包含新型蔗糖转运蛋白的重组细菌的制作方法
【专利摘要】本发明描述了能够代谢蔗糖的重组细菌。所述重组细菌在其基因组中或在至少一个重组构建体上包含编码具有蔗糖转运蛋白活性的多肽的新型核苷酸序列和编码具有蔗糖水解酶活性的多肽的核苷酸序列。这些核苷酸序列各自可操作地连接至相同或不同的启动子。还描述了能够代谢蔗糖以产生甘油和/或甘油衍生的产物如1，3-丙二醇和3-羟基丙酸的重组细菌。
【专利说明】包含新型蔗糖转运蛋白的重组细菌
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物学和分子生物学领域。更具体地，本发明提供了包含新型蔗糖 转运蛋白的重组细菌和利用此类重组细菌来产生诸如甘油和甘油衍生产物的产物的方法。
【背景技术】
[0002] 许多在商业上有用的微生物使用葡萄糖作为其主要碳水化合物来源。然而，所开 发的用于产生商业上所需的产物的微生物利用葡萄糖的缺点是葡萄糖的高费用。使用蔗糖 和含有蔗糖和其它糖类的混合原料作为微生物生产系统的碳水化合物来源在商业上是更 加可取的，因为这些材料通常易于以较低成本获得。
[0003] 当生产微生物可利用混合原料中存在的任何蔗糖时，其可更高效地运行。因而，当 生产微生物不具有高效利用蔗糖作为主要碳源的能力时，其不能如此有效地工作。例如，细 菌细胞通常显示出偏好的糖利用，其中葡萄糖为最优选的。在含有糖混合物的人造培养基 中，葡萄糖通常先于其它糖类被完全代谢。此外，许多细菌缺少利用蔗糖的能力。例如，不 到50%的大肠杆菌（Escherichiacoli) (E.coli)菌株具有利用鹿糖的能力。因而，当生产 微生物不能利用蔗糖作为碳水化合物来源时，希望对该微生物进行工程改造而使得其可利 用蔗糖。
[0004] 已通过整合利用蔗糖的基因来工程改造而可利用蔗糖的重组细菌已有报道。 例如，Livshits等人（美国专利6, 960, 455)描述了利用大肠杆菌菌株来产生氨基酸， 所述菌株含有编码利用蔗糖的代谢途径的基因。此外，Olson等人（Appl.Microbiol. Biotechnol. 74 :1031-1040,2007)描述了携带负责蔗糖降解的基因的大肠杆菌菌株，其利 用蔗糖作为碳源来产生L-酪氨酸或L-苯丙氨酸。Eliot等人（美国专利申请2011/0136190 Al)描述了由蔗糖生产甘油和甘油衍生产物的重组细菌。
[0005] 然而，存在对以下细菌菌株的需要，所述菌株被新的蔗糖利用基因而工程化以利 用蔗糖并且具有改善的蔗糖利用能力。此外，存在着对能利用蔗糖作为碳源而产生甘油和 甘油衍生产物的细菌菌株的需要。
【发明内容】
[0006] 一个实施例提供了重组细菌，所述重组细菌在其基因组中或在至少一个重组构建 体上包含：
[0007] (a)编码具有蔗糖转运蛋白活性的多肽的核苷酸序列，基于ClustalW比对方法， 在与选自SEQIDN0:68、SEQIDN0:70、SEQIDN0:72、SEQIDN0:74、SEQIDN0:76、SEQ IDNO:78、SEQIDNO:80、SEQIDNO:82、SEQIDNO:84、SEQIDNO:86、SEQIDNO:88、 SEQIDNO:90、SEQIDNO:92和SEQIDNO:94的氨基酸序列进行比较时，所述多肽具有至 少95 %的序列同一性；和
[0008] (b)编码具有蔗糖水解酶活性的多肽的核苷酸序列；
[0009] 其中（a)和（b)各自可操作地连接至相同或不同的启动子，进一步地，其中所述重 组细菌能够代谢蔗糖。
[0010] 在一个实施例中，所述重组细菌产生1，3-丙二醇、甘油、和/或3-羟基丙酸。
[0011] 另一个实施例提供了一种由蔗糖制备甘油、1，3_丙二醇和/或3-羟基丙酸的方 法，所述方法包括：
[0012] a)在蔗糖的存在下，培养本文所公开的产生1，3_丙二醇、甘油、和/或3-羟基丙 酸的重组细菌；并且
[0013] b)任选地，回收所产生的甘油、1，3-丙二醇和/或3-羟基丙酸。
[0014] 简单的序列说明
[0015] 下列序列符合37C.F.R.L821L825 ( "对含有核酸序列和/或氨基酸序列公开 的专利申请的要求-序列规则")，并且符合世界知识产权组织（WIPO)标准ST. 25 (2009)和 EPO和PCT的序列表要求（规则5. 2和49. 5(abis)，以及行政指令的208节和附录C)。用 于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循如37C.F.R. § 1.822所示的规定。
[0016] M1
[0017]某闵和蛋白质SEQIDNOt总
[0018]
【权利要求】
1. 重组细菌，在其基因组中或在至少一个重组构建体上包含： (a) 编码具有蔗糖转运蛋白活性的多肽的核苷酸序列，基于Clustal W比对方法，在与 选自 SEQ ID N0:68、SEQ ID N0:70、SEQ ID N0:72、SEQ ID N0:74、SEQ ID N0:76、SEQ ID NO :78、SEQ ID NO :80、SEQ ID NO :82、SEQ ID NO :84、SEQ ID NO :86、SEQ ID NO :88、SEQ ID NO :90、SEQ ID NO :92和SEQ ID NO :94的氨基酸序列进行比较时，所述多肽具有至少 95 %的序列同一性；和 (b) 编码具有蔗糖水解酶活性的多肽的核苷酸序列； 其中（a)和（b)各自可操作地连接至相同或不同的启动子，进一步地，其中所述重组细 菌能够代谢蔗糖。
2. 根据权利要求1所述的细菌，其中所述具有蔗糖水解酶活性的多肽被归类为EC 3. 2. 1. 26 或 EC 2. 4. 1. 7。
3. 根据权利要求1所述的重组细菌，在其基因组中或在至少一个重组构建体上还包含 编码具有果糖激酶活性的多肽的核苷酸序列。
4. 根据权利要求3所述的细菌，其中所述具有果糖激酶活性的多肽被归类为EC 2. 7. 1. 4、EC 2. 7. 1. 3 或 EC 2. 7. 1. 1。
5. 根据权利要求1所述的重组细菌，其中所述细菌选自下列属：埃希氏菌属 (Escherichia)、克雷伯氏菌属（Klebsiella)、朽 1檬酸杆菌属（Citrobacter)和气杆菌属 (Aerobacter)〇
6. 根据权利要求5的所述的重组细菌，其中所述细菌为大肠杆菌（Escherichia coli)。
7. 根据权利要求1所述的重组细菌，其中所述重组细菌产生1，3-丙二醇、甘油和/或 3_羟基丙酸。
8. -种由蔗糖制备甘油、1，3-丙二醇和/或3-羟基丙酸的方法，包括： a) 在蔗糖的存在下培养权利要求7所述的重组细菌；以及 b) 任选地，回收所产生的甘油、1，3-丙二醇和/或3-羟基丙酸。
【文档编号】C07K14/245GK104302661SQ201380012400
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2013年3月5日 优先权日:2012年3月5日
【发明者】K.鲁伊布林格-贾斯, J-F.汤姆布, T.K.范戴克, Z.佑 申请人:纳幕尔杜邦公司