特征在于，所述半程电荷互补型手性自组装短肽的序列为:SEQ ID N0.USEQ ID N0.2,SEQ ID N0.3,SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5 和 SEQ ID N0.6 任意一种所示。
5.根据权利要求1~4中任意一项所述半程电荷互补型手性自组短肽作为纳米生物止血材料的应用。
【文档编号】C07K7/06GK103665110SQ201310656420
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月6日 优先权日:2013年12月6日
【发明者】何道航, 邓淑晶, 周立新 申请人:华南理工大学