一种检测半胱氨酸的试剂和方法
【专利摘要】本发明提供了一种检测半胱氨酸（Cys）的试剂，它是马来酰亚胺衍生物:N-[4-甲基香豆素-7-基]马来酰亚胺。此试剂由7-氨基-4-甲基香豆素和顺丁烯二酸酐在冰乙酸回流5小时制得，原料便宜，反应条件简单，易于生产。本发明提供了半胱氨酸的定量检测方法，是基于N-[4-甲基香豆素-7-基]马来酰亚胺，在pH为7.4的HEPES溶液中定量地检测半胱氨酸的含量。该检测方法，对半胱氨酸显示了高的灵敏性和选择性，检测过程简便、灵敏、快速，检测结果准确。
【专利说明】一种检测半胱氨酸的试剂和方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及半胱氨酸检测技术，具体涉及一种试剂及其合成方法，以及这种试剂在检测半胱氨酸中的应用。
【背景技术】
[0002]L-半胱氨酸(L-Cys)是20种天然氨基酸中唯一具有还原性基团巯基(_SH)的氨基酸，它在生物体内参与细胞的还原过程及蛋白质、谷胱甘肽的合成。半胱氨酸在医药、食品添加剂及化妆品领域也有着广泛的应用，它可以用于一些抗生素以及治疗皮肤损伤，增强生物体的抗病能力，具有重要的生物化学研究价值。此外，它也可以作为抗辐射剂及抗氧化剂。目前，关于L-Cys的分析方法主要有高效液相色谱法(潘峰，孙玮，张青，等.高效液相色谱法测定血浆中同型半胱氨酸[J].氨基酸和生物资源，2010，32 (4):55-57.)、光度法(陈亚红，李占灵，张会霞.酶抑制动力学光度法测定L-半胱氨酸[J].分析试验室，2008，27 (1):38-41.;刘养清，韩素琴.亚硝酰铁氰化钠法测定复杂样品中半胱氨酸含量的方法研究[J].山西师范大学学报:自然科学版，2000，14 (2):42-45.)、电化学方法(MohammadK.Amini,Jafar H.Khorasani,Shokooh S.Khaloo,et al.Cobalt (II) salophen-modifiedcarbon-paste electrode for potentiometric and voltammetric determination ofcysteine[J].Anal.Biochem, 2003，320:32-38.；N.Maleki，A.Safavi, F.Sedaghati，etal.Efficient electrocatalysis of L—cysteine oxidation at carbon ionic liquidelectrode [J].Anal.Biochem, 2007, 369: 149-153.)等。
[0003]在本发明中，合成了一种基于马来酰亚胺的化合物，通过Cys和化合物在Michael加成反应前后荧光强度的变化，实现Cys的检测。
【发明内容】
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[0004]本发明的目的是提供一种合成简单、操作方便、选择性高、水溶性好的定量检测Cys的试剂，以及该试剂在Cys检测中的应用。
[0005]本发明提供的快速检测Cys的试剂和方法，是基于一种马来酰亚胺衍生物N-[4-甲基香?素-rJ-基]马来酸亚胺(N-[4-Methylcoumarin-7-yl]maleimide),在 pH 为
7.4的HEPES溶液中定量地检测Cys的含量。该检测方法，对Cys显示了高的灵敏性和选择性，检测过程简便、灵敏、快速，检测结果准确。
[0006]该试剂的结构式:
[0007]
【权利要求】
1.一种试剂:特征在于它是N-[4-甲基香豆素-7-基]马来酰亚胺，其结构式为:
2.如权利要求1所述的一种试剂的合成方法，其特征在于，步骤为:7_氨基-4-甲基香豆素和顺丁烯二酸酐按摩尔比1:1完全溶解在冰乙酸中，回流5小时，停止反应；浓缩、冷却后抽滤，并用碳酸钠溶液洗涤，最后用苯重结晶得到土黄色固体。
3.—种检测半胱氨酸的方法:其特征在于，步骤为: (1)、配制pH=7.4、浓度为IOmM的HEPES缓冲溶液，配制2mM的N_[4_甲基香豆素-7-基]马来酰亚胺的甲醇溶液； (2)、按体积比20000:1，将HEPES缓冲溶液和N-[4-甲基香豆素_7_基]马来酰亚胺的甲醇溶液加到干净的荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上检测，随着待测样的加入，398nm的荧光强度逐渐增强； (3)、把2mL的HEPES缓冲溶液、0.1 μ L的Ν_[4_甲基香豆素_7_基]马来酰亚胺甲醇溶液加到另一个荧光比色皿中，分别在加入Cys溶液的体积为0.25,0.50,0.75、1.00、.1.25、1.50、1.75,2.00 μ L时，在荧光分光光度仪上测定398nm对应的荧光强度F为104、.168、236、304、372、436、503、569，以Cys浓度为横坐标，以相对荧光强度F — F。为纵坐标绘制图，Ftl = 39，得到Cys浓度的工作曲线；线性回归方程为:F — F0=-L 61+264.9c, c的单位为μ M ； (4)、将HEPES缓冲溶液2000uL和N-[4-甲基香豆素-7-基]马来酰亚胺甲醇溶液.0.1uL加到干净的荧光比色皿中，用微量进样器吸取V ul待测样品溶液，加入到此干净的荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上检测，将测得的荧光强度代入(3)的线性回归方程，得至丨J浓度c，待测样品Citew=ZOOOuLXcX 10_6/VuL，即可求得Cys的浓度。
【文档编号】C07D405/04GK103788076SQ201410033092
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年1月22日 优先权日:2014年1月22日
【发明者】阴彩霞, 霍方俊, 杨瑜涛 申请人:山西大学