抗人心肌肌钙蛋白i的重组抗体及其构建方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种抗人心肌肌钙蛋白I的重组抗体，其包括由抗人心肌肌钙蛋白I的鼠源抗体的轻链可变区与人IgG1的轻链恒定区构成的轻链和由抗人心肌肌钙蛋白I的鼠源抗体的重链可变区与人IgG1的重链恒定区构成的重链。该重组抗体与鼠源性抗体相比，既保留了亲本抗体的识别抗原的特异性和亲和力，而且避免了与人血清中的抗鼠抗体发生非特异性反应，因此，从临床诊断应用方面来看，上述重组抗体比鼠源性抗体更具有应用价值。此外，本发明还涉及一种抗人心肌肌钙蛋白I的重组抗体的构建方法以及该重组抗体的应用。
【专利说明】抗人心肌肌钙蛋白I的重组抗体及其构建方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及抗体工程领域，尤其是涉及一种抗人心肌肌钙蛋白I的重组抗体及其构建方法和应用。
【背景技术】
[0002]20世纪80年代前，世界卫生组织(WHO) —直将心肌酶谱活性作为急性心肌梗死(AMI)的诊断标准之一。20世纪80年代末,科研人员发现,肌钙蛋白(troponin, Tn)的敏感性和特异性高于磷酸肌酸激酶(CK)、磷酸肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶和天冬氨酸氨基转移酶等生物标志物。心肌肌钙蛋白I(cTnl)仅存于心肌，是心肌细胞的标志物，其异常改变可影响心脏的舒缩功能，并可用于诊断心肌坏死，判断心肌损伤等，成为心肌细胞损伤敏感性和特异性最强的标志物之一，是公认的快速诊断AMI和急性冠脉综合征(acutecoronary syndromes, ACS)以及协助ACS危险分层和反映其预后的主要生化标志。
[0003]正常人血液中cTnl含量一般低于0.3 μ g/L。当心肌细胞胞膜完整性因缺血或缺氧等受到破坏时，游离的cTnl可迅速透过细胞膜进入血流。因此，在发病初期快速、灵敏且准确的测定人血中的cTnl及其变化趋势对急性心肌梗死的诊断、急性冠状动脉综合征的危险分层、监测各种因素导致的心肌损伤等有着重要的临床意义。临床上用于检测cTnl水平的方法有酶联免疫吸附法(ELISA)，化学发光，胶体金等，不同方法都有各自的优缺点，但是都需要针对于cTnl的特异性单克隆抗体。传统的临床诊断使用的都是鼠源的单克隆抗体(mAb)ο
[0004]长期以来，鼠源性的单克隆抗体被广泛的应用于科研、临床诊断和治疗，但是由于鼠源性的mAb会引起人抗鼠抗体(HAMA)反应，从而限制了其在临床方面的应用。因此，对鼠源性抗体进行人源化改造是非常必要的。从上个世纪80年代以来，用于治疗的单克隆抗体的发展趋势是从鼠源抗体到人源化抗体再到全人源抗体，目前已经被FDA批准上市的抗体药物中有近半是人源化抗体。 而在临床诊断领域，现在使用的基本上还是鼠源性的抗体，但是由于人平常会接触到鼠类接触过的物品，血液中可能会出现HAMA反应，从而存在人抗鼠的抗体，在临床诊断中会出现非特异性反应，即会出现假阳性。
【发明内容】
[0005]基于此，有必要提供一种能显著降低假阳性出现概率的抗人心肌肌钙蛋白I的重组抗体及其构建方法和应用。
[0006]一种抗人心肌肌钙蛋白I的重组抗体，包括由抗人心肌肌钙蛋白I的鼠源抗体的轻链可变区与人IgGl的轻链恒定区构成的轻链和由抗人心肌肌钙蛋白I的鼠源抗体的重链可变区与人IgGl的重链恒定区构成的重链。
[0007]在其中一个实施例中，所述抗人心肌肌钙蛋白I的鼠源抗体由保藏号为CCTCCC2013185的杂交瘤细胞产生。
[0008]在其中一个实施例中，所述轻链可变区含有如SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列。[0009]在其中一个实施例中，所述重链可变区含有如SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列。
[0010]一种抗人心肌肌钙蛋白I重组抗体的构建方法，包括如下步骤:
[0011]分别构建含有如SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示的核苷酸序列的表达载体，其中，含有SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列的表达载体含有人IgGl的轻链恒定区的表达基因，含有SEQ ID N0.4所示的核苷酸序列的表达载体含有人IgGl的重链恒定区的表达基因；
[0012]将所述表达载体转染到同一宿主细胞中；
[0013]从所述宿主细胞中回收得到所述抗人心肌肌钙蛋白I重组抗体。
[0014]在其中一个实施例中，待插入如SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列的表达载体预留有Xbal和Pmll双酶切位点；待插入如SEQ ID N0.4所示的核苷酸序列的表达载体预留有Nhel和Hindlll双酶切位点。
[0015]在其中一个实施例中，所述如SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列是通过如下步骤制
备获得:
[0016]从保藏号为CCTCC C2013185的杂交瘤细胞中提取RNA，用反转录试剂盒进行RT-PCR，RT-PCR扩增产物70°C酶失活后作为模板，以SEQ ID N0.5及SEQ ID N0.6所示的引物序列进行PCR，回收PCR产物，PCR产物用rTaq DNA聚合酶进行加A反应后插入到pMD_18T载体中，转化到DH5 α感受态细胞中表达；
[0017]回收DH5a感受态细胞表达的产物，使用如SEQ ID N0.7及SEQ ID N0.8所示的引物序列进行PCR，得到所述SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列；
[0018]所述如SEQ ID N0.4所示的核苷酸序列是通过如下步骤制备获得:
[0019]从保藏号为CCTCC C2013185的杂交瘤细胞中提取RNA，用反转录试剂盒进行RT-PCR，RT-PCR扩增产物70°C酶失活后作为模板，以SEQ ID N0.9及SEQ ID N0.10所示的引物序列进行PCR，回收PCR产物，PCR产物用rTaq DNA聚合酶进行加A反应后插入到PMD-18T载体中，转化到DH5 α感受态细胞中表达；
[0020]回收DH5 α感受态细胞表达的产物，使用如SEQ ID N0.11及SEQ ID N0.12所示的引物序列进行PCR，得到所述SEQ ID N0.4所示的核苷酸序列。
[0021]一种编码如SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列的DNA。
[0022]一种编码如SEQ ID Ν0.2所示的氨基酸序列的DNA。
[0023]一种包含编码如SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列的DNA和/或编码如SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列的DNA的真核细胞表达载体。
[0024]一种由上述真核细胞表达载体转染的宿主细胞。
[0025]上述重组抗体在制备检测心肌肌钙蛋白I检测试剂或检测仪器中的应用。
[0026]一种心肌肌钙蛋白I的检测试纸，包括上述重组抗体。
[0027]在其中一个实施例中，所述检测试纸包括支撑薄片、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸收垫、检测线及质控线，所述样品垫、所述金标垫、所述硝酸纤维素膜及所述吸收垫从所述支撑薄片的一端向另一端依次设置在所述支撑薄片上，所述样品垫与所述金标垫部分重叠，所述金标 垫与所述硝酸纤维素膜部分重叠，所述硝酸纤维素膜与所述吸收垫部分重叠，所述检测线及所述质控线设在所述硝酸纤维素膜上，且所述检测线设在靠近所述金标垫的一端，所述质控线设在靠近所述吸收垫的一端，所述金标垫上涂覆有所述重组抗体包附胶体金颗粒形成胶体金标记的重组抗体，所述检测线为亲和纯化的抗心肌肌钙蛋白I的兔多抗，所述质控线为羊抗鼠IgG抗体。
[0028]一种检测试剂盒，包括上述心肌肌钙蛋白I的检测试纸。
[0029]上述重组抗体与鼠源性抗体相比，既保留了亲本抗体的识别抗原的特异性和亲和力，而且避免了与人血清中的抗鼠抗体发生非特异性反应，因此，从临床诊断应用方面来看，上述重组抗体比鼠源性抗体更具有应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0030]图1为一实施方式的检测试纸的正面示意图；
[0031]图2为图1中检测试纸的纵截面示意图；
[0032]图3为检测试剂盒示意图；
[0033]图4为以杂交瘤细胞提取的RNA反转录后得到的cDNA为模板，用重链和轻链兼并引物扩增含Vh和\的基因片段的电泳图，\的mKF5/mKR引物对和Vh的mHF2/mHR引物对扩增出420bp左右的条带，M为DL2000DNAMarker ；
[0034]图5为重组抗体真核表达载体， a为pFP-1gCK，b为pFP-1gCH ；
[0035]图6为用'和Vh特异的引物扩增的V1^ (395bp^PVH (405bp)基因片段，M为DL2000DNAMarker ；
[0036]图7为重组抗体用proteinG亲和层析柱纯化时的穿透峰和吸收峰；
[0037]图8为重组抗体纯化后SDS-PAGE分析，a为4 μ g鼠源抗体，b为4 μ g重组抗体，M 为 Protein Marker。
【具体实施方式】
[0038]以下结合附图及具体实施例对本发明的抗人心肌肌钙蛋白I的重组抗体及其构建方法和应用作进一步详细的说明。
[0039]一实施方式的抗人心肌肌钙蛋白I的重组抗体，包括由抗人心肌肌钙蛋白IChcTnI)的鼠源抗体(mAb)的轻链可变区(L链V区，\)与人IgGl的轻链恒定区(L链C区，Q，如k链C区(Ck)等)构成的轻链和由抗人心肌肌钙蛋白I的鼠源抗体的重链可变区(H链V区，Vh)与人IgGl的重链恒定区(H链C区，Ch)构成的重链。
[0040]其中，上述抗人心肌肌钙蛋白I的鼠源抗体由保藏号为CCTCC C2013185的杂交瘤细胞产生，该杂交瘤细胞命名为CTN1-C4，已于2013年11月13日保藏在湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心(即中国典型培养物保藏中心)。上述轻链可变区含有如SEQ IDN0.1所示的氨基酸序列，其对应的DNA序列为序列表中SEQ ID N0.3 ;重链可变区含有如SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列，其对应的DNA序列为序列表中SEQ ID N0.4。
[0041]SEQIDN 0.3 的序 列为:ATGMGTTGC CTGTTAGGCT G
ATGTTCTGG A T.CCTGCTTC.C AGC AGT; (; Λ T GTTTTGATGACCCAAACTCC ACTCTCCCTG CCTGTCAGTC TTGGAGATCA GCCTCCATC TCTTGC AGATCTAGTCAG AG CATTG TA CAT AGTA ATGG AA ACACCTATTT AGAA I'CiGTAC
【权利要求】
1.一种抗人心肌肌钙蛋白I的重组抗体，其特征在于，包括由抗人心肌肌钙蛋白I的鼠源抗体的轻链可变区与人IgGl的轻链恒定区构成的轻链和由抗人心肌肌钙蛋白I的鼠源抗体的重链可变区与人IgGl的重链恒定区构成的重链。
2.如权利要求1所述的抗人心肌肌钙蛋白I的重组抗体，其特征在于，所述抗人心肌肌钙蛋白I的鼠源抗体由保藏号为CCTCC C2013185的杂交瘤细胞产生。
3.如权利要求1所述的抗人心肌肌钙蛋白I的重组抗体，其特征在于，所述轻链可变区含有如SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列。
4.如权利要求1所述的抗人心肌肌钙蛋白I的重组抗体，其特征在于，所述重链可变区含有如SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列。
5.一种抗人心肌肌钙蛋白I的重组抗体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤: 分别构建含有如SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示的核苷酸序列的表达载体，其中，含有SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列的表达载体含有人IgGl的轻链恒定区的表达基因，含有SEQ ID N0.4所示的核苷酸序列的表达载体含有人IgGl的重链恒定区的表达基因； 将所述表达载体转染到同一宿主细胞中； 从所述宿主细胞中回收得到所述抗人心肌肌钙蛋白I重组抗体。
6.如权利要求5所述的抗人心肌肌钙蛋白I的重组抗体的构建方法，其特征在于，待插入如SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列的表达载体预留有XbaI和PmlI双酶切位点；待插入如SEQ ID N0.4所示的核苷酸序列的表达载体预留有NheI和HindIII双酶切位点。
7.如权利要求6所述的抗人心肌肌钙蛋白I的重组抗体的构建方法，其特征在于，所述如SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列是通过如下步骤制备获得: 从保藏号为CCTCC C2013185的杂交瘤细胞中提取RNA，用反转录试剂盒进行RT-PCR，RT-PCR扩增产物70°C酶失活后作为模板，以SEQ ID N0.5及SEQ ID N0.6所示的引物序列进行PCR，回收PCR产物，PCR产物用rTaq DNA聚合酶进行加A反应后插入到pMD_18T载体中，转化到DH5 α感受态细胞中表达； 回收DH5a感受态细胞表达的产物，使用如SEQ ID N0.7及SEQ ID N0.8所示的引物序列进行PCR,得到所述SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列； 所述如SEQ ID N0.4所示的核苷酸序列是通过如下步骤制备获得: 从保藏号为CCTCC C2013185的杂交瘤细胞中提取RNA，用反转录试剂盒进行RT-PCR，RT-PCR扩增产物70°C酶失活后作为模板，以SEQ ID N0.9及SEQ ID N0.10所示的引物序列进行PCR，回收PCR产物，PCR产物用rTaq DNA聚合酶进行加A反应后插入到pMD_18T载体中，转化到DH5 α感受态细胞中表达； 回收DH5a感受态细胞表达的产物，使用如SEQ ID N0.11及SEQ ID N0.12所示的引物序列进行PCR,得到所述SEQ ID N0.4所示的核苷酸序列。
8.—种编码如SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列的DNA。
9.一种编码如SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列的DNA。
10.一种包含编码如SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列的DNA和/或编码如SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列的DNA的真核细胞表达载体。
11.一种如权利要求10所述的真核细胞表达载体转染的宿主细胞。
12.如权利要求1所述的重组抗体在制备检测心肌肌钙蛋白I检测试剂或检测仪器中的应用。
13.一种心肌肌钙蛋白I的检测试纸，其特征在于，包括如权利要求1所述的重组抗体。
14.如权利要求13所述的心肌肌钙蛋白I的检测试纸，其特征在于，包括支撑薄片、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸收垫、检测线及质控线，所述样品垫、所述金标垫、所述硝酸纤维素膜及所述吸收垫从所述支撑薄片的一端向另一端依次设置在所述支撑薄片上，所述样品垫与所述金标垫部分重叠，所述金标垫与所述硝酸纤维素膜部分重叠，所述硝酸纤维素膜与所述吸收垫部分重叠，所述检测线及所述质控线设在所述硝酸纤维素膜上，且所述检测线设在靠近所述金标垫的一端，所述质控线设在靠近所述吸收垫的一端，所述金标垫上涂覆有所述重组抗体包附胶体金颗粒形成胶体金标记的重组抗体，所述检测线为亲和纯化的抗心肌肌钙蛋白I的兔多抗，所述质控线为羊抗鼠IgG抗体。
15.一种检测试剂盒，包括 如权利要求13或14所述的心肌肌钙蛋白I的检测试纸。
【文档编号】C07K16/46GK103694355SQ201310676769
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月11日 优先权日:2013年12月11日
【发明者】李泓彦, 霍永庭, 彭亮 申请人:深圳市菲鹏生物股份有限公司