一种SjHSP90重组蛋白及其在血吸虫病诊断及疗效考核中的应用的制作方法
【专利摘要】一种SjHSP90重组蛋白及其在血吸虫病诊断及疗效考核中的应用，属于免疫学领域。本发明包括日本血吸虫热休克蛋白SjHSP90重组蛋白的制备，SjHSP90重组蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。并进一步将该SjHSP90重组蛋白应用于血吸虫病的诊断和疗效考核。本发明首次提出将SjHSP90重组蛋白应用于血吸虫病诊断，不仅可以用于诊断血吸虫病，而且可以进行疗效考核，具有广阔的市场空间和较好的社会、经济效益。
【专利说明】—种SjHSP90重组蛋白及其在血吸虫病诊断及疗效考核中的应用
【技术领域】
[0001]一种日本血吸虫热休克蛋白SjHSP90重组蛋白及其在血吸虫病诊断及疗效考核中的应用，属于免疫学领域。
【背景技术】
[0002]血吸虫病是一种严重危害人类健康的传染性疾病，目前全世界有74个国家流行血吸虫病，7.79亿人受到血吸虫病的威胁，2亿多人感染血吸虫病。我国是日本血吸虫病流行最严重的国家，主要流行于我国沿长江及其以南的十二个省、市、自治区，至2012年血吸虫病人数仍然高达24万。诊断是血吸虫病防治领域的中心环节。常用的血吸虫病原学诊断方法，由于其敏感性低、漏检率高，操作繁琐、人群依从率低等缺点，已不能满足当前现场防治工作的需要。
[0003]免疫诊断方法由于其快速、简便，并具有较高的敏感性和特异性，在我国血吸虫病防治工作中发挥了重要的作用。目前常用的免疫诊断方法均以检测血吸虫病人体内的抗体为依据，如间接血凝试验(IHA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)和胶体染料试纸条法(DDIA)等，这些方法具有较高的敏感性和较好的特异性，在现场得到了广泛的应用，但由于流行区病人体内特异性抗体(主要为IgG)将在体内持续很长时间，即使在治愈后也不会很快消失，且在无再感染的情况下也将持续数年而不消失。因此发展有效疗效考核的免疫诊断方法成为血吸虫病防治工作中亟待解决的重大问题。
[0004] 为解决当前血吸虫病防治工作中疗效考核这一难点问题-评价化疗效果，较准
确的确定化疗对象，朱荫昌等用SDS-PAGE和Western blot对日本血吸虫虫卵可溶性抗原(SEA)进行了分析，发现血吸虫虫卵组分抗原(107-121kDa)具有较好的诊断价值和考核疗效的作用，但是由于制备该组分抗原采用了从天然抗原SEA中提取的方法，制备方法复杂，得率低，限制了该组分抗原在现场查病中的大规模应用。本课题组在前期工作中采用蛋白组学方法分析该血吸虫虫卵组分抗原中的蛋白分子，筛选到SjHSP90重组蛋白分子，鉴定其具有诊断和疗效考核价值。
[0005]HSP90蛋白是广泛存在于细胞内的一类高度保守的分子伴侣，通过维持其受体蛋白的稳定与活性而间接参与调控细胞内多条重要的信号传导通路，其独特的性质使其成为肿瘤诊断的标志物和治疗的分子靶点。到目前为止，还没有出现关于本发明SjHSP90重组蛋白应用于血吸虫病诊断和疗效考核的研究报道。
【发明内容】
[0006]本发明目的在于提供一种含日本血吸虫热休克蛋白SjHSP90基因的重组表达载体，该重组载体表达的SjHSP90重组蛋白，可用于血吸虫病的诊断和疗效考核。
[0007]进一步目的在于提供一种以SjHSP90重组蛋白为基础建立的血吸虫病免疫诊断方法。[0008]为解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:
一种日本血吸虫热休克蛋白SjHSP90重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0009]所述SjHSP90重组蛋白的制备方法，将扩增的SjHSP90基因，双酶切定向克隆到pET28a(+)载体上，经酶切鉴定和测序确认无误，获得重组质粒pET28a-SjHSP90 ;将重组质粒pET28a-SjHSP90传化入大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞，IPTG诱导目的蛋白表达，12%SDS-PAGE电泳显示融合蛋白分子量82kDa，与预计分子量一致；破菌上清经金属螯合柱亲和层析进一步得到纯化，SJHSP90重组蛋白纯度达到95%。
[0010]所述SjHSP90重组蛋白的的应用，用于诊断血吸虫病。
[0011]所述SjHSP90重组蛋白的的应用，用于血吸虫病的疗效考核。
[0012]本发明的一个方面，优选的，所述表达载体为原核表达载体；更优选的，所述表达载体为原核表达载体pET28a(+)。
[0013]在本发明的另一方面，提供了一种包含上述重组表达载体的大肠杆菌宿主细胞。
[0014]在本发明的另一方面，还提供了一种日本血吸虫SjHSP90重组蛋白的制备方法，包括如下步骤:
构建含SjHSP90基因的重组表达载体；
将所述重组表达载体转化入大肠杆菌宿主细胞；
培养包含重组表达载体的大肠杆菌宿主细胞，并在合适条件下，诱导该重组表达载体表达SjHSP90重组蛋白。
[0015]纯化诱导表达的S jHSP90重组蛋白。
[0016]本发明的另一方面，还提供了一种上述重组表达载体在制备诊断血吸虫病的产品中的应用。
[0017]本发明重组载体表达的SjHSP90重组可以作为诊断抗原，对血吸虫病人或病畜进行诊断和疗效考核。
[0018]本发明的有益效果:本发明包括日本血吸虫热休克蛋白SjHSP90重组蛋白的制备，SjHSP90重组蛋白其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。本发明首次提出将SjHSP90重组蛋白应用于血吸虫病诊断，不仅可以用于诊断血吸虫病，而且可以进行疗效考核，具有广阔的市场空间和较好的社会、经济效益。
【具体实施方式】
[0019]实施例1:日本血吸虫热休克蛋白SjHSP90基因的扩增
根据日本血吸虫热休克蛋白SjHSP90基因序列设计引物，由上海生工生物工程公司合
成，
引物 Pl:5’ -GCCATATGCC TGAACCAATG TCTACC-3 ’，引入酶切位点 Nde I ；引物P2:5’ - GCCTCGAGCT AGTCCACTTC CTCCATTCC-3’，引入酶切位点Xho I，经PCR扩增出全长SjHSP90基因(2160bp)。
[0020]实施例2:SjHSP90的表达和纯化
将成功扩增的SjHSP90基因，双酶切定向克隆到pET28a(+)载体上，经酶切鉴定和测序确认无误，获得重组质粒pET28a-SjHSP90。将重组质粒传化入大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞，IPTG诱导目的蛋白表达，12% SDS-PAGE电泳显示融合蛋白分子量82kDa左右，与预计分子量一致。破菌上清经金属螯合柱亲和层析进一步得到纯化，SjHSP90重组蛋白纯度达到95%以上，产量可达200mg/L。
[0021]实施例3:日本血吸虫病感染及治疗的动物模型的建立
1)取健康新西兰大白兔于腹部感染日本血吸虫尾蝴200条，感染45d后，粪检查到血吸虫虫卵确定感染后，用吡喹酮按150mg/kg体重进行治疗，Iw后用相同剂量再复治一次；于感染前、感染后(治疗前)和治疗后每隔Iw的耳缘静脉采血，直至治疗后16w剖杀；
2)取Balb/c小鼠于腹部感染日本血吸虫尾蝴20条，于感染第5周，粪检查到血吸虫虫卵确定感染后，用吡喹酮按300mg/kg体重进行治疗，Iw后用相同剂量再复治一次；于感染前、感染后(治疗前)和治疗后每隔Iw的尾静脉采血，直至治疗后16w剖杀。
[0022]实施例4:重组蛋白SjHSP90_ELISA法的建立
采用正交试验将得到的SjHSP90重组蛋白以不同浓度包被，ELISA法检测不同稀释度的感染兔血清，根据检测结果选择以阳性和阴性比值最大时的条件，即SjHSP90重组蛋白2 μ g/mL包被，1:100血清稀释度为最佳反应条件，照最佳反应条件建立SjHSP90重组蛋白的ELISA法。
[0023]实施例5:SjHSP90重组蛋白用于血吸虫病的诊断和疗效考核价值的评价
用SjHSP90重组蛋白ELISA法检测治疗前及治疗后不同时间的感染兔血清，于第6W达最高，第15W呈现阴性反应；表明SjHSP90重组蛋白具有疗效考核的价值。进一步用此ELISA法检测30只小鼠血清，诊断出治疗前感染血吸虫小鼠的灵敏度达到93.3%，与以可溶性虫卵抗原SEA为抗原的ELISA法的灵敏度96.67%相似；检测治疗后12周和16周小鼠血清，SjHSP90-ELISA法阴转率达83.3%和86.6%,，而SEA-ELISA法阴转率仅为10.0%和13.3%。上述结果表明，SjHSP90具有较好的免疫诊断和疗效考核价值，可用于建立疗效考核诊断方法，在血吸虫病现场防治中具有良好的应用前景。
【权利要求】
1.一种日本血吸虫热休克蛋白sjHSP90重组蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQID N0.1 所示。
2.权利要求1所述SjHSP90重组蛋白的制备方法，其特征在于，将扩增的SjHSP90基因，双酶切定向克隆到pET28a(+)载体上，经酶切鉴定和测序确认无误，获得重组质粒pET28a-SjHSP90 ;将重组质粒pET28a_SjHSP90传化入大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞，IPTG诱导目的蛋白表达，12% SDS-PAGE电泳显示融合蛋白分子量82kDa，与预计分子量一致；破菌上清经金属螯合柱亲和层析进一步得到纯化，SJHSP90重组蛋白纯度达到95%。
3.权利要求1所述SjHSP90重组蛋白的的应用，其特征在于，用于诊断血吸虫病。
4.权利要求1所述SjHSP90重组蛋白的的应用，其特征在于，用于血吸虫病的疗效考核。
【文档编号】C07K14/435GK103724414SQ201410009408
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2014年1月9日 优先权日:2014年1月9日
【发明者】王晓婷, 戴洋, 戴建荣, 邢云天, 曲国立, 唐建霞, 赵松, 朱荫昌 申请人:江苏省血吸虫病防治研究所