一种提高重组人干扰素α2b天然构象含率的制备工艺的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种提高重组人干扰素α2b天然构象含率的方法，操作如下：将重组人干扰素α2b表达菌体裂解后的菌体裂解液依次用pH不低于7.0的第一透析液和pH低于4的第二透析液进行透析，透析后分离纯化得到天然构象含率高的重组人干扰素α2b。通过采用两步透析法对干扰素α2b进行复性，其中，第二步采用低pH透析的方案，其最初目的在于将进一步降低盐酸胍浓度并更换缓冲体系，同时与去除酸不稳定的杂蛋白。但是通过实验意外发现，这种两步复性法在未降低复性率的同时，可以极大地提高天然构象干扰素的得率，促使SMM及聚集体或中间态向天然构象转化，降低SMM及聚集体含量。
【专利说明】一种提高重组人干扰素Cl 2b天然构象含率的制备工艺
【技术领域】
[0001]本发明涉及蛋白质药物生产领域，具体涉及一种提高重组人干扰素a 2b天然构象含率的方法。
【背景技术】
[0002]干扰素(Interferon,IFN)由英国科学家 Isaacs 和 LinderMann 于 1957 年发现，是一类具有广谱抗病毒活性的蛋白质。根据其氨基酸结构、抗原性和细胞来源，可将其分为三类:a干扰素、β干扰素以及Y干扰素。其中α干扰素是应用较为广泛的一类干扰素，临床上主要用于治疗乙型肝炎、丙型肝炎等病毒性疾病；也用于一些肿瘤化疗药物的联合用药。
[0003]α干扰素至少有20种以上的不同亚型，其家族成员具有相似的结构特点:氨基酸数目为165或166，氨基酸成分相似，不同亚型间氨基酸序列同源性为70%，第1、29、98/99和138/139位上的半胱氨酸非常保守，形成两个二硫键(C1-C98、C29-C138，或C1-C99、C29-C139), 二硫键对干扰素α的正确折叠、维持干扰素的立体结构和生物学活性十分重要。
[0004]干扰素中两对二硫键的形成是正确折叠的关键。两对二硫键的形成需要不同的氧化还原条件，其中C29-C139容易形成，而C1-C99则需要更强的氧化条件。因此，常规方法复性的α干扰素在氧化型电泳中存在快迁移单体(FMM)和慢迁移单体(SMM)，一般认为:SMM是由于其一对二硫键(Cl一C99)没有配对所造成的。SMM可以视作复性过程的一种中间体，在一定条件下可以向Nature(天然构象,N)构象转化,这种转化需要较高的氧化条件；同时也容易形成链间二硫键而聚集形成寡聚物(Oligomer)。
[0005]
N^―— SMM 5*=^ Oligomer
[0006]N构象是指与人体自身分泌干扰素具有同样构象的一种存在，同SMM及Oligomer比较，其具有比活高、免疫原性低；人体依从性好等特征。
[0007]采用高浓度盐酸胍溶解，随后逐步降低盐酸胍浓度是蛋白质复性的最常用方法之一，降低盐酸胍浓度可以采用稀释或透析两种方法。而稀释液或透析液往往都采用偏碱性的缓冲体系。较为常规/简单的复性液(稀释液或透析液)基础组分为pH为8左右的磷酸缓冲液或Tris-盐酸缓冲液。为了有效地促进SMM向N构象转化，人们会在上述基础复性液中加入氧化还原对，以期提高复性效率，常用的氧化还原对有还原型和氧化型的谷胱甘肽(GSH / GSSG)，其使用浓度为I~3mMGSH，GSH与GSSG比例为I~10:1。但是，由于较高的氧化环境及碱性条件，甲硫氨酸的硫醚基团可能被氧化成亚砜或砜，如文献(刘云东，“复合干扰素包涵体折叠复性、分离纯化及稳定性研究”)认为甲硫氨酸氧化会在“反相上出现保留时间时间较天然结构小的杂峰”，如图4所示，在含有GSH / GSSG的复性液的实施例中，该杂峰含量明显增加。
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于提供一种提高重组人干扰素a 2b天然构象含率的方法，其可有效提高重组人干扰素a 2b中天然构象含率。
[0009]为实现上述目的，本发明采用以下方案进行实施:
[0010]一种提高重组人干扰素a 2b天然构象含率的方法，操作如下:
[0011]将重组人干扰素α 2b表达菌体裂解后的菌体裂解液依次用pH不低于7.0的第一透析液和PH低于4的第二透析液进行透析，透析后分离纯化得到天然构象含率高的重组人干扰素ct 2b。
[0012]通过采用两步透析法对干扰素α 2b进行复性，其中，第二步采用低pH透析的方案，其最初目的在于将进一步降低盐酸胍浓度并更换缓冲体系，同时与去除酸不稳定的杂蛋白。但是通过实验意外发现，这种两步复性法在未降低复性率(即复性液中α干扰素的总含量)的同时，可以极大地提高天然构象干扰素的得率，促使SMM及聚集体或中间态向天然构象转化，降低SMM及聚集体含量。
[0013]进一步的方案为:
[0014]第一透析液的pH为7.0~8.0，第二透析液的pH为2.0~3.6。
[0015]第一透析液为TriS-盐酸、巴比妥钠-盐酸、硼酸-硼砂、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠中一种或几种配制的碱性缓冲液。第一透析液为饮用水或纯净水。第二透析液为醋酸-醋酸钠、甘氨酸-盐酸、邻苯二甲酸-盐酸、磷酸氢二钠-柠檬酸、柠檬酸-柠檬酸钠中一种或几种配制的酸性缓冲液，另外第二透析液也可为醋酸的水溶液、盐酸的水溶液。用第一、二透析液透析时所用透析袋的透过`分子量为8000D。
[0016]上述只是列举了几种可以作为第一、二透析液的溶液体系，当然本领域技术人员可以根据上述列举的溶液体系以及其所起的作用，结合本领域技术人员常规手段和公知常识而进行相应的改变，用其他溶液体系进行替换，也即是说，本发明中的第一、二透析液不限于上述限定的溶液体系。
[0017]在实现本发明目的的基础上，通过后续的大量实验和研究发现，温度对复性结果也有一定的影响，特别是在第二透析液中进行透析时。对温度的研究结果表明，当用第二透析液透析的温度为4~15°C的条件下，天然构象含量无明显改善；在28~33°C的条件下，天然构象可以达到80% ；当温度升至37°C时，虽然SDS-PAGE与RP-HPLC结果无明显变化，但蛋白总回收率降低至原来的一半。
[0018]因此，本发明中进一步的方案为:
[0019]第一透析液透析的温度为4~10°C、时间为12~24h条件下完成的。第二透析液透析的温度为20~37°C、时间为12~24h完成。
[0020]更为具体的方案为，菌体与盐酸胍按照1:2~5 (w/v)的质量体积比混合进行裂解。重组人干扰素α 2b表达菌体为表达重组人干扰素a 2b大肠杆菌。分离纯化包括第二透析液透析后对重组人干扰素a 2b菌体裂解液进行离心,过滤回收上清液,然后将上清液经单抗亲和层析吸附及洗脱，收集得到天然构象含率高的重组人干扰素a 2b。
[0021]通过上述的实施，可将正确复性率(Nature构象的比重)从40%提升至80%。其中RP-HPLC主峰含量从15%提升至60%，大大提高天然构象含量，减小了纯化压力。另外，在复性过程中，采用菌体裂解液直接透析的方法，省去了包涵体洗涤及离心收集沉淀及溶解这一步骤，大大缩短了重组人干扰素a 2b纯化提取的工艺流程。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1为干扰素a 2b对照品的RP-HPLC图谱；
[0023]图2为实施例1所获产品的RP-HPLC图谱；
[0024]图3为实施例2所获产品的RP-HPLC图谱；
[0025]图4为实施例3所获产品的RP-HPLC图谱；
[0026]图5为实施例1~3中所获干扰素a 2b的氧化和还原型电泳图谱。
【具体实施方式】
[0027]以下结合【具体实施方式】来对本发明作进一步的说明。
[0028]目前，大多采用的是蛋白回收率及活性回收率来考察复性效率，这种研究存在的局限在于:由于相关蛋白与天然构象差异较小，其比活性差异更微乎其微，且比活测定采用细胞抑制法也存在较大误差，因此采用上述考察方法，所得到的复性率的概念大多指的是复性液中可溶性干扰素的含量，所指是复性收率这一概念。无法真实准确反映天然构象含量的实际情况；而由于复性液中杂质/杂蛋白的干扰，亦无法直接通过RP-HPLC或SDS-PAGE来考察。
[0029]为了充分验证复性结果的可靠性和准确性，本发明中采用单抗亲合层析这一技术对复性结果予以评价:单抗层析介质采用抗原抗体结合原理，专一性捕获干扰素及其相关蛋白(包括各种异构体及聚集体)而不与杂蛋白结合，将复性液直接与单抗衔接，通过洗脱峰蛋白含量测定来考察回收率:以避免其他降解途径的干扰；对洗脱峰进行SDS-PAGE与RP-HPLC检测，来考察天然构象的含量。
[0030]SDS-PAGE可以较为有效的鉴别α干扰素SMM、FMM以及寡聚物(Oligomer)，寡聚物由于分子量大，位于凝胶上方；SMM由于一条二硫键未配对,导致其表观分子量偏大,其迁移率略低于FMM，紧邻于FMM的上方；FMM位于凝胶的最下方，其二硫键完全配对，即为上文所述的天然构象。
[0031]天然构象指的是二硫键正确配对的干扰素，但是其成分也是不均质的，主要原因是其存在N末端修饰、以及化学降解所造成的同分异构体，这些成分不能在SDS-PAGE上得到分离，但是确可以在RP-HPLC得到鉴别。如图3、图5所示。
[0032]有鉴于此，本发明中采用SDS-PAGE与RP-HPLC相结合的方法，一则可以降低单一检测方法的误差；二则通过RP-HPLC的同步考察，可以验证该复性方案未给α干扰素带来新的修饰(蛋白酶酶切或化学降解)。
[0033]以下采取具体操作方法对本发明作详细说明，为了充分说明本方法具有的显著优势，其中实施例1复性液为pH为8.3的Tris-盐酸，ImMEDTA ;实施例2第一步复性液为Tris-盐酸，pH8.3，ImMEDTA, 3mMGSSG / ImMGSH，第二步复性液同实施例1 一致，目的在于去除氧化还原对；实施例3~7是对本发明的具体阐述。
[0034]实施例1
[0035]重组人干扰素a 2b菌体按1:3 (重量/体积)的比例加入6M盐酸胍/0.1M硼酸，4°C搅拌裂解4h;[0036]上述裂解液经50mMTris-盐酸，pH为8.3，ImMEDTA进行透析。裂解液与透析液比例为1:40,期间更换透析液4次,透析时间48h,温度2~8°C。所获蛋白溶液经8000rpm/15min离心取上清。
[0037]亲和层析吸附及洗脱:将上述上清调pH至7.4，离心后上单抗亲合层析柱，PBS洗涤后，1%醋酸洗脱，收集洗脱液。计算蛋白量，并利用RP-HPLC、SDS-PAGE检测N构型含量，结果如图2及表1所示。
[0038]实施例2
[0039]重组人干扰素a 2b菌体按1:3 (重量/体积)比例加入6M盐酸胍/0.1M硼酸，4°C搅拌裂解4h。
[0040]上述裂解液依次用第一、二透析液进行透析，温度2~8°C。裂解液与透析液比例为1:40，期间更换第一、二透析液各2次，透析总时间48h。其中，第一透析液为50mMTris-盐酸，pH8.3, 1mMEDTA, 3mMGSSG / ImMGSH，第二透析液为 20mMTris-盐酸，ρΗ8.3，ImMEDTA。所获蛋白溶液经8000rpm/15min离心取上清。
[0041]亲和层析吸附及洗脱:将上述上清调pH至7.4，离心后上单抗亲合层析柱，PBS洗涤后，1%醋酸洗脱，收集洗脱液。计算蛋白量，并利用RP-HPLC、SDS-PAGE检测N构型含量，结果如附图3及表1所示。
[0042]实施例3
[0043]重组人干扰素a 2b菌体按1:3 (重量/体积)比例加入6M盐酸胍/0.1M硼酸，4°C搅拌裂解4h。上述裂解液经依次用第一、二透析液进行透析。第一透析液透析时温度为4°C，第二透析液透析时温度为28°C。裂解液与透析液比例为1:40，期间更换第一、二透析液各2次，对第一透析液透析时间为24h，对第二透析液透析时间为24h。其中第一透析液为
0.lMPBS，pH7.4，第二透析液为40mM醋酸钠/醋酸，pH3.6。所获蛋白溶液经8000rpm/15min离心取上清。
[0044]亲和层析吸附及洗脱:将上述上清调pH至7.4，离心后上单抗亲合层析柱，PBS洗涤后，1%醋酸洗脱，收集洗脱液。计算蛋白量，并利用RP-HPLC、SDS-PAGE检测N构型含量，结果如附图3及表1所示。
[0045]实施例4:
[0046]重组人干扰素a 2b第二透析液菌体按1:2(重量/体积)比例加入6Μ盐酸胍/0.1M硼酸，4°C搅拌裂解4h。上述裂解液依次用第一、二透析液进行透析。第一透析液透析时温度为8°C，第二透析液透析时温度为30°C。裂解液与透析液比例为1:40，期间更换第一、二透析液各2次，对第一透析液透析时间12h，对第二透析液透析时间24h。其中第一透析液为pH7.2的饮用水，第二透析液为IOmM盐酸pH2.0。所获蛋白溶液经8000rpm/15min离心取上清。
[0047]亲和层析吸附及洗脱:将上述上清调pH至7.4，离心后上单抗亲合层析柱，PBS洗涤后，1%醋酸洗脱，收集洗脱液。计算蛋白量，并利用RP-HPLC、SDS-PAGE检测N构型含量，结果如表1所示。
[0048]实施例5
[0049]重组人干扰素a 2b菌体按1:3 (重量/体积)比例加入6M盐酸胍/0.1M硼酸，4°C搅拌裂解4h。上述裂解液依次用第一、二透析液进行透析。第一透析液透析时温度为10°C，第二透析液透析时温度为33°C。裂解液与透析液比例为1:40，期间更换第一、二透析液各2次，对第一透析液透析时间12h，对第二透析液透析时间24h。
[0050]其中第一透析液为0.lMPBSpH7.0，第二透析液为20mM磷酸氢二钠-柠檬酸pH2.4。所获蛋白溶液经8000rpm/15min离心取上清。
[0051]亲和层析吸附及洗脱:将上述上清调pH至7.4，离心后上单抗亲合层析柱，PBS洗涤后，1%醋酸洗脱，收集洗脱液。计算蛋白量，并利用RP-HPLC、SDS-PAGE检测N构型含量，结果如表1所示。
[0052]实施例6
[0053]重组人干扰素a 2b第二透析液菌体按1:5(重量/体积)比例加入6Μ盐酸胍/0.1M硼酸，4°C搅拌裂解4h。
[0054]上述裂解液依次用第一、二透析液进行透析。第一透析液透析时温度为4°C，第二透析液透析时温度为33°C。裂解液与透析液比例为1:40，期间更换第一、二透析液各2次，对第一透析液透析时间24h,对第二透析液透析时间24h。其中第一透析液为50mMTris-盐酸，pH8.0,第二透析液为40mM柠檬酸/柠檬酸钠，pH4.0。所获蛋白溶液经8000rpm/15min离心取上清。
[0055]亲和层析吸附及洗脱:将上述上清调pH至7.4，离心后上单抗亲合层析柱，PBS洗涤后，1%醋酸洗脱，收集洗脱液。计算蛋白量，并利用RP-HPLC、SDS-PAGE检测N构型含量，结果如表1所示。
[0056]实施例7
[0057]重组人干扰素a 2b第二透析液菌体按1:3(重量/体积)比例加入6Μ盐酸胍/0.1M硼酸，4°C搅拌裂解4h。
[0058]上述裂解液依次用第一、二透析液进行透析。第一透析液透析时温度为4°C，第二透析液透析时温度为37°C。裂解液与透析液比例为1:40，期间更换第一、二透析液各2次，对第一透析液透析时间24h，对第二透析液透析时间24h。其中第一透析液为
0.1MPBSPH7.4，第二透析液为40mM醋酸钠/醋酸，pH3.6。所获蛋白溶液经8000rpm/15min离心取上清，结果如表1所示。
[0059]亲和层析吸附及洗脱:将上述上清调pH至7.4，离心后上单抗亲合层析柱，PBS洗涤后，1%醋酸洗脱，收集洗脱液。计算蛋白量，并利用RP-HPLC、SDS-PAGE检测N构型含量，结果如表1所示。
[0060]表1为实施例1~7中的检测结果
【权利要求】
1.一种提高重组人干扰素a 2b天然构象含率的方法，操作如下: 将重组人干扰素a 2b表达菌体裂解后的菌体裂解液依次用pH不低于7.0的第一透析液和PH低于4的第二透析液进行透析，透析后分离纯化得到天然构象含率高的重组人干扰素 a 2b。
2.如权利要求1所述的提高重组人干扰素a2b天然构象含率的方法，其特征在于:第一透析液的pH为7.0~8.0，第二透析液的pH为2.0~3.6。
3.如权利要求1或2所述的提高重组人干扰素a2b天然构象含率的方法，其特征在于:第一透析液为Tris-盐酸、巴比妥钠-盐酸、硼酸-硼砂、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠中一种或几种中一种或几种配制的碱性缓冲液，或者第一透析液为饮用水或纯净水。
4.如权利要求1或2所述的提高重组人干扰素a2b天然构象含率的方法，其特征在于:第二透析液为醋酸-醋酸钠、甘氨酸-盐酸、邻苯二甲酸-盐酸、磷酸氢二钠-柠檬酸、柠檬酸-柠檬酸钠中一种或几种配制的酸性缓冲液。
5.如权利要求1或2所述的提高重组人干扰素a2b天然构象含率的方法，其特征在于:第一透析液透析的温度为4~10°C、时间为12~24h。
6.如权利要求1或2所述的提高重组人干扰素a2b天然构象含率的方法，其特征在于:第二透析液透析的温度为20~37°C、时间为12~24h。
7.如权利要求1或2所述的提高重组人干扰素a2b天然构象含率的方法，其特征在于:菌体裂解是利用盐酸胍/硼酸进行裂解，菌体与盐酸胍/硼酸按照1:2~5 (w/v)的质量体积比混合裂解。
8.如权利要求1或2所述的提高重组人干扰素a2b天然构象含率的方法，其特征在于:分离纯化包括第二透析液透析后对菌体裂解液进行离心，过滤回收上清液，然后将上清液经单抗亲和层析吸附及洗脱，收集得到天然构象含率高的重组人干扰素a 2b。
9.如权利要求1或2所述的提高重组人干扰素a2b天然构象含率的方法，其特征在于:重组人干扰素a 2b表达菌体为表达重组人干扰素a 2b的大肠杆菌。
10.如权利要求1或2所述的提高重组人干扰素a2b天然构象含率的方法，其特征在于:用第一、二透析液透 析时所用透析袋的透过分子量为8000D。
【文档编号】C07K1/22GK103804486SQ201410027089
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2014年1月20日 优先权日:2014年1月20日
【发明者】宋礼华, 王荣海, 许培, 董世建, 周乐春, 李增礼, 沈毅 申请人:安徽安科生物工程（集团）股份有限公司