抗cxcr3抗体的制作方法

抗cxcr3抗体的制作方法
【专利摘要】本发明提供抗CXCR3抗体，以及使用这些抗体诊断和/或治疗CXCR3相关的疾病，例如I型糖尿病(T1D)、尤其新发生T1D的方法。在某些实施例中，本文公开了CXCR3中和抗体。
【专利说明】抗CXCR3抗体
[0001] 本申请基于35U.S.C. § 119要求于2012年1月20日提交的美国临时申请序列号 61/588,936的权益，该申请通过引用全部并入本文。
[0002] 本发明是关于抗体及使用抗体治疗与CXCR3信号传导相关疾病（例如I型糖尿病 (I型糖尿病；T1D))的方法。
[0003] 糖尿病的特征在于因缺乏胰岛素作用而导致的慢性高血糖症以及伴发的各种特 征性的代谢异常。糖尿病从广义上可以分为I型和II型。T1D的特征在于朗格罕氏岛 (Langerhans'islets)胰腺0细胞的缺失，而II型糖尿病的特征是胰岛素分泌和胰岛素 敏感性二者降低（胰岛素抵抗）。在美国，糖尿病的发病率为人群的约2%至4%，其中I型 糖尿病（亦称之为胰岛素依赖性或IDDM)占所有病例的约7%至10%。
[0004] I型糖尿病的特点在于无法产生足量的胰岛素以维持葡萄糖稳态。人们认为该 病症是由自身免疫介导的对胰腺0细胞破坏而引起的。与I型糖尿病相关的自身免疫 性涉及B和T自身反应性淋巴细胞二者的参与。实际上，高达98%的I型糖尿病患者具 有抗一种或多种自身0细胞抗原及异原性胰岛细胞胞质抗原（ICAs)，其中自身0细胞 抗原包括胰岛素、谷氨酸脱羧酶（GAD)、胰岛素瘤抗原-2以及胰岛素瘤抗原-2b(IA-2及 IA-2P)。尽管可能并非总是起决定性作用，但是一种或多种自身抗体的含量通常与@细 胞破坏相关。Irvine等人，Diabetes, 26:138-47 (1997);Riley等人，N.EngLJ,Med, 323:1 187-72(1990)。因此，自身抗体可以用作自身免疫性糖尿病发展的标志物，也可以与代谢变 化一起用于预测T1D患者的亲属中出现糖尿病的风险。
[0005] I型糖尿病的发生可以由自身反应性T细胞介导，正如通过借助于T1D 诊断时获得的组织活检证实经活化的T细胞浸润胰岛。Bottazzo等人，N,EngL J.Med, ,313:353-80 (1985);Hanninen等人，J，Clin.Invest, 90:1901-10 (1992);Itoh等 人，J.Clin,invest, 92:2313-22 (1993);Imagawa等人，Diabetes, 50:1289-73 (2001)。
[0006]趋化因子（c-x-c基序）受体3 (CXCR3)，亦称之为G蛋白偶联受体9 (GPR9)、 ⑶183、IP-10受体和Mig受体，是在自身反应性T细胞上表达的趋化因子受体，其 与一系列生理过程和相关疾病（例如T1D)相关。CXCR3几乎不存在于初始T细胞 中，但在经抗原活化后上调且因一级配体（CXCL9、CXCL10及CXCL11)将活化细胞募 集至组织发炎位点。已显示，在T1D的小鼠模型（(Christen等人，TheJournalof Immunology, 2003,171:8838-6845;orimoto等人，JImmunol2004 ；173 ；7017-7024 ； Sarkar等人.Diabetes. 2012Feb;81 (2) : 436-46)中及在患有胰岛炎的T1D患者的胰岛 (Uno等人 2010;Roep等人ClinicalandExperimentalImmunology, 2003, 159:338-343 ; Sarkar等人.Diabetes. 2012Feb;61 (2) :438-46)中，P细胞主要表达CXCL10,并且CXCL9 含量较低。另外，已显示，在T1D小鼠模型中和在I型糖尿病胰腺样本中，已浸润胰腺的T 细胞表达CXCR3(Christen等人，TheJournalofImmunology, 2003, 171:8838-6845;Van Haiteren等人，Diabetologia48:75-82(2005);Unoetal2010;Roep等人，Clinical andExperimentalimmunology, 2003, 159:338-343;Sarkar等人，Diabetes. 2012Feb; 81 (2) :436-46)。此外，CXCR3缺陷的基因敲除小鼠出现发作显著性延迟及T1D发病率降低 (Frigerio等人，NatureMedicine8:1414-1420 (2002))，而CXCL10 在转基因小鼠胰岛中 过表达促进T细胞浸润并加速T1D发作（Rhode等人，J.Immunol. 175 (6) : 3516-24 (2005))。 通过抗体治疗中和CXCL10是具有保护性（Christen等人，TheJournalofImmunolo gy，2003, 171:6838-6845)。
[0007] 在人类中已鉴定CXCR3有三种亚型，表示为A、B及Alt(Lasagni等人，1￡叉口. Med. 2003197:1537;EhlertetalJ.Immunol. 2004 ; 173 ;6234-6240) 〇CXCR3-A结合至CXC 趋化因子CXCL9(MIG)、CXCLIO(IP-IO)及CXCL11 (I-TAC) ;CXCR3-B亦结合至这些靶标，也 结合CXCL4 ;CXCR3-Alt似乎与CXCL11互相作用。尽管选择性剪接产生CXCR3的若干蛋白 亚型，但是CXCR3-A是活体内主要形式，这是因为CXCR3-B和CXCR3-AU在蛋白水平上的表 达量远远更低。Lasagni等人，J.Exp.Med. 2003197:1537;EhlertetaiJ,Immunol. 2004; 173 ；8234-624Q〇
[0008] 尚未证实使用CXCR3小分子抑制剂破坏CXCR3途径的努力是完全有效的。 Christen等人，ClinExp.Immunol. 185:318-328(2011)。研究主要集中于在糖尿病发作前 破坏CXCL10 的抗体和其他方法。Morimoto等人，J.Immun. 173:7017-7024(2004) ;0ikawa etai.，Rev.DiabetStud. 7:209-224(2010)。
[0009] 鉴于与CXCR3相关的T1D及其他疾病的盛行，因此需要一些靶向性CXCR3信号传 导的其他方法，例如，从而治疗或减少诸如T1D等病症或降低其进展。
[0010] 本发明公开了能够结合至CXCR3的抗体及其使用方法。在一些实施例中，该抗体 可通过靶向CXCR3途径来预防、治疗个体的T1D或降低其早期进展。该抗体及方法至少部 分依赖于以下令人惊讶的结果：针对CXCR3的中和抗体在疾病发作前给予可预防N0D小鼠 的T1D发作，或在N0D小鼠的T1D新发生阶段给予可逆转疾病进行。此外，中和CXCR3活性 并不与患者免疫系统的正常运行显著受损相关，因此降低了抗体疗法的不合意副作用。
[0011] 因此，一方面，本文公开了能够中和CXCR3活性的抗体及抗原结合片段。在某些实 施例中，CXCR3中和抗体的特点在于能够结合至选自SEQIDN0:1的1-58、1-16或1-37位 残基的肽。在一些实施例中，抗体包含全部或部分命名为Cl12、C1 135、C1 82、C1 53及/ 或Cl4的抗体克隆（Cl)。在某些实施例中，提供抗体Cl12、C1 135、C1 82、C1 53及/或 Cl4的变体，包括所公开的抗体⑶R-移植、人源化、回复突变（backmutated)及完全人类 变体。在特定实施例中，抗体包含本文所公开的克隆Cl12、C1 135、C1 82、C1 53和/或C1 4或克隆4、12、53、82和135的任一变体的一个或多个互补决定区（⑶R)，例如，一个或多个 重链⑶R1、⑶R2及⑶R3及/或一个或多个轻链⑶R1、⑶R2、⑶R3。在一些实施例中，源自 克隆Cl12、C1 135、C1 82、C1 53和/或C1 4或其嵌合和人源化的抗体相对于抗hCXCR3 克隆5H7、7H5、V44D7、1C6及49801显示出某些有益的特性。例如，本申请所公开的抗体与 抗hCXCR3克隆5H7、7H5、V44D7、1C6及49801相比可表现出增加的结合亲和力。例如，该抗 体可相对于抗CXCR抗体（例如1C6)体现出1倍、2倍、3倍、4倍、5倍或更大的亲和力（或 其间的任意值），例如，通过表面等离子共振（surfaceplasmonresonce)测定（例如，使 用BIAC0RE?分析）。在此也预测本申请中所公开的人源化抗体与小鼠抗hCXCR3克隆5H7、 V44D7,1C6,及49801相比在免疫原性方面有所降低。另外，本申请所公开的克隆4. 7-4. 11 重链通过去除58位和59位的一个脱酰胺位点而优化（使用MGT编码），且藉此相对于初 始小鼠抗hCXCR3重链可变区（VH)⑶R2序列稳定性增强。
[0012] 另一方面，本申请公开了在T1D发作前，如同治疗新发生T1D或减少其进展中给予 个体有效量的CXCR3中和抗体的方法。在特定实施例中，个体是哺乳动物，例如，人类。
[0013] 在某些实施例中，新发生的T1D个体在临床诊断6个月以内按照本申请所公开的 方法进行治疗。在其他实施例中，在临床诊断超过6个月的患者中进行治疗,其中该个体保 留至少约CL2nmol/L的残余空腹积分血清C肽浓度（residualfastingintegratedserum C-peptidelevels)〇
[0014] 在一些实施例中，个体的特点在于在外源性胰岛素不存在时升高的空腹血糖， 浓度高于120mg/dL;或在C肽刺激期间异常低的空腹积分血清C肽浓度，为约0. 033至 1.0nmol/Lxmin。在特定实施例中，CXCR3中和抗体以约0. 03-3. 7mg/kg/剂量给予。在 一些实施例中，给予个体至少一个剂量的抗体。在某些实施例中，给予个体重复剂量的抗体 (例如，至少每年一次，每季度一次，每两月一次，每月一次，每两周一次，每周一次或两天一 次）。在其他实施例中，上述方法还进一步包含在给予CXCR3中和抗体的同时或依序（之前 或之后）给予免疫抑制剂和/或3细胞刺激剂的步骤。
[0015] 在多数实施例中，本文中公开的抗CXCR3抗体是用于治疗CXCR3表达异常为特征 的状态。在一些实施例中，抗CXCR3抗体可以用于治疗那些受益于CXCR3活性下调或中和 的任何情况。在一些实施例中，在本文中公开的抗CXCR3抗体是用于治疗T1D。
[0016] 本发明的其他实施例及优点将在下文说明书中部分地加以陈述，并且部分是根据 本说明书是显而易见的，或者通过对本发明的实施而知晓。通过随附的权利要求中特别指 出的要素和组合实现并达成本发明的实施及优点。
[0017] 需要理解的是，上文的一般性说明以及下文的详细说明书仅具有示例性和解释 性，并非限制所主张的发明。
[0018] 并入说明书中并构成说明书中一部分的附图阐释了本发明的一个（若干个）实施 例，且与说明书一起用于解释本发明原理。

【专利附图】

【附图说明】
[0019] 图1显示了来自6周龄雌性N0D小鼠（第一行）、10周龄雌性N0D小鼠（第二行）、 及新发生糖尿病雌性N0D小鼠（第三行）的胰腺切片中胰岛素（左面板）、CXCL10(中面 板）、CD3(右面板）的表达。
[0020] 图2是对来自患有新发生糖尿病的雌性N0D小鼠胰腺中T细胞CXCR3表达的流式 细胞仪分析。鉴别⑶4+及⑶8+T细胞并针对CXCR3表达进行染色，如通过由底部两个图中 的实线所显示。同种型对照染色是在相同的两个图中由阴影曲线来显示。
[0021] 图3显示了在糖尿病发作前，对于从10周龄开始用PBS、抗CXCR3及对照IgG治 疗的动物而言，非糖尿病雌性N0D小鼠随时间的百分比。两次独立研究结果显示于图3A和 3B中。
[0022] 图4显示的是对于10周龄开始即用抗CXCR3抗体预防性治疗且针对胰岛素（左 面板）或CD3/Foxp3 (中面板及右面板）染色的26周非糖尿病雌性N0D小鼠的胰腺切片。 右面板是中面板中所示切片放大后的图片。
[0023] 图5显示的是在诊断为糖尿病后3-4天内开始用PBS、抗CXCR3及对照IgG及鼠类 抗胸腺细胞球蛋白（murinethymoglobulin，mATG)抗体治疗的雌性N0D小鼠每天早上的血 糖值。各条线代表各只小鼠。箭头指不提供治疗的时间。
[0024] 图6A是用PBS、抗CXCR3及对照IgG及mATG抗体治疗的雌性N0D小鼠的CD4+ (左 图）及CD8+(右图）T细胞百分比的条状图。在治疗过程中的第五次注射待测物后从小鼠 收集胰腺，同时从年龄匹配的经mATG治疗的小鼠收集胰腺。图6B是用PBS、对照抗体或抗 CXCR3治疗小鼠后胰腺的⑶4+T细胞的⑶44+表达（纵轴）对⑶62L表达（横轴）的绘图。 G1和G2分别是指门控性高⑶44/低⑶62L和低⑶44/高⑶62LT细胞。图6C显示的是与 用同种型对照抗体染色且淋巴细胞门控的细胞中CXCR3表达相比较，G1和G2中⑶4+T细 胞的CXCR3表达。
[0025] 图7显示的是用对照IgG(左面板）、抗CXCR3抗体（中面板）和mATG(右面板） 治疗且针对胰岛素（顶行）或CD3/Foxp3(底行）染色的雌性N0D小鼠的胰岛切片。
[0026] 图8A-D是年龄匹配的非糖尿病雌性N0D小鼠（图8A)、用PBS治疗的糖尿病N0D 小鼠（图8B)、抗CXCR3抗体治疗后疾病缓解的NOD小鼠（图8C)及用对照IgG抗体治疗的 糖尿病N0D小鼠（图8D)在进行葡萄糖筛查后血糖含量的曲线图。在初始糖尿病诊断及研 究注册后100天对小鼠实施葡萄糖筛查。各条线代表各个独立动物的数据。
[0027] 图9A-B显示对接受自PBS、抗CXCR3、对照IgG或mATG抗体治疗的雌性N0D小鼠 分离采集供体CD4+及CD8+T细胞的NOD.Scid接受者而言，非糖尿病小鼠随时间的百分比。 T细胞是在用PBS或对照IgG治疗后约80-90天从糖尿病雌性小鼠中分离，或在用抗CXCR3 或mATG抗体治疗后约80-90天从疾病缓解的雌性N0D小鼠中分离。两次独立研究结果见 图9A和9B。
[0028] 图10A展示了如图9中所示的用PBS、抗CXCR3、对照IgG或mATG抗体治疗雌性 N0D小鼠中分离的⑶4+及⑶8+供体T细胞百分比（左板面）。各治疗组中⑶4+和⑶8+T 细胞供体采集物中的效应和中央记忆细胞的百分比见图10A的右面板。图10B显示供体T 细胞采集物中通过⑶4和⑶25的表达或通过⑶4、⑶25及Foxp3的表达鉴别的调节性T细 胞百分比。图10C显示供体T细胞采集物中亦表达CXCR3的⑶8+(左面板）及⑶4+(右面 板）的百分比。
[0029] 图11A-B显示的是将来自于供体0VA特异性TCR转基因小鼠的T细胞过继性的转 移至保持未经治疗或用抗CXCR3抗体或对照IgG治疗的RIP-0VA接受者小鼠中，非糖尿病 小鼠随时间的百分比。两次研究结果见图11A和11B中。
[0030] 图12A显示在过继性转移至RIP-0VA接受者小鼠之前通过流式细胞仪分析供体T 细胞CXCR3的表达（实线曲线）。用同种型对照抗体染色见于阴影曲线中。图12B显示在 过继性转移后的第2天、第4天、第7天、第9天及第15天用抗CXCR3或对照IgG抗体治疗 的接受者小鼠血液、脾及胰腺淋巴结中供体细胞的百分比。图12C显示在过继性转移后用 CXCR3或对照IgG抗体治疗的接受者小鼠血液、脾、胰腺淋巴结增殖性供体细胞的百分比。 图12D显示在过继性转移后用CXCR3或对照IgG抗体治疗的接受者小鼠血液、脾、胰腺淋巴 结中CXCR3+供体细胞的百分比。
[0031] 图13显示来自保持未经治疗且针对胰岛素（左上）或⑶3(右上）染色或用抗 CXCR3抗体治疗且针对胰岛素（左下）或CD3(右下）染色的RIP-0VA接受者小鼠的胰腺切 片。在过继性转移供体T细胞后60天收集胰腺。
[0032]图14八-(：显示由克隆(：14，12,53,82及135介导的由0乂〇?3介导的向0乂(^11的 趋化性的抑制程度。数据显示为在趋化性分析中迁移细胞的平均相对荧光单位（RFU)。图 14D显示抗体克隆C1 4,12, 53和135将钙动员抑制50%所需的抗体浓度。
[0033] 图15A-C显示由由克隆C1 4，12,53,82及135介导的由0乂〇?3介导的向0乂(^9(图 15A)、CXCL10 (图15B)及CXCL11 (图15C)的趋化性的抑制程度。数据显示为在趋化性分 析中迁移细胞的平均相对荧光单位（RFU)。
[0034] 图16显示抗体与表达各种不同趋化因子的受体细胞结合的直方图。各直方图中 结合抗体的浓度沿横轴增加。
[0035] 图17A显示克隆4. 0 (标记为"亲本"）与某些人源化变体（标记为VH1-3、7_11及 VK1-3)的重链（VH)和轻链（VK)可变区的比对。图17B显示克隆12. 0(标记为"亲本"） 与其他人源化变体（标记为VH1-3、和VK1-3)的重链（VH)和轻链（VK)可变区的比对。图 17C显示克隆53. 0 (标记为"亲本"）与某些人源化变体（标记为VH1-6及VK1-9)的重链 (VH)和轻链（VK)可变区的比对。图17D显示克隆82. 0(标记为"亲本"）与其他人源化 变体（标记为VH1-3、和VK1-3)的重链（VH)和轻链（VK)可变区的比对。图17E显示克隆 135.0(标记为"亲本"）与其他人源化变体（标记为VH1-3、和VK1-3)的重链（VH)和轻链 (VK)可变区的比对。图17F显示克隆4.0 (标记为"亲本"）与某些4D人源化变体（标记 为VH4-6、和VK4-7)的重链（VH)和轻链（VK)可变区的比对。图17G显示克隆53. 0(标记 为"亲本"）与某些4D人源化变体（标记为VH7-10、和VK10-13)的重链（VH)和轻链（VK) 可变区的比对。图17A-G中各比对的底部序列代表最接近人类种系的序列。黑框指示⑶R 区，阴影残基序列与对应种系残基（图17A-E)或对应亲本残基（图17F-G)有所不同，使用 MGT编码及CDR划界。图17H显示克隆4. 0，12. 0,82. 0和135以及抗体克隆5H7和7H5的 重链（VH)及轻链（VL)可变区比对。黑框指示CDR区，阴影残基序列与比对中的先前序列 有所不同，使用MGT编码。
[0036] 图18显示抗体克隆4,12, 53,82和135的最小表位残基的边界。对于结合活性至 关重要的残基表不为X。
[0037] 图19是显示嵌合克隆4，12,53,82和135以及人源化变体肋1，肋2，11113在人类 CXCR3转染300. 19细胞中的抗体结合直方图。抗体是以5yg/ml(黑线），0. 5yg/ml(深灰 线），or0.li!g/ml(黑虚线）或5i!g/ml单独的二级抗体（填满灰色的直方图）给予，并 且将数据绘制为细胞数（横轴）对最大荧光百分比的曲线。
[0038] 图20A-C显示在10g/ml克隆4,12, 53,82和135或商业化克隆1C6的嵌合（chim) 或人源化（Hul，Hu2orHu3)抗体变体存在或不存在的情况下，对人类CXCR3转染细胞向 CXCL9 (图20A)，CXCL10 (图20B)和CXCL1 1 (图20C)迁移的抑制百分比（纵轴）。
[0039] 图21是显示克隆4,12, 53,82和135以及商业化克隆1C6的嵌合（chim)或人源 化（Hul，Hu2orHu3)抗体变体抑制人类CXCR3_Gqi4qi4转染CH0细胞中钙动员能力的曲线 图。绘制抗体浓度（横轴）对应最大抑制百分比（纵轴）的曲线。
[0040] 图 22A-D显示抗CXCR3 抗体治疗对N0D-scid/L2rynull(NSG)小鼠中CD3+/CD4+T cells(图 22A)，CD3+/CD8+Tcells(图 22B)，CXCR3+/CD3+/CD4+Tcells(图 22C)，and CXCR3+/CD3+/CD8+Tcells(图 22D)的百分比的效应。HulgGI是指人类IgGl(Here印tin)， 克隆4, 12, 53, 82和135是指嵌合抗体克隆。
[0041] 图23A显示克隆12. 0的重链和轻链的氨基酸序列。图23B显示克隆12. 1的重链 和轻链氨基酸序列。图23C显示了克隆12. 2的重链和轻链的氨基酸序列。图23D显示克 隆12. 3的重链和轻链的氨基酸序列。
[0042] 图24A显示克隆135. 0的重链和轻链的氨基酸序列。图24B显示克隆135. 1的重 链和轻链的氨基酸序列。图24C显示了克隆135. 2的重链和轻链的氨基酸序列。图24D显 示克隆135. 3的重链和轻链的氨基酸序列。
[0043] 图25A显示克隆4. 0的重链和轻链的氨基酸序列。图25B显示克隆4. 1的重链和 轻链的氨基酸序列。图25C显示了克隆4. 2的重链和轻链的氨基酸序列。图2?显示克隆 4. 3的重链和轻链的氨基酸序列。图25E显示克隆4. 4的重链氨基酸序列。图25F显示克 隆4. 5的重链氨基酸序列。图25G显示克隆4. 6的重链氨基酸序列。图25H显示克隆4. 7 的重链氨基酸序列。图251显示克隆4. 8的重链氨基酸序列。图25J显示克隆4. 9的重链 氨基酸序列。图25K显示克隆4. 10的重链氨基酸序列。图25L显示克隆4. 11的重链氨基 酸序列。图25M显示克隆4. 4的轻链氨基酸序列。图25N显示克隆4. 5的轻链氨基酸序列。 图250显示克隆4. 6的轻链氨基酸序列。图25P显示克隆4. 7的轻链氨基酸序列。
[0044] 图26A显示克隆53. 0的重链和轻链的氨基酸序列。图26B显示克隆53. 1的重链 和轻链的氨基酸序列。图26C显示了克隆53. 2的重链和轻链的氨基酸序列。图26D显示 克隆53. 3的重链和轻链的氨基酸序列。图26E显示克隆53. 4的重链氨基酸序列。图26F 显示克隆53. 5的重链氨基酸序列。图26G显示克隆53. 6的重链氨基酸序列。图26H显示 克隆53. 4的轻链氨基酸序列。图261显示克隆53. 5的轻链氨基酸序列。图26J显示克隆 53. 6的轻链氨基酸序列。图26K显示克隆53. 7的轻链氨基酸序列。图26L显示克隆53. 8 的轻链氨基酸序列。图26M显示克隆53. 9的轻链氨基酸序列。图26N显示克隆53. 7的重 链氨基酸序列。图260显示克隆53. 8的重链氨基酸序列。图26P显示克隆53. 9的重链氨 基酸序列。图26Q显示克隆53. 10的重链氨基酸序列。图26R显示克隆53. 10的轻链氨基 酸序列。图26S显示克隆53. 11的轻链氨基酸序列。图26T显示克隆53. 12的轻链氨基酸 序列。图26U显示克隆53. 13的轻链氨基酸序列。
[0045] 图27A显示克隆82. 0的重链和轻链的氨基酸序列。图27B显示克隆82. 1的重链 和轻链的氨基酸序列。图27C显示了克隆82. 2的重链和轻链的氨基酸序列。图27D显示 克隆82. 3的重链和轻链的氨基酸序列。
[0046] 图28A-P显示克隆12. 0-12. 3的重链和克隆12. 0-12. 3的轻链、克隆135. 0-135. 3 的重链和克隆135. 0-135. 3的轻链、克隆4. 0-4. 11的重链和克隆4. 0-4. 11的轻链、克隆 53. 0-53. 6的重链和克隆53. 0-53. 9的轻链、以及克隆82. 0-82. 3的重链和克隆82. 0-82. 3 的轻链的核酸序列。

【具体实施方式】
[0047] 现在将详细的参考本发明的某些示例性实施例，本发明的某些实施例在附图中予 以阐释。
[0048] CXCR3
[0049] CXCR3(MIM:300574,人类GeneID:2833,趋化因子（C-X-C基序）受体 3 ;亦称之 为CD182,CD183,CKR-L2,CKAR3,GPR9,IP10-R，Mig-R，MigR，G蛋白偶联受体 9,IP-10 受 体，SP10受体，Mig受体，趋化因子（C-X-C)受体3,干扰素诱导型蛋白10受体）几乎不 存于初始T细胞中，但在经抗原活化后上调且因其一级配体（CXCL9(人类GeneID:4283)，CXCL10(人类GenelD;3827)，和CXCL11(人类GeneID:6373))将这些细胞募集至组 织炎症部位的趋化因子受体。朗格罕氏（Langeriians)岛中的0细胞表达CXCL9和 CXCL10(Frigerio等人，NatureMedicine8:1414-1420(2002))并且那些已经浸润了膜腺 的T细胞表达CXCR3(Christen等人，TheJournalofImmunology，2003，171:6838_8845; VanHalteren等人，Diabetologia48:75-82(2005);Uno等人 2010;Roep等人， ClinicalandExperimentalImmunology，2003,159:338-343;Tanaka等人，Diabetes 58:2285-2291 (2009);SarkaretaL，Diabetes. 2012Feb;61 (2):436-46)。
[0050] CXCR3在多种有机体中表达，包括例如，人类、小鼠、大鼠、奶牛、黑猩猩、短尾猴、 狗、蛙、鸭嘴兽、猪及斑马鱼。表1列出了多种CXCR3在美国国家生物技术信息中心（NCBI) 的GenelD及蛋白参考序列。SEQIDN0:1是人CXCR3的全长序列（剪接变体A)。剪接变 体B的肽序列通过参考序列NP_001136269. 1提供。人CXCR3剪接变体A的预测胞外结构 域在文献Colvin等人，Mol.Cell.Bio. ,26:5838-49(2006)中记载，并且包括SEQIDN0:1 的 1-58, 1-16, 111-126, 190-223, 278-301 位残基，如下文所示：
[0051] SEQIDNO: 1NP-001495 人类CXCR3,A亚型
[0052] 1 mvlevsdhqvlndaevaallenfsssydygenesdscctsppcpqdfslnfdraflpaly
[0053] 61 sllfllgllgngavaavllsrrtalsstdtfllhlavadtIlvltlplwavdaavqwvfg
[0054] 121 sglckvagalfninfyagalIlacisfdrylnivhatqlyrrgpparvtltclavwglcl
[0055] 181 lfalpdfif1 sahhderinathcqynfpqvgrtalrylqlvagfflpllvmaycyahila
[0056] 241 vllvsrgqrrIramrlvvvyvvafalcwtpyhlvvivdilmdlgalarncgresrvdvak
[0057] 301 svtsglgymhcclnpllyafvgvkfrermwmlllrlgcpnqrglqrqpsssrrdsswset
[0058] 361seasysgl
[0059] 表 1
[0060]

【权利要求】
1. 一种能够结合CXCR3的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或片段包含重链可变区 (VH)和轻链可变区（VL)，其中： a) 重链可变区包含三个互补决定区（⑶R)，其与来自SEQ ID NO:2、4、6和8中任一者 的三个⑶R至少约95%-致；和/或轻链可变区包含三个⑶R，其与来自SEQ ID N0:3、5、7 和9中任一者的三个⑶R至少约95%-致； b) 重链可变区包含三个CDR，其与来自SEQ ID N0:10、12、14、16中任一者的三个CDR 至少约95%-致；和/或轻链可变区包含三个⑶R，其与来自SEQ ID NO: 11、13、15、17中任 一者的三个⑶R至少约95 %-致； c) 重链可变区包含三个CDR，其与来自SEQ ID N0:18、20、22、24、和26-33中任一者的 三个⑶R至少约95%-致；和/或轻链可变区包含三个⑶R，其与来自SEQ ID N0:19、21、 23、25、34-37中任一者的三个CDR至少约95%-致； d) 重链可变区包含三个CDR，其与来自SEQ ID N0:38、40、42、44、46-48和63-66中任一 者的三个⑶R至少约95%-致；和/或轻链可变区包含三个⑶R，其与来自SEQ ID NO: 39、 41、43、45、49-54和67-70中任一者的三个CDR至少约95%-致； 或e)重链可变区包含三个CDR，其与来自SEQ ID勵:55、57、59、61中任一者的三个0? 至少约95%-致；和/或轻链可变区包含三个⑶R，其与来自SEQ ID N0:56、58、60、62中任 一者的三个⑶R至少约95 %-致。
2. 如权利要求1所述的抗体或片段，其中所述的抗体或片段是嵌合的抗体或片段、经 CDR移植的抗体或片段、突变的抗体或片段、突变去除一个或多个脱酰胺位点的抗体或片 段、人的抗体或片段、人源化的抗体或片段、经人源化和回复突变的抗体或片段、合成的抗 体或片段或重组的抗体或片段。
3. 如权利要求1或2所述的抗体或片段，其中该抗体或片段是Fab、Fab'、F(ab'）2、Fv、 单链Fv(SCFv)、双链抗体（Fd)、线性抗体、纳米抗体（VHH)、双特异性抗体或多特异性抗体。
4. 如权利要求1至3中任一项所述的抗体或片段，其中该抗体或片段能够结合选自以 下的肽：a)包含SEQ ID NO: 1的残基1至58的肽；b)包含SEQ ID NO: 1的残基1至16的 肽；和/或c)包含SEQ ID NO: 1的残基1至37的肽。
5. 如权利要求1至4中任一项的抗体或片段，其中抗体或片段能够结合选自以下的 肽： a) 包含氨基酸序列SDHQVLNDAE的肽； b) 包含氨基酸序列SDHQVLND的肽； c) 包含氨基酸序列DHQVLND的肽； d) 包含氨基酸序列VLNDAE的肽； e) 包含氨基酸序列VLND的肽； f) 包含氨基酸序列XDXXVXNDXX的肽； g) 包含氨基酸序列XDXXVXND的肽； h) 包含氨基酸序列DXXVXND的肽； i) 包含氨基酸序列VXNDXX的肽； 和/或j)包含氨基酸序列VXND的肽， 其中X是指任意氨基酸。
6. 如权利要求1至5中任一项所述的抗体或片段，其中： a) 重链可变区包含与SED ID N0:2、4、6、8中任一者至少约85%、90%、95%或99% - 致的序列； b) 重链可变区包含与SED ID勵：10、12、14、16中任一者至少约85%、90%、95%或 99 %-致的序列； c) 重链可变区包含与SED ID N0:18、20、22、24、26至33中任一者至少约85%、90%、 95 %或99 %-致的序列； d) 重链可变区包含与SED ID勵:38、40、42、44、46至48、63至66中任一者至少约 85%、90%、95%或 99%-致的序列； 或e)重链可变区包含与SED ID N0:55、57、59、61中任一者至少约85%、90%、95%或 99 %-致的序列。
7. 如权利要求1至6中任一项所述的抗体或片段，其中： a) 轻链可变区包含与SED ID N0:3、5、7、9中任一者至少约85%、90%、95%或99% - 致的序列； b) 轻链可变区包含与SED ID勵：11、13、15、17中任一者至少约85%、90%、95%或 99 %-致的序列； c) 轻链可变区包含与SED ID N0:19、21、23、25、34至37中任一者至少约85%、90%、 95 %或99 %-致的序列； d) 轻链可变区包含与SED ID N0:39、41、43、45、49至54、67至70中任一者至少约 85%、90%、95%或 99%-致的序列； 或e)轻链可变区包含与SED ID勵:56、58、60、62中任一者至少约85%、90%、95%或 99 %-致的序列。
8. 如权利要求1到7中任一项所述的抗体或片段，其中： a) 重链可变区包含与SED ID NO:2、4、6、8中任一者至少约85%、90%、95%或99% - 致的序列；和轻链可变区包含与SED ID NO:3、5、7和9中任一者至少约85%、90%、95%或 99 %-致的序列； b) 重链可变区包含与SED ID勵：10、12、14、16中任一者至少约85%、90%、95%或 99%-致的序列；和轻链可变区包含与SED ID NO:ll、13、15、17中任一者至少约85%、 90%、95%或99%-致的序列； c) 重链可变区包含与SED ID N0:18、20、22、24、26至33中任一者至少约85%、90%、 95%或99%-致的序列；和轻链可变区包含与SED ID NO:19、21、23、25、34至37中任一者 至少约85%、90%、95%或99%-致的序列； d) 重链可变区包含与SED ID勵:38、40、42、44、46至48、63至66中任一者至少约 85%、90%、95%或99%-致的序列；和轻链可变区包含与SED ID NO:39、41、43、45、49至 54、67至70中任一者至少约85%、90%、95%或99%-致的序列； 或e)重链可变区包含与SED ID NO:55、57、59、61中任一者至少约85%、90%、95% 或99%-致的序列；和轻链可变区包含与SED ID N0:56、58、60、62中任一者至少约85%、 90%、95%或99%-致的序列。
9. 如权利要求1到8中任一项所述的抗体或片段，其中： a) 重链可变区包含与SED ID N0:2、4、6、8中任一者中的三个⑶R-致或包含1个、2 个或3个氨基酸残基突变的序列； b) 重链可变区包含与SED ID勵:10、12、14、16中任一者中的三个^1?一致或包含相对 于上述三个CDR具有1个、2个或3个氨基酸残基突变的序列； c) 重链可变区包含与SED ID勵：18、20、22、24、26至33中任一者中的三个〇?-致或 包含相对于上述三个CDR具有1个、2个或3个氨基酸残基突变的序列； d) 重链可变区包含与SED ID勵:38、40、42、44、46至48、63至66中任一者中的三个 ⑶R -致或包含相对于上述三个⑶R具有1个、2个或3个氨基酸残基突变的序列； 或e)重链可变区包含与SED ID N0:55、57、59、61中任一者中的三个⑶R-致或包含 相对于上述三个CDR具有1个、2个或3个氨基酸残基突变的序列。
10. 如权利要求1至9中任一项所述的抗体或片段，其中： a) 轻链可变区包含与SED ID NO:3、5、7、9中任一者中的三个⑶R-致或包含相对于上 述三个CDR具有1个、2个或3个氨基酸残基突变的序列； b) 轻链可变区包含与SED ID勵:11、13、15、17中任一者中的三个^1?一致或包含相对 于上述三个CDR具有1个、2个或3个氨基酸残基突变的序列； c) 轻链可变区包含与SED ID勵：19、21、23、25、34至37中任一者中的三个0?-致或 包含相对于上述三个CDR具有1个、2个或3个氨基酸残基突变的序列； d) 轻链可变区包含与SED ID NO:39、41、43、45、49至54、67至70中任一者中的三个 ⑶R -致或包含相对于上述三个⑶R具有1个、2个或3个氨基酸残基突变的序列； 或e)轻链可变区包含与SED ID N0:56、58、60、62中任一者中的三个⑶R-致或包含 相对于上述三个CDR具有1个、2个或3个氨基酸残基突变的序列。
11. 如权利要求1到10中任一项所述的抗体或片段，其中： a) 重链可变区包含与SED ID NO:2、4、6、8中任一者中的三个⑶R-致或包含相对于 上述三个CDR具有1个、2个或3个氨基酸残基突变的序列；和/或轻链可变区包含与SED ID NO: 3、5、7、9中任一者中的三个⑶R-致或包含相对于上述三个⑶R具有1个、2个或3 个氨基酸残基突变的序列； b) 重链可变区包含与SED ID N0:10、12、14、16中任一者中的三个⑶R-致或包含相 对于上述三个CDR具有1个、2个或3个氨基酸残基突变的序列；和/或轻链可变区包含与 SED ID勵:11、13、15、17中任一者中的三个^1?一致或包含相对于上述三个^1?具有1个、 2个或3个氨基酸残基突变的序列； c) 重链可变区包含与SED ID勵：18、20、22、24、26至33中任一者中的三个〇?-致或 包含相对于上述三个CDR具有1个、2个或3个氨基酸残基突变的序列；和/或轻链可变区 包含与SED ID勵：19、21、23、25、34至37中任一者中的三个0?-致或包含相对于上述三 个CDR具有1个、2个或3个氨基酸残基突变的序列； d) 重链可变区包含与SED ID勵:38、40、42、44、46至48、63至66中任一者中的三个 CDR -致或包含相对于上述三个CDR具有1个、2个或3个氨基酸残基突变的序列；和/或 轻链可变区包含与SED ID N0:39、41、43、45、49至54、67至70中任一者中的三个CDR-致 或包含相对于上述三个CDR具有1个、2个或3个氨基酸残基突变的序列； 或e)重链可变区包含与SED ID N0:55、57、59、61中任一者中的三个⑶R-致或包含 相对于上述三个CDR具有1个、2个或3个氨基酸残基突变的序列；轻链可变区包含与SED ID N0:56、58、60、62中任一者中的三个⑶R-致或包含相对于上述三个⑶R具有1个、2个 或3个氨基酸残基突变的序列。
12. -种能够结合CXCR3的抗体或抗原结合片段，其中抗体或片段包含重链可变区 (VH)和轻链可变区（VL)，并且其中： a) 重链可变区包含与SED ID N0:2、4、6、8中任一者至少约85%、90%、95%或99% - 致的序列；和/或轻链可变区包含与SED ID N0:3、5、7和9中任一者至少约85%、90%、 95 %或99 %-致的序列； b) 重链可变区包含与SED ID勵：10、12、14、16中任一者至少约85%、90%、95%或 99%-致的序列；和/或轻链可变区包含与SED ID勵:11、13、15、17中任一者至少约85%、 90%、95%或99%-致的序列； c) 重链可变区包含与SED ID N0:18、20、22、24、26至33中任一者至少约85%、90%、 95%或99%-致的序列；和/或轻链可变区包含与SED ID NO:19、21、23、25、34至37中任 一者至少约85 %、90 %、95 %或99 % -致的序列； d) 重链可变区包含与SED ID勵:38、40、42、44、46至48、63至66中任一者至少约 85%、90%、95%或99%-致的序列；和/或轻链可变区包含与SED ID NO:39、41、43、45、49 至54、67至70中任一者至少约85%、90%、95%或99%-致的序列； 或e)重链可变区包含与SED ID NO:55、57、59、61中任一者至少约85%、90%、95%或 99%-致的序列；和/或轻链可变区包含与SED ID勵:56、58、60、62中任一者至少约85%、 90%、95%或99%-致的序列。
13. 如权利要求12所述的抗体或片段，其中： a) 重链可变区包含与SEQ ID NO:2、4、6、8中任一者一致或包含相对于上述序列具有1 至10个氨基酸残基突变的序列；和/或轻链可变区包含与SEQ ID NO:3、5、7、9中任一者一 致或包含相对于上述序列具有1至10个氨基酸残基突变的序列； b) 重链可变区包含与SEQ ID NO: 10、12、14、16中任一者一致或包含相对于上述序列具 有1至10个氨基酸残基突变的序列；和/或轻链可变区包含与SEQ ID NO: 11、13、15和17 中任一者一致或包含相对于上述序列具有1至10个氨基酸残基突变的序列； c) 重链可变区包含相对于SEQ ID N0:18、20、22、24、26至33中任一者一致或包含相 对于上述序列具有1至10个氨基酸残基突变的序列；和/或轻链可变区包含与SEQ ID NO: 19、21、23、25、34至37中任一者一致或包含相对于上述序列具有1至10个氨基酸残基 突变的序列； d) 重链可变区包含相对于SEQ ID勵:38、40、42、44、46至48、63至66中任一者一致或 包含相对于上述序列具有1至10个氨基酸残基突变的序列；和/或轻链可变区包含与SEQ 10勵:39、41、43、45、49至54、67至70中任一者一致或包含相对于上述序列具有1至10个 氨基酸残基突变的序列； 或e)重链可变区包含与SEQ ID勵:55、57、59、61中任一者一致或包含相对于上述序 列具有1至10个氨基酸残基突变的序列；和/或轻链可变区包含相对于SEQ ID N0:56、58、 60、62中任一者一致或包含相对于上述序列具有1至10个氨基酸残基突变的序列。
14. 如权利要求12或13所述的抗体或片段，其中： a) 重链可变区包含三个⑶R，与来自SEQ ID N0:2、4、6、8中任一者的三个⑶R至少约 95%-致，和/或轻链可变区包含三个⑶R，与来自SEQ ID N0:3、5、7、9中任一者的三个⑶R 至少约95 %-致； b) 重链可变区包含三个⑶R，与来自SEQ ID NO: 10、12、14和16中任一者的三个⑶R 至少约95%-致，和/或轻链可变区包含三个⑶R，与来自SEQ ID NO: 11、13、15、17中任一 者的三个⑶R至少约95 %-致； c) 重链可变区包含三个CDR，与来自SEQ ID N0:18、20、22、24、26至33中任一者的三 个⑶R至少约95%-致，和/或轻链可变区包含三个⑶R，与来自SEQ ID N0:19、21、23、25、 34至37中任一者的三个⑶R至少约95%-致； d) 重链可变区包含三个CDR，与来自SEQ ID勵:38、40、42、44、46至48、63至66中任 一者的三个⑶R至少约95%-致，和/或轻链可变区包含三个⑶R，与来自SEQ ID NO: 39、 41、43、45、49至54、67至70中任一者的三个CDR至少约95%-致； 或e)重链可变区包含三个CDR，与来自SEQ ID N0:55、57、59、61中任一者的三个CDR 至少约95%-致，和/或轻链可变区包含三个⑶R，与来自SEQ ID N0:56、58、60、62中任一 者的三个⑶R至少约95 %-致。
15. 如权利要求1至14中任一项所述的抗体或片段，其抗体或片段包含表2中的重链 和轻链可变区的任一组合。
16. 如权利要求1至15中任一项所述的抗体或片段，其中该抗体能够以至少约10 ^T1的亲和力常数结合CXCR3。
17. 如权利要求1至16中任一项所述的抗体或片段，其中该抗体或片段能够结合 CXCR3的A和B同种型。
18. 如权利要求1至17中任一项所述的抗体或片段，其中抗体或片段能够优先结合至 CXCR3的A同种型。
19. 如权利要求1至18中任一项所述的抗体或片段，其中抗体或片段能够中和CXCR3 活性。
20. -种分离的核苷酸，其编码如权利要求1至19中任一项抗体或片段的氨基酸序列。
21. -种载体，其包含权利要求20的分离的核苷酸。
22. -种经分离的宿主细胞，其包含权利要求21的载体。
23. -种产生如权利要求1至19中任一项的抗体或片段的方法，其包含在适于产生抗 体或片段的条件下在培养基中培养权利要求19的宿主细胞。
24. -种试剂盒，其包含权利要求1至19中任一项的抗体或片段或权利要求20的核酸 和关于使用该抗体或片段用于研究、诊断或治疗目的的说明书。
25. -种预防、治疗新发生I型糖尿病（T1D)或减少其进展的方法，其包含： a) 鉴别有发生T1D风险或患有新发生T1D的个体；及 b) 向该个体给予有效量的权利要求1至19中任一项的抗体或片段，藉此预防T1D发 生，或治疗新发生T1D或减少其进展。
26. 如权利要求25所述的方法，其中的个体是哺乳动物。
27. 如权利要求25或26所述的方法，其中的个体是人体。
28. 如权利要求25至27中任一项所述的方法，其中该个体具有大于或等于约 0. 2nmol/L的基础血清C肽浓度，和/或其中患者在C肽刺激期间具有介于约0. 033nmol/ LXmin和1. Onmol/LXmin之间的空腹积分血清C肽浓度。
29. 如权利要求25至28中任一项所述的方法，其中该患者在外源性胰岛素不存在时具 有大于约120mg/dL的空腹血糖浓度。
30. 如权利要求25至29中任一项所述的方法，其中该抗体或片段是人源化的。
31. 如权利要求25至30中任一项所述的方法，其中该抗体或片段是以约0. 03mg/kg/ 剂量至3. 7mg/kg/剂量的剂量给予。
32. 如权利要求25至31中任一项所述的方法，其中该抗体或片段是以至少每天一次、 每周一次、每两周一次、每月一次、每两月一次、每季度一次或每年一次给予。
33. 如权利要求25至32中任一项所述的方法，其中该抗体或片段是以约0. 16mg/kg至 18mg/kg的全部给予总剂量给予。
34. 如权利要求25至33中任一项所述的方法，其中该抗体或片段是经静脉内、经腹膜 内、经鼻、经眼、经口、肠道外、皮下或经皮给予。
35. 如权利要求25至34中任一项所述的方法，其中该抗体或片段是直接给予到胰腺。
36. 如权利要求35所述的方法，其中该抗体或片段是给予到邻近胰腺的胰岛细胞。
37. 如权利要求25至36中任一项所述的方法，其中该方法进一步包含给予3细胞刺 激剂、胰岛素或产生胰岛素的细胞。
38. 如权利要求25至37中任一项所述的方法，其中该方法进一步包含给予免疫抑制 剂。
39. -种治疗新发生1型糖尿病（T1D)或减少其进展的方法，其包含： a)鉴别患有新发生T1D并且具有大于或等于约0. 2nmol/L基础血清C肽浓度和/或C 肽刺激期间具有约0. 〇33nmol/LXmin和1. Onmol/LXmin之间的空腹积分血清C肽浓度的 人类个体； 以及b)给予约0? 03mg/kg/剂量至3. 7mg/kg/剂量的权利要求1至19中任一项的抗 体或片段，藉此治疗新发生T1D或减少其进展。
40. -种CXCR3中和抗体或其片段，其用于个体预防、治疗新发生1型糖尿病（T1D)或 减少其进展，其中该抗体或其片段包含如权利要求1至19中任一项所述的抗体或片段。
41. 一种选自权利要求1至19中任一项的抗体或片段的CXCR3抗体或其片段的用途， 其用于制备治疗疾病或病症的药剂。
42. 如权利要求41所述的用途，其中所述的疾病或病症是CXCR3相关的疾病或病症。
43. 如权利要求41或42的用途，其中所述疾病或病症是新发生1型糖尿病（T1D)。
44. 一种偶联物，其包含权利要求1至19中任一项的抗体或片段以及至少一种其他试 剂。
45. 如权利要求44所述的偶联物，其中所述的其他试剂是治疗剂、solubalizing、稳定 齐U、免疫抑制剂、受体或抗原结合肽。
46. -种药物组合物，其包含如权利要求1至19中任一项的抗体或片段或权利要求20 中的核酸以及药学上可接受的载体。
47. 如权利要求46所述的药物组合物，其中该组合物进一步包含至少一种其他治疗 剂。
48. 如权利要求47所述的药物组合物，其中至少一种其他治疗剂包含用于治疗与 CXCR3相关的疾病或病症的药剂。
49. 如权利要求47或48的药物组合物，其中至少一种其他的治疗剂包含0细胞刺激 齐U、胰岛素或产生胰岛素的细胞。
50. -种检测测试试样中CXCR3存在或浓度的体外方法，其包含使该测试试样与权利 要求1至19中任一项的抗体或片段以及可检测标记接触，其中CXCR3的存在或浓度与该检 测标记产生的信号直接或间接相关。
51. 如权利要求50所述的方法，其中使用该方法诊断与CXCR3相关的病况。
52. 如权利要求50所述的方法，其中该病况是T1D。
【文档编号】C07K16/28GK104507967SQ201380015401
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2013年1月18日 优先权日:2012年1月20日
【发明者】M·尤德, J·特德斯通, T·洛迪, K·B·卡特, T·D·康纳斯, J·R·平克尼, E·马斯特约翰, R·丘 申请人:建新公司