一种抗体亲和纯化的洗脱新方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种抗体亲和纯化的洗脱新方法，在抗体亲和纯化洗脱的过程中，平衡层析柱采用12mM?PBS，pH7.4的平衡缓冲液，使用10～30mM?PBS，pH3.0作为洗脱缓冲液，并用200mM～500mM?PBS，pH11.0作为中和缓冲液中和洗脱样本中的抗体。本发明的有益效果是，可以在抗体亲和制备过程中减少一步操作，即缓冲液置换过程，缩短操作时间，节约材料、仪器及耗材等成本，并可降低由于增加纯化步骤带来的抗体活性损失的风险。本发明的抗体亲和纯化洗脱体系可在实验室制备及工业生产中为操作者提供可操作性强的实验方法，为抗体制备工艺改进提供帮助。
【专利说明】一种抗体亲和纯化的洗脱新方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种抗体亲和纯化的洗脱方法，尤其是在抗体的实验室制备和工业生产中可操作的抗体亲和纯化洗脱方法。
【背景技术】
[0002]目前，抗体的亲和纯化多采用A型金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,SPA)分离所得的一种细胞壁蛋白及G型链球菌分离而得的细胞壁蛋白作为偶联配基，也有将抗原偶联至活化的基质上进行抗体亲和纯化的，但在采用低PH值缓冲液对结合抗体进行洗脱时，多采用0.1M Gly-HCl, pH3.0左右的缓冲液进行洗脱，并用IM Tris-HCl, pH9.0中和洗脱抗体，但此洗脱方法在抗体进行后续使用前要进行缓冲液置换，即脱盐至PBS等中性盐缓冲液中，以排除Gly等对后续实验的干扰，保证抗体活性的稳定。
【发明内容】
[0003]为了克服现有方法在抗体亲和纯化后，要进行缓冲液置换的不足，本发明提供一种抗体亲和纯化的洗脱方法，该方法不仅可以达到与甘氨酸缓冲液相同的抗体收率，而且可以保持抗体活性不受影响。
[0004]本发明解决其技术问题采用的技术方案是:
[0005]在抗体亲和纯化洗脱的过程中，平衡层析柱采用12mM PBS, pH7.4的平衡缓冲液，使用10~30mM PBS，pH3.0作为洗脱缓冲液，并用200mM~500mM PBS，pHll.0作为中和缓冲液洗脱样本中的抗体。
[0006]所述的平衡缓冲 液中包括150mM NaCl，IOmM Na2HPO4, 2mM NaH2PO4,调 ρΗ7.4 ；
[0007]所述的洗脱缓冲液中包括150 ~200mM NaCl，5 ~20mM H3PO4, 2 ~IOmM NaH2PO4,浓 HCl 调 ρΗ3.0 ；
[0008]所述的中和缓冲液中包括150~200mM NaCl, 200~500mM Na2HPO4, IM NaOH调pHll.0。
[0009]该方法适用于IgG的亲和纯化。
[0010]所述新方法的实验步骤如下:
[0011]I)样本处理:
[0012]将样本用平衡缓冲液将样本体积稀释一倍，经离心过滤后，平均分成两份准备上柱；
[0013]2)抗体纯化:
[0014]预装柱:使用平衡缓冲液平衡GE MabSelect Sure5mL层析柱,流速2mL/min ；
[0015]上样:当层析柱充分平衡、280nm吸光值曲线平稳且回归基线后，上样，上样流速2mL/min,上样量 20mL ；
[0016]平衡:使用平衡缓冲液平衡层析柱，至曲线回归基线；
[0017]洗脱:使用洗脱缓冲液洗脱样本中的抗体，流速lmL/min，收集洗脱峰，并用中和缓冲液中和洗脱峰至中性，中和缓冲液添加体积约为洗脱峰体积的10%。
[0018]本发明采用的样本为人血浆和兔血清，将等量的人血浆(兔血清)分别使用两种不同的洗脱方法进行分离纯化，测定两种洗脱方法所得抗体的量，并在相同条件下测定抗体的纯度、活性等指标，并比较两种洗脱方法的差异，确定本发明方法的可行性，以达到减少抗体亲和纯化步骤，提高效率的目的。
[0019]本发明的有益效果是，可以在抗体亲和纯化过程中减少一步操作，即缓冲液置换过程，缩短操作时间，节约材料、仪器及耗材等成本，并可降低由于增加纯化步骤带来的抗体活性损失的风险。本发明的抗体亲和纯化洗脱体系可在实验室制备及工业生产中为操作者提供可操作性强的实验方法，为抗体制备工艺改进提供帮助。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1为人IgG甘氨酸缓冲液洗脱层析图；
[0021]图2为人IgG磷酸盐缓冲液洗脱层析图；
[0022]图3为兔IgG甘氨酸缓冲液洗脱层析图；
[0023]图4为兔IgG磷酸盐缓冲液洗脱层析图；
[0024]图5 (a)为纯化人IgG的SDS-PAGE电泳图；
[0025]图5 (b)为纯化兔IgG的SDS-PAGE电泳图；
[0026]图5 (C)为纯化人IgG/兔IgG分子量分析SDS-PAGE电泳图；
[0027]其中，1为 al ;2 为 bl ;3 为 marker ；C 为 marker ；D 为 A2, E 为 B2。
[0028]图6为人IgG洗脱峰胶体金法活性测定结果；
[0029]图7为兔IgG洗脱峰胶体金法活性测定结果；
[0030]图8为人IgG (兔IgG)洗脱峰ELISA法活性测定结果。
【具体实施方式】
[0031]实施例1
[0032]本实施例目的在于比较两种抗体洗脱体系在人IgG纯化过程中对抗体收率及活性的影响，其中A洗脱体系为本发明提出的磷酸盐缓冲液体系，B组洗脱体系为对照的甘氨酸缓冲液体系。验证磷酸盐洗脱体系在工艺过程中的优势。
[0033]1 材料
[0034]1.1供试样本:混合人血浆,20mL。
[0035]1.2主要实验设备及耗材
[0036]1) GE AKTA purifier
[0037]2) QIAGEN ESEQuant development Kit (gold)
[0038]3)北京六一 DYY-6C型电泳仪电源
[0039]4) BECKMAN COULTER Avanti J-E 高效离心机
[0040]5) GE Sephadex G_25Fine 介质
[0041]6) GE MabSelect Sure 介质
[0042]7) Pierce BCA Protein Assay Kit
[0043]2 方法[0044]2.1溶液配制
[0045]平衡缓冲液(12mMPBS, ρΗ7.4):
[0046]NaCl:150mM
[0047]Na2HPO4: IOmM
[0048]NaH2PO4:2mM
[0049]调ρΗ7.4
[0050]A 组:
[0051]A-1 洗脱缓冲液(10-30mM PBS, ρΗ3.0)
[0052]NaCl:150 ~200mM
[0053]H3PO4:5 ~20mM
[0054]NaH2PO4:2 ~IOmM
[0055]浓HC1/1M NaOH 调 ρΗ3.0
[0056]Α-2 中和缓冲液(200mM PBS, pHll.0)
[0057]NaCl:150 ~200mM
[0058]Na2HPO4:200 ~500mM
[0059]IM NaOH 调 pHll.0
[0060]B 组:
[0061]B-1洗脱缓冲液(IOOmM甘氨酸，pH3.0)
[0062]Gly: IOOmM
[0063]浓HCl 调 ρΗ3.0
[0064]Β-2 中和缓冲液(IM Tris-HCl, ρΗ9.0)
[0065]Tris:1M
[0066]浓HCl 调 ρΗ9.0
[0067]2.2.2实验方法
[0068]2.2.2.1样本处理:人血浆样本用平衡缓冲液将样本体积稀释一倍,经4000rpm，4°C,离心15min,0.45 μ m滤膜过滤后,平均分成两份准备上柱。
[0069]2.2.2.2 抗体纯化:
[0070]层析柱:GEMabSelect SureSmT,预装柱
[0071]第一组:
[0072]平衡缓冲液平衡层析柱，流速2mL/min ；
[0073]上样:充分平衡，280nm吸光值曲线平稳，且回归基线后，上样，上样流速2mL/min，上样量20mL ；
[0074]平衡:平衡缓冲液平衡层析柱，至曲线回归基线；
[0075]洗脱:使用B-1洗脱抗体，流速lmL/min，收集洗脱峰，并用B_2中和洗脱峰至中性，体积约为洗脱峰体积的10% ；
[0076]第二组:
[0077]平衡缓冲液平衡层析柱，流速2mL/min ；
[0078]上样:充分平衡，280nm吸光值曲线平稳，且回归基线后，上样，上样流速2mL/min，上样量20mL ；[0079]平衡:平衡缓冲液平衡层析柱，至曲线回归基线；
[0080]洗脱:使用A-1洗脱抗体，流速lmL/min，收集洗脱峰，并用A_2中和洗脱峰至中性，体积约为洗脱峰体积的10% ；
[0081]脱盐:将第一组洗脱的抗体用GE Sephadex G_25Fine介质置换至平衡缓冲液中。
[0082]上述两组抗体样本分别编号如下:
[0083]
【权利要求】
1.一种抗体亲和纯化的洗脱新方法，其特征在于: 在抗体亲和纯化洗脱的过程中，平衡层析柱采用12mM PBS, pH7.4的平衡缓冲液，使用10~30mM PBS，pH3.0作为洗脱缓冲液，并用200mM~500mM PBS，pHll.0作为中和缓冲液洗脱样本中的抗体。
2.根据权利要求1中所述的抗体亲和纯化的洗脱新方法，其特征在于: 所述的平衡缓冲液中包括 150mM NaCl, IOmM Na2HPO4, 2mM NaH2PO4，调 pH7.4 ； 所述的洗脱缓冲液中包括150~200mM NaCl，5~20mM H3PO4, 2~IOmM NaH2PO4,浓HCl调 ρΗ3.0 ； 所述的中和缓冲液中包括150~200mM NaCl，200~500mM Na2HPO4, IM NaOH调pHll.0。
3.根据权利要求1中所述的抗体亲和纯化的洗脱新方法，其特征在于:该方法适用于IgG的亲和纯化。
4.根据权利要求1中所述的抗体亲和纯化的洗脱新方法，其特征在于:所述新方法的实验步骤如下: 1)样本处理: 将样本用平衡缓冲液将样本体积稀释一倍，经离心过滤后，平均分成两份准备上柱； 2)抗体纯化: 预装柱:使用平衡缓冲液平衡GE MabSelect Sure5mL层析柱,流速2mL/min ；` 上样:当层析柱充分平衡、280nm吸`光值曲线平稳且回归基线后，上样，上样流速2mL/min,上样量20mL ； 平衡:使用平衡缓冲液平衡层析柱，至曲线回归基线； 洗脱:使用洗脱缓冲液洗脱样本中的抗体，流速lmL/min，收集洗脱峰，并用中和缓冲液中和洗脱峰至中性，中和缓冲液添加体积约为洗脱峰体积的10%。
【文档编号】C07K16/00GK103739705SQ201410001708
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2014年1月2日 优先权日:2014年1月2日
【发明者】李文欣, 朱琳 申请人:辽宁迈迪生物科技有限公司