新型副粘病毒及其用途

新型副粘病毒及其用途
【专利摘要】本文描述了分离的副粘病毒麻疹病毒(FmoPV)，编码FmoPV基因组的分离的核酸、FmoPV蛋白的分离的氨基酸序列、针对FmoPV及其蛋白的抗体，及它们的用途。在某些实施方案中，修饰的FmoPV是猫麻疹病毒。本文还提供了包含修饰FmoPV基因或基因区段的重组FmoPV和此类病毒的用途。重组FmoPV可用于预防和/或治疗与FmoPV相关的疾病，或用作递送载体。本文还描述了用于FmoPV的诊断测定。在某些实施方案中，FmoPV引起肾脏疾病。在某些实施方案中，肾脏疾病是在猫科动物中。在某些实施方案中，肾脏疾病是小管间质性肾炎(“TIN”)。本文中还描述了用于检测FmoPV、其天然或人工变体、类似物或衍生物的定量测定。在某些实施方案中，定量测定是反转录和聚合酶链式反应(RT-PCR)。本文还描述了用于预防和治疗FmoPV感染的疫苗和含有该疫苗的试剂盒。本文还提供了包含用于检测FmoPV的核酸分子的诊断试剂盒。
【专利说明】新型副粘病毒及其用途
[0001] 交叉引用相关申请 本申请要求2012年1月20日提交的美国专利申请序列号61/588, 778的权益，所述申 请在此完整地通过引用并入。
[0002] 1.【技术领域】 本文描述了分离的副粘病毒麻瘆病毒（FmoPV)，编码FmoPV基因组的分离的核酸、 FmoPV蛋白的分离的氨基酸序列、针对FmoPV及其蛋白的抗体，及它们的用途。在某些实施 方案中，修饰的FmoPV是猫麻瘆病毒。本文还描述了包含修饰FmoPV基因或基因区段的重 组FmoPV和此类病毒的用途。重组FmoPV可用于预防和/或治疗与FmoPV相关的疾病，或 用作递送载体。本文还描述了用于FmoPV的诊断测定。在某些实施方案中，FmoPV引起肾 脏疾病。在某些实施方案中，肾脏疾病是在猫科动物中。在某些实施方案中，肾脏疾病是小 管间质性肾炎（"TIN")。本文中还描述了用于检测FmoPV、其天然或人工变体、类似物或衍 生物的定量测定。在某些实施方案中，定量测定是反转录和聚合酶链式反应（RT-PCR)。本 文还描述了用于预防和治疗FmoPV感染的疫苗和含有该疫苗的试剂盒。本文描述了包含用 于检测FmoPV的核酸分子的诊断试剂盒。
[0003] 2.发明背景 副粘病毒是有包膜、反义单链RNA病毒，其分成两个亚科，副粘病毒亚科 和肺病毒亚科（AeiWffioFiri/?a<9)。在过去二十年中，副粘病毒亚科中 的病毒已经与人类和各种动物中的一些新出现的疾病相关（1-9)。目前在副粘病毒亚科 中有五个属，即呼吸道病毒属、风瘆病毒属麻瘆病毒属 亨尼病毒属和禽聰腺病毒属尽管亚科的 一些成员仍然未分类。在副粘病毒亚科的成员中，麻瘆病毒、腮腺炎病毒和人类副流感病毒 1至4是引起呼吸道至全身性感染的爆发的最众所周知的人副粘病毒（10-12)。新近报道 了来自中国大陆果幅的二种新型风疼病毒，Tuhoko病毒1、2和3，以及来自香港锡金大鼠的 一种新型未分类副粘病毒，Tailam病毒（13, 14)。尽管各种动物中存在副粘病毒，但在猫 中没有自然观察到副粘病毒，尽管存在争论性的证据表明，副流感病毒5病毒可以感染猫 (15, 16)〇
[0004] 猫和狗是全世界最常见的家畜和宠物。由于它们的密切关联性，这两种动物间的 病毒种间跳跃并不少见。对于冠状病毒，猫冠状病毒和犬冠状病毒被分类在相同种α冠状 病毒I 7)下，并且猫冠状病毒II型株通过猫冠状病毒I型株和犬冠 状病毒之间的双同源重组生成（17)。对于细小病毒，在1970年代出现的致命的犬细小病毒 也源自猫细小病毒，猫泛白血球降低症病毒（feline panleukopaenia virus)(18，19)。至 于疱瘆病毒，犬疱瘆病毒1和猫疱瘆病毒1密切相关，都分类在水痘病毒（ 属下（20)。此外，对于乳头瘤病毒，犬口腔乳头瘤病毒和猫乳头瘤病毒也密切相关，并且分 类在λ乳头瘤病毒属下（21)。狗是麻瘆病毒属中的副粘病毒，犬瘟热病毒的众所周知的宿 主（22)，但在家猫中从没有发现副粘病毒。
[0005] 许多猫科动物疾病没有已知的原因。例如，猫小管间质性肾炎的大多数情况的原 因是迄今未知的，因此治疗主要是支持性的，且预防是困难的。小管间质性肾炎（"TIN"）涉 及对肾小管和小间隙的主要损伤，是猫中肾衰竭的最常见原因和死亡的首要原因之一。然 而，猫TIN的大多数情况的原因仍然未知，因此治疗主要是支持性的，且预防是困难的。由 于世界各地的家庭中有数百万只猫，来自TIN的疾病负担是巨大的。例如，在美洲的美国， 据估计，有7千5百万家养猫，尽管在英国有估计有8百万家养猫（数据来自Chomel BB， Sun B. , Zoo noses in the bedroom. Emerg Infect Dis. 2011 Feb:17(2):167-72.)〇诊 断、治疗或预防猫肾脏或其它疾病的能力将有很大益处。
[0006] 本文中任何参考文献的引用不应被解释为承认此类参考文献可作为本申请的"现 有技术"。
[0007] 3.发明概述 在一个方面，本发明提供了包含野生型或修饰的FmoPV基因区段（基因组RNA)或其 互补序列（反基因组RNA)或由其组成的核酸序列。本文还描述了编码FmoPV的基因组的 分离的核酸，由分离的FmoPV的部分编码的多肽，核酸，引物，载体，宿主细胞，针对FmoPV和 FmoPV多肽的抗体，免疫原性组合物，诊断方法，筛选测定，治疗方法和相关用途。
[0008] 在一个方面，本文描述了麻瘆病毒属中的一种新型副粘病毒，来自家猫 cates)的猫麻瘆病毒（以下称为"FmoPV"）。本文还描述了这种新型FmoPV病毒与猫中的 小管间质性肾炎（TIN)相关。
[0009] 在一个方面，修饰的FmoPV基因区段包含FmoPV核酸序列，和还有异源核苷酸序 列。在一些实施方案中，第一和第二异源核苷酸序列编码不同的肽或多肽。在其它实施方案 中，第一和第二异源核苷酸序列编码相同的肽或多肽。在具体实施方案中，本文所述的包含 修饰的FmoPV基因区段的FmoPV在细胞（例如，MDCK细胞）或含胚鸡蛋中1、2、3、4、5、6、7、 8、9、10 或更多代后实现了约 3 X IO5 pfu/ml、3.5 X IO5 pfu/ml、4 X IO5 pfu/ml、5 X IO5 pfu/ml、l x IO6 pfu/ml、5 x IO6 pfu/ml、l x IO7 pfu/ml、5 x IO7 pfu/ml、l x IO8 pfu/ ml、5 x IO8 pfu/ml、l x IO9 pfu/ml或更高的滴度。在某些实施方案中，本文所述的FmoPV 包含减毒突变。在一个方面，本文提供了使用FmoPV的方法，其中FmoPV包含修饰的FmoPV 基因区段。
[0010] 在一个实施方案中，本文提供了在生物材料诸如细胞、血液、血清、血浆、唾液、尿、 粪、痰、鼻咽抽吸物等中检测FmoPV、其天然或人工变体、类似物或衍生物的存在或表达的方 法。样品中FmoPV活性或表达相对于对照样品的升高或降低可通过将生物材料与可直接或 间接检测FmoPV存在或表达的试剂接触而测定。在一个具体实施方案中，检测试剂为本发 明的核酸分子。
[0011] 在一个具体实施方案中，本文提供了 FmoPV、其天然或人工变体、类似物或衍生物 的诊断测定。具体地，本文提供了使用反转录和聚合酶链式反应（RT-PCR)检测FmoPV的核 酸分子的定量测定。本发明中还提供适合与FmoPV核酸杂交的核酸分子，诸如包括但不限 于PCR引物、逆转录酶引物、用于Southern分析或其它核酸杂交分析以检测FmoPV核酸的 探针。所述FmoPV核酸包含以下所述的核酸序列或其互补序列、类似物、衍生物、片段或部 分或由其组成。
[0012] 在一个方面，本发明涉及分离的FmoPV用于诊断方法的用途。在一个具体实施方 案中，本发明提供在生物材料诸如细胞、血液、血清、血浆、唾液、尿、粪、痰、鼻咽抽吸物等中 检测本发明FmoPV的mRNA或基因组RNA的方法。样品中FmoPV的mRNA或基因组RNA相 对于对照样品水平的升高或降低可通过将生物材料与可直接或间接检测FmoPV的mRNA或 基因组RNA的试剂接触而测定。在一个具体实施方案中，检测试剂为本发明的核酸分子。
[0013] 本发明还涉及鉴定感染FmoPV、其天然或人工变体、类似物或衍生物的对象的方 法。在一个具体实施方案中，所述方法包括从获得自对象的生物样品获得总RNA ;逆转录总 RNA以获得cDNA ;和用一组来源于FmoPV的核苷酸序列的引物使cDNA进行PCR测定。
[0014] 本发明进一步涉及用于检测FmoPV的mRNA或基因组RNA的包含引物和核酸探针 的诊断试剂盒。在一个具体实施方案中，本文提供了包含核酸分子的诊断试剂盒，其适合用 于检测FmoPV、其天然或人工变体、类似物或衍生物。在一个实施方案中，本文提供的试剂盒 在一个或多个容器中包含本文所述的核酸序列。在另一个实施方案中，本文提供的试剂盒 在一个或多个容器中包含本文所述的FmoPV。
[0015] 在另一个方面，本文提供了包含本文所述的核酸序列的基质（例如，宿主细胞和 蛋）。
[0016] 在一个实施方案中，本文提供了用于引发对象中针对FmoPV的免疫应答的方法， 其中所述方法包括将本文所述的FmoPV或其组合物施用于对象。在另一个实施方案中，本 文提供了用于预防和/治疗对象中的FmoPV感染的方法，其中所述方法包括将本文所述的 FmoPV或其组合物施用于对象。在另一个实施方案中，本文提供了用于预防和/治疗对象中 的FmoPV疾病的方法，其中所述方法包括将本文所述的FmoPV或其组合物施用于对象。
[0017] 在另一个实施方案中，本文提供了用于引发对象中针对抗原的免疫应答的方法， 其包括将本文所述的FmoPV或其组合物施用于对象。在另一个实施方案中，本文提供了用 于利用本文所述的FmoPV或其组合物生成或鉴定结合FmoPV的抗体的方法。
[0018] 在另一个方面，本文所述的FmoPV可用于评估化合物的抗病毒活性或理解FmoPV 的生命周期。
[0019] 3. 1 术语 如本文所用，术语"变体"是指FmoPV的天然存在的遗传突变体或重组制备的FmoPV变 体，与具有Genbank登录号JQ411014、JQ411015和JQ411016中公开核酸系列的FmoPV相 比，它们各自在其基因组中包含一种或多种突变。术语"变体"还可指给定肽的天然存在的 变体或重组制备的特定肽或蛋白的变体，其中一个或多个氨基酸残基通过氨基酸取代、插 入或缺失进行修饰。
[0020] 如本文所用，术语"突变体"是指与野生型生物体相比生物体的核苷酸序列中存在 突变。
[0021] 如本文所用，术语"抗体"是指单克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、人抗体、 人源化抗体、嵌合抗体、骆蛇源化（camelised)抗体、单结构域抗体、单链Fv (scFv)、单链 抗体、Fab片段、F (ab'）片段、二硫键连接的Fv (sdFv)和抗独特型（抗Id)抗体（包括例 如针对本发明抗体的抗Id抗体）和上述任何抗体的表位结合片段。具体地，抗体包括免疫 球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即包含抗原结合位点的分子。免疫球蛋白 分子可为任何型（例如 IgG、IgE、IgM、IgD、IgA 和 IgY)、类（例如 IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、 IgAl和IgA2)或亚类。
[0022] 如本文所用，术语"抗体片段"是指免疫特异性结合FmoPV或FmoPV任何表位的抗 体片段。抗体片段可通过任何本领域技术人员已知的技术产生。例如，Fab和？(&13'）2片 段可通过使用酶诸如木瓜蛋白酶（产生Fab片段）或胃蛋白酶（产生F(ab'）2片段）蛋白 水解切割免疫球蛋白分子产生。F(ab'） 2片段含有完整的轻链和重链的可变区、CHl区和铰 链区。抗体片段还可通过重组DNA技术产生。抗体片段可为抗体的一个或多个互补决定区 (CDR) 〇
[0023] 如本文所用，术语"免疫特异性结合本发明多肽的抗体或抗体片段"是指抗体或其 片段，其免疫特异性结合FmoPV的核酸序列或其互补序列、类似物、衍生物、或片段或其部 分编码的多肽，或者其免疫特异性结合FmoPV或其变体、类似物、衍生物或片段的多肽，并 且不非特异性结合其它多肽。免疫特异性结合本发明多肽的抗体或其片段可与其它抗原交 叉反应。优选地，免疫特异性结合本发明多肽的抗体或其片段不与其它抗原交叉反应。免 疫特异性结合本发明多肽的抗体或其片段可通过例如免疫测定或其它本领域技术人员已 知的技术鉴定。
[0024] 如本文所用，术语"表位"是指在动物、优选哺乳动物、最优选猫科动物中具有抗原 性或免疫原性活性的FmoPV肽、多肽或蛋白的片段。具有免疫原性活性的表位是在动物中 引起抗体应答的多肽的片段。具有抗原性活性的表位是抗体与其免疫特异性结合的多肽或 蛋白的片段，这可通过本领域已知的任何方法测定，例如通过本文所述的免疫测定法。抗原 性表位不必是免疫原性的。
[0025] 如本文所用，术语"抗原性"是指物质（例如外来物、微生物、药物、抗原、蛋白、肽、 多肽、核酸、DNA、RNA等）在具体生物体、组织和/或细胞中引起免疫应答的能力。有时术 语"抗原性的"与术语"免疫原性的"是同义的。
[0026] 如本文所用，术语"免疫原性"是指物质（例如外来物、微生物、药物、抗原、蛋白、 肽、多肽、核酸、DNA、RNA等）在生物体中引起免疫应答的特性。免疫原性部分取决于讨论 的物质的大小，部分取决于该物质与宿主分子不相似的程度。高度保守的蛋白倾向具有较 低免疫原性。
[0027] 如本文所用，术语"在严格条件下杂交"描述相互之间具有至少30%、35%、40%、 45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90% 或 95% 同一性的核苷酸序列通常保持互 相杂交的杂交和洗绦条件。此类杂交条件描述于例如但不限于Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3. 1-6.3.6. ; Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing Co. , Inc., N. Y. (1986), pp.75-78, and 84-87;和 Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y. (1982)，pp. 387-389,且对于本领域技术人员来说是众所周知的。严格杂交条件的一个优 选非限制性实例是在约68°C下6X氯化钠/柠檬酸钠（SSC)、0. 5% SDS中杂交，然后在室温 下2X SSC、0. 5% SDS中洗涤一次或多次。严格杂交条件的另一个优选的非限制性实例是在 约45°C下6X SSC中杂交，然后在约50-65°C下0. 2X SSC、0. 1% SDS中洗涤一次或多次。
[0028] "分离的"或"纯化的"肽或蛋白基本不含来自所述蛋白衍生自的细胞来源或组织 来源的细胞材料或其它污染蛋白，或当它们通过化学法合成时，基本不含化学前体或其它 化学物质。措词"基本不含细胞材料"包括制备多肽/蛋白制剂，其中多肽/蛋白从其分 离或重组生产的细胞的细胞成分中分离出来。因此，基本不含细胞材料的多肽/蛋白包括 含少于约30%、20%、10%、5%、2· 5%或1% (干重）污染蛋白的多肽/蛋白制剂。当多肽/蛋 白为重组生产时，还优选基本不含培养基，即培养基占蛋白制剂的体积少于约20%，、10%或 5%。当多肽/蛋白通过化学合成生产时，优选基本不含化学前体或其它化学物质，即与参与 蛋白合成的化学前体或其它化学物质分离。因此，这种多肽/蛋白制剂含少于约30%、20%、 10%、5% (干重）不属于目的多肽/蛋白片段之外的化学前体或化合物。在本发明优选的实 施方案中，多肽/蛋白是分离的或纯化的。
[0029] 如本文所用，术语"分离的"病毒是与天然病毒来源中存在的其它生物体分离的病 毒，所述来源例如为生物材料诸如细胞、血液、血清、血浆、唾液、尿、粪、痰、鼻咽抽吸物等。 分离的病毒可用于感染对象。
[0030] 如本文所用，术语"具有本发明多肽的生物活性"是指具有共同生物活性的多肽或 蛋白的特性，其与以下多肽相比具有类似或相同结构域和/或具有足够的氨基酸同一性： FmoPV的核苷酸序列或其互补序列、类似物、衍生物、片段或部分编码的多肽；或具有FmoPV 的氨基酸序列或其变体、类似物、衍生物或片段的多肽。本发明多肽的这种共同生物活性包 括抗原性和免疫原性。
[0031] 如本文所用，术语"部分"或"片段"是指含有相关核酸分子长度的至少约25、30、 35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、 750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、2, 000、3, 000、4, 000、5, 000、6, 000、 7, 000、8, 000、9, 000、10, 000、11，000、12, 000、13, 000、14, 000、15, 000、16, 000、17, 000 或 更多个连续核酸，且具有所述核酸分子的至少一种功能特征（或其编码的蛋白具有所述核 酸分子所编码的蛋白的一种功能特征）的核酸分子片段；或是指含有相关蛋白或多肽长度 的至少 5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、120、140、160、180、 200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、500、600、800、1，000、2, 000、3, 000、 4, 000、5, 000、6, 000、7, 000、8, 000、9, 000、9, 500或更多个氨基酸残基，且具有所述蛋白或 多肽的至少一种功能特征的蛋白或多肽的片段。
[0032] 如本文所用，术语"类似物"（例如蛋白、多肽、肽和抗体）是指以下物质：其具有 与第二种物质相似或相同的功能，但不必包含与第二种物质相似或相同的氨基酸序列，或 具有与第二种蛋白类物质相似或相同的结构。在一个具体实施方案中，抗体类似物与该类 似物衍生自的原初抗体免疫特异性结合相同的表位。在一个可替代实施方案中，抗体类似 物与该类似物衍生自的原初抗体免疫特异性结合不同的表位。具有相似氨基酸序列的试剂 是指满足至少一项以下条件的第二试剂：(a)试剂的氨基酸序列与第二试剂的氨基酸序列 至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至 少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%相同；(b)编码试剂的核苷酸序 列在严格条件下与编码第二试剂的至少5个连续氨基酸残基、至少10个连续氨基酸残基、 至少15个连续氨基酸残基、至少20个连续氨基酸残基、至少25个连续氨基酸残基、至少40 个连续氨基酸残基、至少50个连续氨基酸残基、至少60个连续氨基酸残基、至少70个连 续氨基酸残基、至少80个连续氨基酸残基、至少90个连续氨基酸残基、至少100个连续氨 基酸残基、至少125个连续氨基酸残基或至少150个连续氨基酸残基的核苷酸序列杂交；和 (c)编码试剂的核苷酸序列与编码第二试剂的核苷酸序列至少30%、至少35%、至少40%、至 少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少 90%、至少95%或至少99%相同。与第二试剂具有相似结构的试剂是指与第二试剂具有类似 的二级、三级或四级结构的试剂。试剂的结构可通过本领域技术人员已知的方法测定，包括 但不限于肽测序、X射线晶体学、核磁共振、圆二色性和晶体电子显微镜。
[0033] 为了测定两种氨基酸序列或两种核酸序列的同一性百分比，为了达到最佳比较目 的而比对序列（例如在第一种氨基酸序列或核酸序列中引入空位以与第二氨基酸或核酸 序列达到最佳比对）。然后在相应的氨基酸位置或核苷酸位置比较氨基酸残基或核苷酸。 当第一种序列的位置被与第二种序列相应位置相同的氨基酸或核苷酸占据时，所述分子在 该位置是相同的。两种序列之间的同一性百分比是两种序列共有相同位置的数量的函数 (即％同一性=相同重叠位置的数量/位置总数量X 100%)。在一个实施方案中，两种序列 具有相同长度。
[0034] 两种序列之间同一性百分比的测定也可使用数学算法完成。用于比较两种序列 的数学算法的优选非限制性实例是Karlin和Altschul, 1990，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:2264 2268 的算法，在 Karlin *Altschul，1993，Proc.Natl.Acad.Sci. U.S. A. 90:5873 5877中进行修改。此类算法被并入Altschul等人，1990，J. Mol. Biol. 215:403的NBLAST和BLAST程序中。BLAST核苷酸搜索可用NBLAST核苷酸程序进行， 参数设定在例如分值=100,字长=12,以获得与本发明核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST 蛋白搜索可用XBLAST程序进行，参数设定在例如分值=50,字长=3,以获得与本发明蛋白分 子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的缺口比对，可使用Altschul等人，1997， Nucleic Acids Res. 25:3389 3402 中所述的 Gapped BLAST。或者，可使用 PSI BLAST 进 行检测分子间远缘关系（Id.)的叠代搜索。当使用BLAST、Gapped BLAST和PSI Blast程 序时，可使用各程序（例如XBLAST和NBLAST)默认的参数（参见例如NCBI网站）。用于 序列比较的数学算法的另一个优选非限制性实例是Myers和Miller，1988，CABIOS 4:11 17的算法。该算法被并入ALIGN程序（2.0版）中，其为GCG序列比对软件包的部分。当使 用ALIGN程序比较氨基酸序列时，可使用PAM120加权残基表、缺口长度罚分12和空位罚分 4〇
[0035] 两种序列之间的同一性百分比可使用与上述技术相似的技术测定，允许或不允许 缺口。在计算同一性百分比时，通常只计算完全匹配。
[0036] 如本文所用，术语"衍生物"（例如蛋白、多肽、肽和抗体）是指包含通过引入氨基 酸残基取代、缺失和/或插入而改变的氨基酸序列的试剂。如本文所用，术语"衍生物"也 是指进行修饰的试剂，即通过将任何类型的分子共价连接至试剂。例如但不以任何方式限 制，抗体可进行修饰，例如通过糖基化、乙酰化、PEG化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/封 闭基团的衍生化、蛋白水解裂解、连接细胞配体或其它蛋白等。试剂的衍生物可通过使用本 领域技术人员已知技术化学修饰而产生，所述技术包括但不限于特异性化学裂解、乙酰化、 甲酰化、衣霉素的代谢合成等。此外，试剂的衍生物可包含一种或多种非典型氨基酸。试剂 的衍生物具有与其来源的物质相似或相同的功能。
[0037] 如本文所用，术语"约"或"大约"当与数字连用时是指相关数字的1%、5%或10%之 内的任何数字。
[0038] 如本文所用，术语"有效量"在向对象施用治疗的背景下是指具有一种或多种预防 性和/或治疗性效果的治疗的量。在某些实施方案中，在向对象施用治疗的背景下有效量 是指能够足以实现下述效果中的一种、两种、三种、四种或更多种的治疗的量：（i)降低或 改善FmoPV感染、FmoPV疾病或与之相关症状的严重度；（ii)降低FmoPV感染、FmoPV疾病或 与之相关症状的持续时间；（iii)预防FmoPV感染、FmoPV疾病或与之相关症状的发展；（iv) FmoPV感染、FmoPV疾病或与之相关症状的退化；(V)预防FmoPV感染、FmoPV疾病或与之相 关症状的发展或发作；(vi)预防FmoPV感染、FmoPV疾病或与之相关症状的复发；(vii)降 低或预防FmoPV从一个细胞传播到另一个细胞，一个组织传播到另一个组织，或一个器官 传播到另一个器官；(viii)预防或降低FmoPV从一个对象传播/传递到另一个对象；（ix) 降低与FmoPV感染或FmoPV疾病相关的器官衰竭；(X)减少对象住院治疗；(xi)缩短住院 治疗的时间；(xii)增加具有FmoPV感染或与之相关疾病的患者的存活率；(xiii)消除 FmoPV感染或与之相关疾病；(xiv)抑制或降低FmoPV复制；(XV)抑制或降低FmoPV与宿主 细胞的结合或融合；(xvi)抑制或降低FmoPV进入宿主细胞；(xvii)抑制或降低FmoPV基 因组的复制；(xviii)抑制或降低FmoPV蛋白的合成；(xix)抑制或降低FmoPV颗粒的装 配；(XX)抑制或降低FmoPV颗粒从宿主细胞的释放；(xxi)降低FmoPV滴度；(xxii)降低 与FmoPVB感染或FmoPV疾病相关的症状数；(xxiii)增强、改善、补充、互补或增加另一种 疗法的一种或多种预防或治疗效果；(xxiv)预防与FmoPV感染相关的二次感染的发作或 进展；和/或（XXV)预防继发于FmoPV感染发生的疾病严重度的发生或减小。本文下面提 供了有效量的示例性剂量。
[0039] 在某些实施方案中，治疗的有效量并不导致完全保护免于FmoPV疾病，但是导致 相比于未治疗对象FmoPV滴度降低或FmoPV数量减少。在某些实施方案中，治疗的有效量 导致FmoPV滴度相对于未治疗对象0. 5倍、1倍、2倍、4倍、6倍、8倍、10倍、15倍、20倍、 25 倍、50 倍、75 倍、100 倍、125 倍、150 倍、175 倍、200 倍、300 倍、400 倍、500 倍、750 倍、或 1000倍或更大的降低。在某些实施方案中，治疗的有效量使得FmoPV滴度相对于未治疗的 对象降低〇. 5对数、1对数、2对数、3对数、4对数、5对数、6对数、7对数或10对数或更多。 降低FmoPV的滴度、数量或总载量的益处包括，但不限于，感染症状的严重度更低、感染症 状更少、与感染相关的疾病的病程的缩短、和预防继发于FmoPV感染的感染的发生或减少 其疾病严重度。
[0040] 如本文所用，术语"片段"在核酸序列的背景下是指包含来自亲本序列的至少2个 或至少3个连续核苷酸的核苷酸序列。在一个具体实施方案中，该术语是指来自亲本序列 的2至30、5至30、10至60、25至100、150至300或更多个连续核苷酸的核苷酸序列。在 另一个实施方案中，该术语是指亲本序列的至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、 65、70、75、80、85、90、95、100、110、125、150、175、200、250、275、300、325、350、375、400、425、 450或475个连续核苷酸的核苷酸序列。
[0041] 如本文所用，术语"片段"在氨基酸序列的背景下是指包含来自亲本序列的至少2 个连续氨基酸残基的氨基酸序列。在一个具体实施方案中，该术语是指来自亲本序列的2 至30、5至30、10至60、25至100、150至300或更多个连续氨基酸残基的氨基酸序列。在 另一个实施方案中，该术语是指亲本序列的至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、 65、70、75、80、85、90、95、100、110、125、150、175、200、250、275、300、325、350、375、400、425、 450或475个连续氨基酸残基的氨基酸序列。
[0042] 如本文所用，术语"异源的"是指没有发现与另一个单元天然相关的单元。例如， 如果两个核苷酸序列在自然界中没有被发现彼此相关联，则第一核苷酸序列被称为对于第 二核苷酸序列是异源的。
[0043] 如本文所用，术语"宿主细胞"是指任何类型的细胞，例如，原代细胞或来自细胞系 的细胞。在具体实施方案中，术语"宿主细胞"是指用核酸分子转染的细胞和此类细胞的子 代或潜在后代。此类细胞的后代可以不与用核酸分子转染的亲代细胞相同，这是由于在随 后的传代或核酸分子整合进入宿主细胞基因组时可能发生的突变或环境影响。
[0044] 如本文所用，术语"组合"在向对象施用一种或多种治疗的背景下是指使用多于一 种治疗。术语"组合"的使用不限制向对象施用治疗的顺序。第一治疗可以在向对象施用 第二治疗之前（例如，5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小 时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周、或12周之前）、 同时、或者之后（例如，5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12 小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周、或12周之后） 施用。
[0045] 如本文所用，术语"感染"意指病毒在细胞或对象中侵入、增殖和/或存在。在一 个实施方案中，感染是"活跃"感染，即，其中病毒在细胞或对象中复制。此类感染的特征在 于病毒从病毒初始感染的细胞、组织和/或器官向其它细胞、组织和/或器官传播。感染也 可以是潜伏感染，即，其中病毒不复制的感染。在某些实施方案中，感染是指由细胞或对象 中病毒的存在，或通过病毒侵入细胞或对象而导致的病理学状态。
[0046] 如本文所用，术语"FmoPV疾病"和涉及与FmoPV感染有关的疾病的短语是指由 FmoPV在细胞或对象中存在或FmoPV侵入细胞或对象导致的病理学状态。在某些实施方案 中，该术语是指由FmoPV引起的肾病。
[0047] 如本文所用，术语"分离的"在核酸的背景下是与核酸分子的天然来源中存在的其 它核酸分子分离的核酸分子。此外，"分离的"核酸分子，诸如cDNA分子，当通过重组技术生 产时可基本不含其它细胞材料或培养基，当通过化学法合成时可基本不含化学前体或其它 化学物质；然而，"分离的"排除克隆文库诸如cDNA文库的成员。在一个具体实施方案中，本 文所述核酸是分离的。在另一个具体实施方案中，本文所述的抗体是分离的。用语"基本上 不含其它细胞材料"包括制备核酸分子，其中将所述核酸分子与其从中分离或重组产生的 细胞的细胞组分分离。因此，基本上不含细胞材料的核酸分子包括具有小于约30%、20%、 10%或5% (以干重计）的异源核酸分子或其它细胞组分的制剂。当核酸分子是重组产生 的时，其还优选基本上不含培养基，即培养基代表小于约20 %、10 %、或5 %的核酸分子制 剂的体积。当核酸分子通过化学合成产生时，其优选基本上不含化学前体或其它化学物，即 将其与参与核酸分子的合成的化学前体或其它化学物分离开。因此，此类核酸分子的制剂 除了目标核酸分子以外具有小于约30%、20%、10%、5% (以干重计）的化学前体或化合 物。
[0048] 如本文所用，短语"感染复数"或"Μ0Ι"是每个受感染细胞的病毒的平均数。MOI 通过添加的病毒数（添加的ml X噬斑形成单位（pfu))除以添加的细胞数（添加的ml X 细胞/ml)来确定。
[0049] 如本文所用，术语"核酸"和"核苷酸"是指脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核酸，核糖 核苷酸，和核糖核酸及其聚合形式，并且包括单链或双链形式。在某些实施方案中，此类术 语包括天然核苷酸的已知类似物，例如，肽核酸（"PNA")，其与参考核酸具有相似的结合特 性。在一些实施方案中，此类术语是指脱氧核糖核酸（例如，cDNA或DNA)。在其它实施方 案中，此类术语是指核糖核酸（例如，mDNA或RNA)。
[0050] 如本文所用，术语"预防"在向对象施用（一种或多种）治疗的背景下是指由施用 治疗或治疗组合导致的预防效果。在一个具体实施方案中，术语"预防"在向对象施用（一 种或多种）治疗以预防疾病的背景下是指由施用治疗或治疗组合导致的以下效果中的一 种或多种：（i)抑制或降低疾病或其症状的发展或发作；（ii)抑制或降低疾病或其相关 症状的复发；和（iii)抑制或降低病原体感染和/或复制。在其它具体实施方案中，术语 "预防"在向对象施用（一种或多种）治疗以预防FmoPV疾病的背景下是指由施用治疗或治 疗组合导致的以下效果中的一种或多种：（i)抑制或降低FmoPV疾病或其症状的发展或发 作；（ii)抑制或降低FmoPV疾病或其相关症状的复发；和（iii)抑制或降低FmoPV感染和 /或复制。
[0051] 在另一个具体实施方案中，术语"预防"在向对象施用（一种或多种）治疗以预 防FmoPV感染的背景下是指由施用治疗或治疗组合导致的以下效果中的一种或多种：（i) 降低或抑制FmoPV从一个细胞传播到另一个细胞；（ii)降低或抑制FmoPV从一个器官或 组织传播到另一个器官或组织；和/或（iii)降低或抑制FmoPV从一个器官或组织的区 域传播到另一个器官或组织的区域（例如，降低FmoPV从上呼吸道传播到下呼吸道）。
[0052] 如本文所用，术语"对象"或"患者"可互换地用于指动物（例如，猫，狗，鸟，爬行动 物和哺乳动物）。在一个具体实施方案中，对象是猫。在另一个实施方案中，对象是包括非 灵长类的哺乳动物（例如，骆驼、驴、斑马、奶牛、猪、马、山羊、绵羊、猫、狗、大鼠和小鼠）和 灵长类（例如，猴、黑猩猩和人类）。在另一个实施方案中，对象是非人类的哺乳动物。在另 一个实施方案中，对象是人类。
[0053] 如本文所用，术语"治疗"可以是指可用于防止或处理病毒感染或与之相关的疾病 或症状的任何一种或多种方案、方法、化合物、组合物、制剂和/或试剂。在某些实施方案 中，术语"治疗"是指生物治疗、支持治疗和/或其它治疗，其用于处理或预防本领域技术人 员已知的病毒感染或与之相关的疾病或症状。在一些实施方案中，术语"治疗"是指免疫原 性组合物（例如，FmoPV疫苗）。
[0054] 如本文所用，术语"治疗"在向对象施用治疗的背景下是指从施用治疗或治疗组 合引起的有益的或治疗性的效果。在具体实施方案中，该术语是指由施用治疗或治疗组合 引起的下列效果中的1、2、3、4、5种或更多种：（i)降低或改善疾病或与之相关症状的严重 度；（ii)降低疾病或与之相关症状的持续时间；（iii)预防疾病或与之相关症状的发展； (iv)疾病或与之相关症状的退化；(V)预防疾病或与之相关症状的发展或发作；(vi)预防 疾病或与之相关症状的复发；(vii)降低或预防病原体从一个细胞传播到另一个细胞，一 个组织传播到另一个组织，或一个器官传播到另一个器官；(viii)预防或降低病原体从一 个对象传播/传递到另一个对象；（ix)降低与疾病相关的器官衰竭；(X)减少对象住院治 疗；(xi)缩短住院治疗的时间；(xii)增加具有之相关疾病的患者的存活率；(xiii)消除 疾病；(Xiv)抑制或降低病原体复制；(XV)降低病原体数目；和（xvi)增强、改善、补充、互 补或增加另一种疗法的预防或治疗效果。
[0055] 如本文所用，在一些实施方案中，术语"野生型"在病毒的背景下是指流行的、循环 的和天然产生典型疾病爆发的病毒类型。
[0056] 4.附图简述 图1显示了 FmoPV和其它麻瘆病毒的基因组组织。基因被显示为按比例绘制的框。对 于P基因，在标记"P"的框上且在线末端具有字母V的第一线代表V⑶S的区域，在线末端 具有字母C的第二线代表C CDS。
[0057] 图 2 是 FmoPV 761U Cats/Hong Kong/2009 的 16050 bp 核苷酸序列。
[0058] 图 3 是 FmoPV 776U Cats/Hong Kong/2009 的 16050 bp 核苷酸序列。
[0059] 图 4 是 FmoPV M252A Cats/Hong Kong/2009 的 16050 bp 核苷酸序列。
[0060] 图5显示了 FmoPV和其它麻瘆病毒的N蛋白的多重比对。麻瘆病毒中的保守 M (S，T) L基序和副粘病毒中的三个保守基序在空心框中用实线边界标记，报道的共有序列 在比对上方表示（其中X代表任何氨基酸残基，0代表芳族氨基酸残基）。对于每种蛋白的 氣基酸残基编号显不在每个序列的右边。点表不相同的残基，虚线表不空位。NES在具有点 划线边界的空心框中，NLS在具有虚线边界的空心框中。
[0061] 图6A-D.小图A显示FmoPV对CRFK细胞的细胞病变效应。空心正方形显示巨细 胞的形成。小图B和C显示使用来自FmoPV的重组N蛋白免疫的豚鼠的血清在未感染和感 染的CRFK细胞中的间接免疫荧光抗原检测，显示在FmoPV感染的CRFK细胞中的特定苹果 绿细胞质荧光。小图D是感染的CRFK细胞培养上清液的电子显微镜检查，显示具有爆发包 膜和副粘病毒中螺旋形N的典型的"鲱鱼骨（herring bone)"外观的有包膜病毒。
[0062] 图7是FmoPV的N、P、M、F、A和L氨基酸序列的系统发生分析。用从1000个树计 算并在中点生根的的引导程序值通过最大似然法构建树。刻度条表明对应于〇. 5个取代/ 位点的枝长。来自FmoPV的三株分别命名为761U、776U、M252A。其它病毒的名称和登录号 列于下表3中。
[0063] 图8本研宄中从猫鉴定的副粘病毒的L基因的72-bp片段的氨基酸序列的系统 发生分析。该树通过邻接法构建。刻度条表明对应于2个氨基酸差异/序列的枝长。基因 组序列测定的编号为761U、776U和M252A的来自流浪猫的三个毒株以粗体显示。RSV，呼 吸道合胞病毒（U39661) ; DmoPV,海豚麻瘆病毒（NC_005283) ; PprPV, Peste-des-petits 反刍动物病毒（NC_006383); MeaPV，麻瘆病毒（NC_001498); CdiPV，犬瘟热病毒 (NC_001921) ; MosPV,莫斯曼病毒（NCJ)O5339) ; NarPV, Nariva 病毒（FJ36M97); ThkPV3, Tuhoko 病毒 3 (⑶ 128082) ; ThkPV2, Tuhoko 病毒 2 (GU128081); ThkPV, Tuhoko 病毒 1 (⑶ 128080); JPV, J-病毒（NC_007454); BeiPV,贝隆病毒（NC_007803); NipPV, 尼帕病毒（NC_002728); HenPV,亨德拉病毒（NC_001906); FdlPV, Fer-de-lance 病毒 (NC_005084); SenPV,仙台病毒（NC_001552); HpiPV-I,人副流感病毒 I (NC_003461)。
[0064] 图9显示了用针对纯化（His)6-标记的重组FmoPV N蛋白抗原的流浪猫血清的 Western印迹分析。也显示了 FmoPV的对应尿液样品的RT-PCR结果。
[0065] 图10A-F.小图A和B显示来自尿中检测到FmoPV的流浪猫和正常猫的H & E染 色的肾脏的组织切片，显示受感染的猫中小间隙中炎性细胞的聚集和肾小管变性。小图C 和D显示使用抗FmoPV N蛋白抗体阳性的豚鼠血清和免疫前豚鼠血清对尿中检测到FmoPV 的流浪猫的肾切片的免疫组织化学染色，显示出阳性的肾小管细胞。小图E和F显示使用 抗FmoPV N蛋白抗体阳性的豚鼠血清和免疫前豚鼠血清对FmoPV阳性的流浪猫的淋巴结切 片的免疫组织化学染色，显示出阳性的单核细胞。
[0066] 图IlA-B表示在小图A和B分别没有和有TIN的组织学证据的猫中cauxin免疫 组织化学染色石蜡包埋的肾切片的代表性图像。
[0067] 图12A-C显示对于以下的FmoPV感染的流浪猫的淋巴结的双重染色：(A)小鼠抗 人髓细胞/组织细胞抗原，然后用得克萨斯红缀合的山羊抗小鼠 IgG标记；(B)针对FmoPV 的N蛋白的豚鼠抗血清，随后为FITC缀合的兔抗豚鼠 IgG; (C)合并照片显示，两种抗原共 定位于细胞的细胞质中。
[0068] 5.发明详述 5. 1核酸 在一个方面，本发明提供了包含野生型或修饰的猫麻瘆病毒（"FmoPV"）或由其组成的 核酸序列。还提供了修饰的FmoPV基因区段（基因组RNA)或其互补序列（反基因组RNA)。
[0069] 在一个方面，本文描述了 FmoPV的完整核苷酸序列。在某些实施方案中，核苷酸序 列是Genbank登录号：JQ411014、JQ411015和JQ411016。JQ411014核苷酸序列显示于图2， 标记为FmoPV 761U Cats/Hong Kong/200LJQ411015核苷酸序列显示于图3,标记为FmoPV 776U Cats/Hong Kong/2009QJQ411016 核苷酸序列显示于图 4,标记为 FmoPV M252A Cats/ Hong Kong/2009〇
[0070] 在其它方面，本文描述了 FmoPV核苷酸序列的互补序列、类似物、衍生物、或其片 段或部分。在某些实施方案中，在严格条件下，本文描述了与FmoPV的基因组的任何部分杂 交的核酸分子。在具体实施方案中，本文描述了适合用作引物的核酸分子，其由FmoPV的 核酸序列组成或包含FmoPV的核酸序列。在另一个实施方案中，本文描述了适合用作检测 FmoPV的杂交探针的核酸分子。引物和探针包含在用于检测来自FmoPV的野生型、天然或人 工变体、类似物或衍生物的核酸分子或蛋白的试剂盒中。
[0071] 本文描述了由于一个或多个自然发生的突变（包括但不限于可能导致或可能不 会导致表型改变的对基因组序列的点突变、重排、插入、缺失等）具有不同于Genbank登录 号JQ411014、JQ411015和JQ411016的基因组序列的序列的FmoPV的自然变体。优选地，变 体包括基因组中 1-5、6-10、11-10、20-40、40-60、60-100、100-500、500-1000、1000-2000 个 核酸变化。在某些实施方案中，FmoPV的基因组序列的突变导致相对于FmoPV的野生型基 因组序列的重排、插入和/或缺失。
[0072] 在某些实施方案中，本文所述的核酸序列是载体的部分或并入载体。在一个具 体实施方案中，本文所述的核酸序列是是载体的部分或并入载体，其促进修饰的FmoPV基 因区段或其互补序列的产生。在一个实施方案中，本文所述的核酸序列是PDZ载体的部分 或并入pDZ载体（对于涉及pDZ载体的信息，参见例如，Quinlivan等人，2005，J. of Virology 79:8431 - 8439)。在另一个实施方案中，本文所述的核酸序列是pHW2000载体 的部分或并入PHW2000载体（对于涉及pHW2000载体的信息，参见例如，Hoffmann等人， 2000，Proc Natl Acad Sci U S A. 97(11) :6108-13)。在另一个实施方案中，本文所述的 核酸序列是PAD3000载体的部分或并入pAD3000载体（对于涉及pAD3000载体的信息，参 见例如，Hoffmann 等人，2000，Proc Natl Acad Sci U S A. 97(11) :6108-13)。在另一 个实施方案中，本文所述的核酸序列是PAD4000载体的部分或并入pAD4000载体（对于涉 及PAD4000载体的信息，参见例如，Wang等人，2007，J. of Virology 4:102)。在一个实 施方案中，本文所述的核酸序列是以下章节6中载体的部分或并入以下章节6中载体。
[0073] 用于产生或使用核酸的技术将采用，除非另有说明，分子生物学和重组DNA操作 和生产的通常常规技术。技术人员已知的任何克隆技术可用于装配本文所述的核酸和必 要时突变核苷酸。此类技术是众所周知的，并对于技术人员可获得自实验室手册，诸如 Sambrook and Russell, Molecular Cloning ：A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (2001)。具体地，聚 合酶链式反应，限制性酶，连接酶，诱变引物和载体中核酸片段的扩增可用来产生本文所述 的核酸的个别元件，然后装配它们。
[0074] 在一些实施方案中，将本文所述的核酸序列引入（例如转染至）基质，诸如宿主细 胞或含胚蛋。因此，在一些实施方案中，本文提供了包含本文所述的核酸序列的基质（例 如，宿主细胞或蛋）。在其它实施方案中，将本文所述的作为载体的部分或并入载体的核酸 序列引入（例如转染至）基质，诸如宿主细胞或含胚蛋。因此，在一些实施方案中，本文提供 了包含本文所述的作为载体的部分或并入载体的核酸序列的基质（例如，宿主细胞或蛋）。 在某些实施方案中，本文提供了用含有FmoPV核酸序列的载体转化的细胞系。在某些实施 方案中，本文提供了含有包含FmoPV核酸序列的载体的的转基因动物。
[0075] 在某些实施方案中，FmoPV核酸用于针对FmoPV感染的诊断测定中。具体地，诊断 测定是用于检测FmoPV、其天然或人工变体、类似物或衍生物的定量测定。在某些实施方案 中，定量测定是PCR或RT-PCR。在某些实施方案中，FmoPV核酸是在诊断试剂盒中分开的容 器中。
[0076] 5.2 蛋白 FmoPV基因区段的开放阅读框可以使用标准分子生物学和病毒学技术来确定。本文 提供了由包含FmoPV核酸序列的FmoPV核酸分子表达的FmoPV多肽。在某些实施方案中， FmoPV蛋白是。在某些实施方案中，FmoPV抗原是片段或全长的N、P/V/C(P)、P/V/CV(V)、P/ VC(C)、M、F、H和L蛋白。本文还描述了由衍生自FmoPV或其天然变体的基因组的病毒载体 编码的重组或嵌合病毒。
[0077] 在另一个具体实施方案中，本文描述了嵌合FmoPV病毒，其进一步包含异源核苷 酸序列。在某些实施方案中，嵌合病毒可由核苷酸序列编码，其中已向基因组添加了异源核 苷酸序列，或者其中内源或天然核苷酸序列已被异源核苷酸序列取代。
[0078] 在某些实施方案中，嵌合病毒由进一步包含异源核苷酸序列的载体编码。根据本 发明，嵌合病毒由可包含或不包含对病毒基因组非天然的核酸的病毒载体编码。根据本发 明，嵌合病毒由病毒载体编码，其中已添加、插入异源核苷酸序列或已用天然或非天然序列 取代。根据本发明，嵌合病毒可由来源于FmoPV的不同毒株或变体的核苷酸序列编码。具 体地，嵌合病毒由核苷酸序列编码，所述核苷酸序列编码来源于FmoPV的不同毒株或变体 的抗原性多肽。
[0079] 嵌合病毒对于生产针对两种或多种病毒保护的重组疫苗特别有用（Tao等人，J 72:2955-2961; Durbin 等人，2000，7； 74:6821-6831; Skiadopoulos 等 人，1998，7； 72:1762-1768; Teng等人，2000，7； 74:9317-9321)。例 如，可以设想，表达FmoPV和FmoPV变体的一种或多种蛋白的载体将保护接种了此类载体的 对象免受FmoPV和FmoPV变体两者的感染。减毒和复制缺陷型病毒可以与活疫苗一样用于 接种目的。
[0080] 根据本发明，待引入编码本发明重组或嵌合病毒的病毒载体中的异源序列包括从 FmoPV的不同毒株或变体获得或衍生的序列。
[0081] 在某些实施方案中，本发明的嵌合或重组病毒由来源于病毒基因组（其中一个或 多个序列、基因间区、末端序列或ORF的部分或整体已被异源或非天然序列取代）的病毒载 体编码。在本发明的某些实施方案中，本发明的嵌合病毒由来源于病毒基因组（其中一种 或多种异源序列已被插入或添加到载体中）的病毒载体编码。
[0082] 对于FmoPV异源的任何核苷酸序列可以包括在本文所述的修饰FmoPV基因区段 中。在某些实施方案中，异源核苷酸序列是8至100个核苷酸长，15至100个核苷酸长，25 至100个核苷酸长，50至200个核苷酸长，50至400个核苷酸长，200至500个核苷酸长，或 400至600个核苷酸长，500至800个核苷酸长。在其它实施方案中，异源核苷酸序列是750 至900个核苷酸长，800至100个核苷酸长，850至1000个核苷酸长，900至1200个核苷酸 长，1000至1200个核苷酸的长度，1000至1500个核苷酸长或10至1500个核苷酸长。在 一些实施方案中，异源核苷酸编码肽或多肽，所述肽或多肽是5至10个氨基酸长，10至25 个氨基酸长，25至50个氨基酸长，50至100个氨基酸长，100至150氨基酸长，150至200 个氨基酸长，200至250个氨基酸长，250至300个氨基酸长，300至400个氨基酸长，或500 个或更多个氨基酸长。在一些实施方案中，异源核苷酸编码长度不超过500个氨基酸的多 肽。在具体实施方案中，异源核苷酸序列不含终止密码子。在某些实施方案中，异源核苷酸 序列是密码子优化的。用于密码子优化技术是本领域已知的，并且可以应用以便密码子优 化异源核苷酸序列。
[0083] 在一个实施方案中，异源核苷酸序列编码任何感染性病原体的抗原，或与能够引 发免疫应答的任何疾病相关的抗原。在一个具体实施方案中，抗原是糖蛋白。在某些实施 方案中，异源核苷酸序列编码病毒抗原。在其它实施方案中，病毒抗原是来自除了 FmoPV以 外的病毒的抗原。
[0084] 在具体实施方案中，本文所述的FmoPV是减毒的。在一个具体实施方案中，FmoPV 是减毒的，使得病毒至少部分保留感染性并可在体内复制，但是仅产生低滴度，其导致非致 病性的感染的亚临床水平。此类减毒病毒尤其适合于本文所述实施方案，其中病毒或其免 疫原组合物施用于对象以诱导免疫应答。
[0085] 在一些实施方案中，本文所述的FmoPV包含在修饰FmoPV基因区段中的一个或多 个减毒突变。在一些实施方案中，本文所述的FmoPV包含在互补FmoPV基因区段中的一个 或多个减毒突变。在某些实施方案中，本文所述的FmoPV包含在两个、三个或更多个互补 FmoPV基因区段中的一个或多个减毒突变。在一些实施方案中，本文所述的FmoPV包含在修 饰FmoPV基因区段中的一个或多个减毒突变和在互补FmoPV基因区段中的一个或多个减毒 突变。
[0086] 病毒载体的选择可取决于待治疗或保护免受病毒感染的对象的物种。如果对象是 猫科动物，则减毒FmoPV可用来提供抗原序列。
[0087] 根据本发明，可对病毒载体进行工程改造，以提供针对FmoPV、其天然或人工变体、 类似物或衍生物的感染赋予保护作用的抗原序列。可对病毒载体进行工程改造，以提供一 种、两种、三种或更多种抗原序列。根据本发明，抗原序列可来源于相同病毒、相同种类病毒 的不同毒株或变体、或不同病毒。
[0088] 根据本发明获得的表达产物和/或重组或嵌合病毒颗粒可有利地应用在疫苗制 剂中。可对表达产物和嵌合病毒颗粒进行工程改造，以产生针对范围广泛的病原体的疫苗， 所述病原体包括病毒和细菌抗原、肿瘤抗原、变应原抗原和参与自身免疫病的自身抗原。具 体地，可对本发明的嵌合病毒颗粒进行工程改造，以产生用于保护对象免受FmoPV、其天然 或人工变体、类似物或衍生物感染的疫苗。
[0089] 在另一个方面，FmoPV的基因组序列的突变导致FmoPV蛋白的改变。在某些实施 方案中，FmoPV的基因组序列的突变导致FmoPV蛋白中少于25、20、15、10、5、4、3、或2个氨 基酸取代。
[0090] 保守或非保守氨基酸取代可在一个或多个氨基酸残基进行。在优选实施方案中， 变体具有在一个或多个预测的非必需氨基酸残基（即对于病毒生物活性例如感染性、复制 性、蛋白合成能力、装配能力和细胞毒性效应的表达不是关键的氨基酸残基）上进行的保 守氨基酸取代。在其它实施方案中，变体具有在一个或多个预测的非必需氨基酸残基（即 对于病毒生物活性例如感染性、复制能力、蛋白合成能力、装配能力和细胞毒性效应的表达 不是关键的氨基酸残基）上进行的非保守氨基酸取代。在其它实施方案中，在必需的氨基 酸残基（即对于病毒生物活性例如感染性、复制能力、蛋白合成能力、装配能力和细胞毒性 效应的表达关键的氨基酸残基）上进行氨基酸取代。
[0091] "保守氨基酸取代"是其中氨基酸残基被侧链电荷相似的氨基酸残基替代的取代。 "非保守氨基酸取代"是其中氨基酸残基被侧链电荷相反的氨基酸残基替代的取代。侧链电 荷相似的氨基酸残基的家族在本领域是已定义的。遗传编码的氨基酸可被分为四个家族： (1)酸性=天冬氨酸、谷氨酸；（2)碱性=赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性=丙氨酸、缬 氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；(4)无电荷极性=甘氨酸、天 冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。以相似的方式，全部氨基酸可被分类 为⑴酸性=天冬氨酸、谷氨酸；⑵碱性=赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)脂族=甘氨酸、 丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸，且丝氨酸和苏氨酸任选被单独分类为 脂族-羟基；(4)芳族=苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸；(5)酰胺=天冬酰胺、谷氨酰胺；(6)含 硫=半胱氨酸和甲硫氨酸。（参见例如Biochemistry, 4th ed·，Ed. by L. Stryer, WH Freeman and Co. :1995)〇
[0092] 本发明进一步涉及突变FmoPV肽。在一个实施方案中，突变可沿FmoPV或其变体的 所有或部分编码序列随机引入，诸如通过饱和诱变，可筛选所得突变体的生物活性以鉴定 保留活性的突变体。也可使用本领域已知的诱变技术，包括但不限于定点诱变、化学诱变、 体外定点诱变，使用例如QuikChange定点诱变试剂盒（Stratagene)等。此类修饰的非限 制性实例包括氨基酸取代为半胱氨酸而形成二硫键；氨基酸取代为酪氨酸并随后化学处理 多肽以形成二酪氨酸键，如本文中详细公开的；一个或多个氨基酸取代和/或生物或化学 修饰以产生小分子（底物或抑制剂）结合口袋；和/或引入侧链特异性标记（例如以表征 分子相互作用或捕获蛋白-蛋白相互作用伴侣）。在一个具体实施方案中，生物修饰包括烷 基化、磷酸化、硫酸化、氧化或还原、ADP-核糖基化、羟基化、糖基化、葡糖磷脂酰肌醇加成、 泛素化。在另一个具体实施方案中，化学修饰包括改变重组病毒的电荷。在又一个实施方 案中，正电荷或负电荷被化学加入到氨基酸残基中，其中带电荷的氨基酸残基被修饰成不 带电荷的残基。
[0093] 5· 3重组FMOPV的构建 本领域技术人员已知的技术可用于产生本文所述的含有修饰的FmoPV基因区段的重 组FmoPV。例如，反向遗传学技术可以用于产生此类FmoPV。简而言之，反向遗传学技术通 常涉及制备含有负链病毒RNA的非编码区域的合成重组病毒RNA，所述非编码区域对病毒 聚合酶识别和产生成熟病毒体需要的包装信号是必要的。重组RNA从重组DNA模板合成并 在体外用纯化的病毒聚合酶复合物重构以形成重组核糖核蛋白（RNP)，其可以用于转染细 胞。如果在合成RNA在体外或体内转录过程中存在病毒聚合酶蛋白，则实现更有效的转染。 合成重组RNP可以被拯救进入感染性病毒颗粒。
[0094] 或者，无辅助质粒技术（helper-free plasmid technology)可用于产生含有修饰 的FmoPV基因区段的重组FmoPV。简而言之，病毒区段的全长cDNA用PCR以包括独特限制 性位点的引物来扩增，所述限制性位点允许PCR产物插入质粒载体中。质粒载体设计为使 得精确的负链（vRNA方向）转录得到表达。例如，质粒载体可以设计为将PCR产物置于截 短的人RNA聚合酶I启动子和丁型肝炎病毒核糖体序列之间，从而使得从聚合酶I启动子 来产生精确的负链（ VRNA方向）转录物。包含每个病毒区段的分离的质粒载体和包含必需 病毒蛋白的表达载体可以转染进细胞从而导致产生重组病毒颗粒。在另一个实施方案中， 可以使用表达病毒基因组RNA和编码必需病毒蛋白的mRNA两者的质粒载体。
[0095] 5. 4. FMOPV 的增殖 本文所述的FmoPV可以在任何基质中增殖，其允许病毒生长至允许使用本文所述的病 毒的滴度。在一个实施方案中，该基质允许本文所述的FmoPV生长至与对应的野生型病毒 测定的滴度相当的滴度。
[0096] 本文所述的FmoPV可以生长在易受病毒感染的宿主细胞（例如，猫、禽类细胞、鸡 细胞等）、含胚蛋或动物（例如，鸟）中。宿主细胞的具体实例包括Vero细胞、MDCK细胞、 MBCK细胞、COS细胞、293细胞、293T细胞、A549细胞、MDBK细胞等。此类方法是本领域技 术人员众所周知的。在一个具体实施方案中，本文所述的FmoPV可以在细胞系中增殖。在 另一个实施方案中，本文所述的FmoPV在鸡细胞或含胚蛋中增殖。代表性的鸡细胞包括，但 不限于，鸡胚胎成纤维细胞和鸡胚肾细胞。
[0097] 对于病毒分离，本文所述的FmoPV可以从细胞培养液中去除并从细胞组分中分 离，典型地通过众所周知的净化过程，例如，梯度离心和柱色谱，并可以根据需要使用本领 域技术人员众所周知的程序来进一步纯化，例如噬菌斑分析。
[0098] 5. 5组合物和施用途径 可以将本文所述的FmoPV并入组合物中。在一个具体实施方案中，组合物是药物组合 物，诸如免疫原性组合物（例如，疫苗制剂）。本文提供的药物组合物可以是允许将组合物 施用至对象的任何形式。在一个具体实施方案中，药物组合物适合用于兽医和/或人施用。 组合物可以用于预防和/或治疗FmoPV感染的方法中。组合物也可以用于预防和/或治疗 FmoPV疾病的方法中。组合物也可以用于引发针对一种或多种特定抗原的免疫应答的方法 中或将特定蛋白递送至对象的方法中。
[0099] 在一个实施方案中，药物组合物包含FmoPV与药学可接受的载体的混合物。在一 些实施方案中，除了 FmoPV之外，药物组合物还可以包含一种或多种其它疗法。在具体实施 方案中，掺入药物组合物（例如，免疫原性组合物，诸如疫苗）的本文所述的FmoPV是活病 毒。用于施用于对象的包含活FmoPV的免疫原性组合物可以是优选的，因为病毒在对象中 的增殖可以导致与自然感染发生的种类和量级相似的种类和量级的延长刺激，并且因此赋 予显著持久的免疫力。
[0100] 在一些实施方案中，掺入药物组合物（例如，免疫原性组合物，诸如疫苗）的本文 所述的FmoPV是灭活的。本领域技术人员已知的技术可以用于灭活本文所述的FmoPV。
[0101] 在具体实施方案中，本文所述的免疫原性组合物是单价制剂。在其它实施方案中， 本文所述的免疫原性组合物是多价制剂。
[0102] 如本文所用，术语"药学可接受的"是指得到联邦政府或州政府的管理机构批准， 或被列入美国药典或其它通常公认的药典中，用于在动物中、更具体在人类中使用。术语 "载体"是指与药物组合物一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。盐水溶液和葡萄糖 和甘油水溶液也可用作液体载体，尤其是用于可注射溶液。合适的赋形剂包括淀粉、葡萄 糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、石灰石、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯 化钠、脱脂奶粉、甘油、丙稀、乙二醇、水、乙醇等。合适的药物载体的实例在E. W. Martin 的''Remington's Pharmaceutical Sciences" 中描述。
[0103] 在某些实施方案中，可生物降解的聚合物，诸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙二醇 (PEG化）、聚甲基丙烯酸酯聚合物、聚交酯、丙交酯-乙交酯共聚物、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚 原酸酯和聚乳酸，可以用作载体。脂质体或胶束也可以用作药学可接受的载体。根据本领 域技人员已知的方法，例如，如美国专利号4, 522, 811所述制备这些。
[0104] 在一个具体实施方案中，将药物组合物配制成适于施用于对象的预期途径。例如， 可以将药物组合物可以配制成适于胃肠外、口服、皮内、鼻内、经皮、肺、结肠直肠、腹膜内和 直肠施用。在一个具体实施方案中，可以将药物组合物配制用于静脉内、口服、腹膜内、鼻 内、气管内、皮下、肌内、局部、皮内、经皮或经肺施用。
[0105] 在某些实施方案中，本文所述的组合物包含佐剂，或与佐剂组合施用。可以在施用 组合物之前、同时或、之后施用与本文所述的组合物组合施用的佐剂。在具体实施方案中， 本文所述的灭活病毒免疫原性组合物包含一种或多种佐剂。在一些实施方案中，术语"佐 剂"是指当与本文所述组合物结合或作为其部分施用时，增加、增强和/或加强针对FmoPV 病毒的免疫应答，但当单独施用化合物时，不产生针对病毒的免疫应答的化合物。在一些实 施方案中，佐剂生成针对FmoPV的免疫应答，且不会产生过敏或其它不良反应。佐剂可以通 过几种机制，包括，例如，淋巴细胞募集，B和/或T细胞的刺激，和巨噬细胞的刺激来增强 免疫应答。
[0106] 佐剂的具体实例包括，但不限于，铝盐（alum)(诸如氢氧化铝、磷酸铝和硫酸铝）、 3脱-0-酰化单磷酰脂质A(MPL)(参见GB 2220211)和QS21 (参见Kensil等人，in Vaccine Design:The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman, Plenum Press，NY，1995);美国专利号5,057,540)。在一些实施方案中，佐剂是弗氏佐剂（完全 或不完全）。其它佐剂是水包油乳剂（诸如角鲨烯或花生油），任选地与免疫刺激剂，诸如 单磷酰脂质 A 组合（参见 Stoute 等人，N. Engl. J. Med. 336，86-91 (1997))。另一种 佐剂是CpG (Bioworld Today, Nov. 15，1998)。此类佐剂可与或不与其它特异性免疫刺 激剂诸如MPL或3-DMP、QS21、聚合的或单体氨基酸诸如聚谷氨酸或聚赖氨酸一起使用。
[0107] 本文所述的药物组合物可以连同施用说明书包括在容器、包装或分配器中。
[0108] 在一个具体实施方案中，本发明的重组N蛋白具有抗原性，使它们适合于在免疫 原性组合物中使用。实施例7中证明了这些重组N蛋白的抗原性。在来自FmoPV RT-PCR 阳性的56只猫和FmoPV RT-PCR阴性的40只猫的测试血清中，通过Western印迹分析，分 别49 (76. 7%)和78 (19. 4%)对于针对FmoPV的N蛋白的IgG是阳性的（ρ〈0· 0001)。参见 图9,并参见下表6。在来自FmoPV RT-PCR阳性的56只猫的测试血清中，只有5个（8. 9%) 对于针对FmoPV的N蛋白的IgM是阳性的。
[0109] 在图9(用针对纯化的（His)6-标签的重组FmoPV N蛋白抗原的流浪猫血清的 Western印迹分析）中，在显示的六份猫血清样品中的三份中检测道约69 kDa的突出免疫 反应蛋白条带，与重组蛋白的68. 7 kDa的预期大小一致，表明重组FmoPV N蛋白和血清抗 体之间的抗原-抗体相互作用。也显示了对应尿液样品针对FmoPV的RT-PCR结果。表6 显示了本研宄中的RT-PCR阳性流浪猫的FmoPV病毒载量和抗体水平。
[0110] 表 6
【权利要求】
1. 分离的核酸，其包含图2的核巧酸序列。
2. 分离的核酸，其包含图3的核巧酸序列。
3. 分离的核酸，其包含图4的核巧酸序列。
4. 来自猫麻疹病毒的分离的多肤，其包含图5的命名为FmoPV 761U的序列。
5. 来自猫麻疹病毒的分离的多肤，其包含图5中命名为FmoPV 77抓的序列。
6. 来自猫麻疹病毒的分离的多肤，其包含图5中命名为FmoPV M252A的序列。
7. 载体，其包含权利要求1、2或3的分离的核酸。
8. 权利要求7的载体，其包含与所述分离的核酸可操作地连接的启动子。
9. 宿主细胞，其包含权利要求7或8的载体。
10. 免疫原性组合物，其包含权利要求4、5或6的分离的多肤和药学可接受的载体。
11. 权利要求10的免疫原性组合物，其进一步包含佐剂。
12. 产生权利要求4、5或6的多肤的方法，其包括培养表达所述多肤的宿主细胞和回收 如此产生的多肤的步骤。
13. 诱导哺乳动物中的免疫力的方法，其包括将权利要求10或11的免疫原性组合物施 用于所述哺乳动物的步骤。
14. 增强哺乳动物中的免疫应答的方法，其包括将权利要求10或11的免疫原性组合物 施用于猫科动物的步骤。
15. 抗体分子，其具有对猫麻疹病毒的特异性。
16. 抗体分子，其具有对权利要求4的分离的多肤的特异性。
17. 抗体分子，其具有对权利要求5的分离的多肤的特异性。
18. 抗体分子，其具有对权利要求6的分离的多肤的特异性。
19. 治疗猫肾小管间质性肾炎的方法，其包括施用治疗有效量的权利要求15、16、17或 18的抗体分子。
20. 诊断猫科动物中的肾脏疾病的方法，其包括W下步骤；从所述猫科动物获得样品， 将所述样品与针对猫麻疹病毒或来自猫麻疹病毒的蛋白片段特异性的抗体解育；和测量抗 体结合样品的量。
21. 引物，其具有核巧酸序列CAGAGACTTAATGAAATTTATGG。
22. 引物，其具有核巧酸序列CCACCCATCGGGTACTT。
23. 引物，其具有核巧酸序列ACGCGGATCCGATGTCTAGTCTA。
24. 引物，其具有核巧酸序列 CGGAATTCGGTTTTAGAAGGTCAGTA。
25. 在诊断猫科动物中的肾脏疾病的方法中使用的试剂盒，其包含权利要求21-24中 任一项的引物。
【文档编号】C07K14/12GK104471064SQ201380006012
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2013年1月21日 优先权日:2012年1月20日
【发明者】袁国勇, 胡钊逸, 刘嘉珮 申请人:中华人民共和国香港特别行政区政府, 港大科桥有限公司