一种从红豆杉细胞培养生产的紫杉醇粗品中纯化紫杉醇的方法
【专利摘要】本发明公开了一种从红豆杉细胞培养生产的紫杉醇粗品中纯化紫杉醇的方法，属化合物纯化领域。本发明采用结晶析出法和正相柱层析法相结合的方法纯化紫杉醇。首先，将红豆杉细胞培养生产的紫杉醇粗品溶解在极性较大的有机溶媒中，然后逐滴加入反向有机溶媒，得到纯度85.0%以上的紫杉醇。然后再采用柱层析法进一步分离纯化紫杉醇，固定相为200目～300目硅胶，流动相为二氯甲烷和乙酸乙酯或正己烷和丙酮的二元梯度混合溶剂。两种方法相结合，解决以往分离方法中不能有效分离紫杉醇与三尖杉宁碱的不足，同时又可以去除难以分离的未知物杂质，最终可得到符合美国药典USP标准的紫杉醇原料药。该方法重复性好、工艺合理、操作简单、绿色安全。
【专利说明】一种从红豆杉细胞培养生产的紫杉醇粗品中纯化紫杉醇的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及紫杉醇的纯化方法，具体涉及一种从红豆杉细胞培养生产的紫杉醇粗品去除难以分离的三尖杉宁碱和未知杂质物纯化得到符合美国药典USP标准的紫杉醇原料药的制备方法，属化合物纯化领域。
【背景技术】
[0002]紫杉醇是从红豆杉属植物中分离提取的一种具有紫杉烷二萜骨架的新型抗癌药物，也是目前所了解的唯一一种可促进微管聚合和稳定已聚合微管的药物。它对大多数实体肿瘤有强力抑制作用，而对正常细胞基本无影响，尤其对晚期卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌和卡波济氏肉瘤的疗效确切、副作用较小。随着研究的进一步深入，紫杉醇类药物的抗癌作用得到更加广泛的应用，现已成为一线抗癌药物和广谱的抗肿瘤药物。
[0003]作为紫杉醇主要来源的红豆杉类植物属于珍稀物种，在我国被列为国家一级保护植物；并且紫杉醇在红豆杉树皮中含量极低,只约占0.01%。
[0004]所以虽然抗癌药物紫杉醇已在临床上广泛应用，但受原料红豆杉类植物稀有短缺的制约，远远不能满足市场对紫杉醇的需求，目前药源不足已成为限制紫杉醇在临床中大量应用的瓶颈。
[0005]近20年来，为了解决红豆杉资源稀有短缺与紫杉醇需求量日益增加的矛盾问题，人们主要从以下几个方面进行了紫杉醇原料的研究:化学全合成、化学半合成、人工栽培、微生物真菌发酵和红豆杉细胞培养等方法。其中红豆杉细胞培养法由于具有不破坏自然资源、不受自然条件限制、可在生物反应器中进行大规模培养，同时该方法还可生产出前体及其他有抗癌活性化合物等优点。因此，`红豆杉细胞培养生产紫杉醇是当前解决紫杉醇药源问题很有前景的方法。
[0006]广东某药业有限公司利用红豆杉细胞大量培养技术生产紫杉醇的研究已经进行了一段时间，目前已经进入到中试放大阶段。所以从红豆杉细胞培养生产紫杉醇粗品中纯化得到符合美国药典USP标准的紫杉醇原料药的制备方法的研究和应用显得尤为重要。广东某药业有限公司采用红豆杉细胞培养生产的紫杉醇，其生产过包括生物因素、物理因素、化学因素等多个影响因素，在紫杉醇提纯过程中含有一些未知物非常难以除去。任何一个影响因素都会关系到紫杉醇的生产效率，同时也会影响到三尖杉宁碱和未知杂质物的含量。而且作为临床使用的药品，要求其纯度很高，美国药典USP标准的紫杉醇原料药要求其未知杂质不超过0.1%，欧洲药典EP标准则要求不超过0.05%。
[0007]另一方面，紫杉醇资源珍贵、价格高昂，分离的纯度和收率成为制备紫杉醇原料药成本的关键因素。基于上述因素，从利用红豆杉细胞培养生产的紫杉醇粗品中纯化得到符合美国药典USP标准的紫杉醇原料药的制备方法以及新型的纯化工艺已成为紫杉醇研究中的焦点问题。而对红豆杉细胞培养生产的紫杉醇粗品进行纯化，有效分离难以去除的一些未知物，最后得到符合美国药典USP标准的紫杉醇原料药的制备方法目前未见相关报道。
目前常用的纯化紫杉醇与紫杉醇类似化合物的方法主要有柱层析法、结晶析出法、薄层色谱法、胶束动电色谱法、膜分离法、树脂吸附分离法、化学反应法等。但是，能够真正适用于今后大规模生产的仅有柱层析法和结晶析出法两种，其他方法都只局限于实验室研究。
[0008]有关紫杉醇纯化的专利申请有多项:如中国专利CN 1611496A“一种利用高压液相色谱制备高纯度紫杉醇的方法”；中国专利CN 03135916.7 “从紫杉醇粗产品纯化紫杉醇的方法”；中国专利CN200610117672.6 “一种高纯度紫杉醇化合物的制备方法”；中国专利CN201310251956.4“一种从紫杉醇浸膏纯化紫杉醇的方法”;中国专利CN 200480009790.4“从天然原料分离和提纯紫杉醇的改进方法”;中国专利CN200610047378.2“一种高效纯化紫杉醇的方法”等。现有紫杉醇纯化方法的不足之处主要在于:目前各种纯化紫杉醇的方法尚不能够有效完全地从紫杉醇粗品分离去除三尖杉宁碱和未知杂质物；包括正相柱法和反相柱法的柱层析法及结晶析出法均存在一定的缺陷。正相柱层析法往往需要引入氧化反应，通过改变三尖杉宁碱的化学结构，以增加三尖杉宁碱与紫杉醇的分离度，而且要多次过柱，同时对未知杂质物的去除也满足不了要求。重要的是，繁琐的操作步骤降低了紫杉醇的收率，增加了生产成本，虽能得到较纯的紫杉醇，但改变了三尖杉宁碱结构，只能被当做废料丢弃，既浪费资源又污染环境。反相柱层析法虽然不用改变分离对象的化学结构，但在实际应用中该方法需要使用特制且价格昂贵的的反相柱硅胶，大大增加了分离紫杉醇的生产成本，限制了其广泛应用。 结晶析出法使得紫杉醇收率低，损失大，无疑也增加了分离紫杉醇的生产成本，而且该法也不能完全有效的分离去除和紫杉醇结构非常相似的紫杉烷类化合物-三尖杉宁碱及一定量难以去除的一些未知物。
【发明内容】
[0009]本发明目的在于以红豆杉细胞培养生产的紫杉醇粗品为原料，提供一种分离纯化方法，得到符合美国药典USP标准的紫杉醇原料药，满足提高紫杉醇收率、降低成本及适合工业化生产的实际需求。
[0010]为实现本发明目的，技术方案如下:采用结晶析出法和正相柱层析法相结合的方法分离紫杉醇；首先，将红豆杉细胞培养生产的紫杉醇粗品溶解在极性较大的有机溶媒中，使紫杉与有机溶媒质量体积比在0.04-0.10 g /mL，然后逐滴加入反向有机溶媒，得到提纯的紫杉醇；然后再采用正相柱层析法进一步分离紫杉醇:固定相为200目~300目硅胶，流动相为二氯甲烷和乙酸乙酯或正己烷和丙酮的二元梯度混合溶剂。所述的极性较大的有机溶媒选丁醇、丙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙酸丁脂或二氯甲烷；所述的反向有机溶媒为戊烷、异戊烷、正己烷、环己烷、异辛烷或石油醚。
[0011]滴加反向有机溶媒，初始时反向有机溶媒:有机溶媒的体积比=(10-30):(90-70)，最终时反向有机溶媒:有机溶媒体积比=(80-60):(20-40)。
[0012]采用正相柱层析法分离紫杉醇时流动相采用二氯甲烷:乙酸乙酯体积比分别为3:1、2:1及1:1的二元梯度洗脱体系；或采用正己烷:丙酮体积比分别为4:1、3:1及2:1的二元梯度洗脱体系。
[0013]根据调整Rf值，流动相二氯甲烷和乙酸乙酯或正己烷和丙酮的混合溶剂回收循环使用。
[0014]本发明创新点在于:采用结晶析出法和正相柱层析法相结合的方法分离红豆杉细胞培养生产紫杉醇粗品中难以分离去除的三尖杉宁碱和未知物，最后得到符合美国药典USP标准的紫杉醇原料药。本发明重复性好、工艺合理、成本低、操作简单、绿色安全，既可满足提高紫杉醇收率、降低生产成本的要求，又能满足适合工业化生产的实际需求，且三尖杉宁碱不被氧化，可以再利用，具有良好的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1为本发明实施例1纯化后紫杉醇的HPLC图谱；
图2为本发明实施例2纯化后紫杉醇的HPLC图谱；
图3为本发明实施例3纯化后紫杉醇的HPLC图谱；
图4为中国药品生物制品检定所含量99.6%紫杉醇对照品的HPLC图谱。
【具体实施方式】
[0016]为对本发明进行更好地说明，举实施例如下:
实施例1
在150 mL的单口烧瓶中，加入红豆杉细胞培养生产的紫杉醇粗品(广东某药业有限公司生产提供，其中紫杉醇含量63.0 %，三尖杉宁碱和未知物分别为1.74 %和3.56 %)
1.20 g,然后加入极性较大的有机溶媒-分析纯丙醇18.9 mL,使紫杉醇质量g/丙醇体积mL=0.04 g/mL，充分搅拌直至完全溶解样品，然后向该体系中慢慢滴加反向有机溶媒-分析纯戊烷2.10 mL，使戊烷:丙醇=10:90 (体积比)，充分搅拌10 min ;然后再逐滴加入戊烷
2.63 mL，使戊烷:丙醇=20:80 (体积比)，充分搅拌10 min ；10.0 %递增速率逐渐提高戊烷的体积含量，慢慢滴加，直至单口烧瓶中的溶液出现絮状物，充分搅拌1.5 h以上；而后仍然10.0 %递增速率逐渐提高戊烷的体积含量，慢慢滴加后充分搅拌10 min，直至戊烷:丙醇=60:40 (体积比)。最后，采用G4砂芯漏斗过滤，真空40-°C干燥后得到纯度为85.1 %紫杉醇样品0.74 g，收率为83.3 %。
[0017]然后以0.74 g纯度为85.1 %的紫杉醇样品为原料进行正相柱层析:原料用少量二氯甲烷溶解以备湿法上样；固定相为200目~300目硅胶，硅胶与原料质量比为100:1 ；流动相采用二氯甲烷:乙酸乙酯=3:1、2:1、1:1 (体积比)二元梯度洗脱体系；采用二氯甲烷湿法装柱，然后上样，最后用配好的流动相进行冲柱洗脱。二氯甲烷:乙酸乙酯=3:1(体积比)流动相冲2.1个柱体积后，开始有三尖杉宁碱流出，经0.5个柱体积后，为单一紫杉醇流出，然后换为二氯甲烷:乙酸乙酯=2:1 (体积比)流动相，经4.9个柱体积后紫杉醇可被完全分离出来，最后使用二氯甲烷:乙酸乙酯=1:1 (体积比)流动相洗脱1.6个柱体积以去除未知杂质物。一次洗脱后纯度98.9 %的紫杉醇占80.7 %，进一步结晶提纯；其他紫杉醇流出液合并得到纯度96.2 %紫杉醇占19.3 %，与紫杉醇粗品结晶后的较纯样品合并上柱分离。最后进一步结晶提纯的样品在P2O5存在条件下真空40-°C干燥48 h，经检测获得符合美国药典USP标准的紫杉醇原料药。(分离提纯过程用HPLC进行监测分析。)
样品分析结果见表1，其H PLC图谱见图1所示，其他技术指标经检测也均符合美国药典USP标准。[0018]实施例2
在100 mL的单口烧瓶中，加入红豆杉细胞培养生产的紫杉醇粗品(广东某药业有限公司生产提供，其中紫杉醇含量65.0 %，三尖杉宁碱和未知物含量分别为1.80 %和3.51 %)
1.20g，然后加入极性较大的有机溶媒-分析纯乙酸乙酯11.1 mL，使紫杉醇质量g/乙酸乙酯体积mL=0.07 g/mL，充分搅拌直至完全溶解样品，然后向该体系中慢慢滴加反向有机溶媒-分析纯正己烷2.78 mL，使正己烷:乙酸乙酯=20:80 (体积比)，充分搅拌10 min ;然后再逐滴加入正己烷1.98 mL，使正己烷:乙酸乙酯=30:70 (体积比)，充分搅拌10 min ；10.0%递增速率逐渐提高正己烷的体积含量，慢慢滴加，直至单口烧瓶中的溶液出现絮状物，充分搅拌1.5 h以上；而后仍然以10.0 %递增速率逐渐提高正己烷的体积含量，慢慢滴加后充分搅拌10 min，直至正己烷:乙酸乙酯=70:30 (体积比)。最后，采用G4砂芯漏斗过滤，再经真空40-°C干燥12 h后得到纯度为85.6 %紫杉醇样品0.76 g，收率为83.4 %。
[0019]以0.76 g纯度为85.6 %的紫杉醇样品为原料进行正相柱层析:原料用少量丙酮溶解以备湿法上样；固定相为200目~300目硅胶，硅胶与原料质量比为100:1 ;流动相采用正己烷:丙酮=4:1 ,3:1,2:1 (体积比)二元梯度洗脱体系；采用正己烷湿法装柱，然后上样，最后用配好的流动相进行冲柱洗脱。正己烷:丙酮=4:1 (体积比)流动相冲4.30个柱体积后，开始有三尖杉宁碱流出，经1.4个柱体积后，为单一紫杉醇流出，然后换为正己烷:丙酮=3:1 (体积比)流动相，经6.2个柱体积后紫杉醇可被完全分离出来，最后使用正己烷:丙酮=2:1 (体积比)流动相洗2.3个柱体积以去除未知杂质物。一次洗脱后纯度99.2 %的紫杉醇占81.5 %，进一步结晶提纯；其他紫杉醇流出液合并得到纯度96.4 %紫杉醇占18.5 %，与紫杉醇粗品结晶后的较纯样品合并上柱分离。最后进一步结晶提纯的样品在P205存在条件下真空40-°C干燥48 h，经检测可获得符合美国药典USP标准的紫杉醇原料药。(分离提纯过程用HPLC进行监测分析。)
样品分析结果见表1，样品HPLC图谱见图2所示，其他技术指标经检测也均符合美国药典USP标准。
[0020]实施例3
在100 mL的单口烧瓶中，加入红豆杉细胞培养生产的紫杉醇粗品(广东某药业有限公司生产提供，其中紫杉醇含量68.0 %，三尖杉宁碱和未知物含量分别为1.86 %和3.95 %)
1.20g，然后加入极性较大的有机溶媒-分析纯二氯甲烷8.16 mL，使紫杉醇质量g/二氯甲烷体积mL=0.10 g/mL，充分搅拌直至完全溶解样品，然后向该体系中慢慢滴加反向有机溶媒-分析纯异辛烷3.50 mL，使异辛烷:二氯甲烷=30:70 (体积比)，充分搅拌10 min ;然后再逐滴加入异辛烷1.94 mL，使异辛烷:二氯甲烷=40:60 (体积比)，充分搅拌10 min ；10.0%递增速率逐渐提高异辛烷的体积含量，慢慢滴加，直至单口烧瓶中的溶液出现絮状物，充分搅拌1.5 h以上；而后仍然10.0 %递增速率逐渐提高异辛烷的体积含量，慢慢滴加后充分搅拌10 min，直至异辛烷:二氯甲烷=80:20 (体积比)。最后，采用G4砂芯漏斗过滤，再经真空40-°C干燥12 h后得到纯度为87.5 %紫杉醇样品0.78 g，收率为84.3 %。
`[0021]以0.78 g纯度为87.5 %的紫杉醇样品为原料进行正相柱层析:原料用少量二氯甲烷溶解以备湿法上样；固定相为200目~300目硅胶，硅胶与原料质量比为100:1 ;流动相采用二氯甲烷:乙酸乙酯=3:1 ,2:1,1:1 (体积比)二元梯度洗脱体系；采用二氯甲烷湿法装柱，然后上样，最后用配好的流动相进行冲柱洗脱。二氯甲烷:乙酸乙酯=3:1 (体积比)流动相冲2.2个柱体积后，开始有三尖杉宁碱流出，经0.6个柱体积后，为单一紫杉醇流出，然后换为二氯甲烷:乙酸乙酯=2:1 (体积比)流动相，经5.2个柱体积后紫杉醇可被完全分离出来，最后使用二氯甲烷:乙酸乙酯=1:1 (体积比)流动相洗脱1.7个柱体积以去除未知杂质物。一次洗脱后纯度99.5 %的紫杉醇占81.9 %，进一步结晶提纯；其他紫杉醇流出液合并得到纯度96.8 %紫杉醇占18.1 %，与紫杉醇粗品结晶后的较纯样品合并上柱分离。最进一步结晶提纯的样品在P2O5条件下真空40-°C干燥48 h，经检测可获得符合美国药典USP标准的紫杉醇原料药。(分离提纯过程用HPLC进行监测分析。)
样品分析结果见表1，样品HPLC图谱见图3所示，其他技术指标经检测也均符合美国药典USP标准。
[0022]图4为中国药品生物制品检定所含量99.6%紫杉醇对照品的HPLC放大图谱，其中未知物0.082%,三尖杉宁碱0.12%,紫杉醇99.80%。
[0023]表1 3个实施例样品分析结果
【权利要求】
1.一种从红豆杉细胞培养生产的紫杉醇粗品中纯化紫杉醇的方法，其特征在于，采用结晶析出法和正相柱层析法相结合的方法分离紫杉醇，首先，将从红豆杉细胞培养生产的紫杉醇粗品溶解在极性较大的有机溶媒中，使紫杉醇粗品与有机溶媒质量体积比在0.04-0.10 g/mL，然后逐滴加入反向有机溶媒，得到提纯的紫杉醇；然后再采用正相柱层析法进一步分离紫杉醇:固定相为200目~300目硅胶，流动相为二氯甲烷和乙酸乙酯或正己烷和丙酮的二元梯度混合溶剂； 所述的极性较大的有机溶媒选丁醇、丙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙酸丁脂或二氯甲烷；所述的反向有机溶媒为戊烷、异戊烷、正己烷、环己烷、异辛烷或石油醚。
2.如权利要求1所述的从红豆杉细胞培养生产的紫杉醇粗品中纯化紫杉醇的方法,其特征在于，初始时反向有机溶媒:有机溶媒的体积比=(10-30): (90-70)，最终时反向有机溶媒:有机溶媒体积比=(60-80): (40-20)。
3.如权利要求1所述的从红豆杉细胞培养生产的紫杉醇粗品中纯化紫杉醇的方法,其特征在于，采用正相柱层析法分离紫杉醇时流动相采用二氯甲烷:乙酸乙酯体积比分别为3:1、2:1及1:1的二元梯度洗脱体系或采用正己烷:丙酮体积比分别为4:1、3:1及2:1的二元梯度洗脱体系。
4.如权利要求1-3其中之一所述的从红豆杉细胞培养生产的紫杉醇粗品中纯化紫杉醇的方法，其特征在于，根据调整Rf值，流动相二氯甲烷和乙酸乙酯或正己烷和丙酮的混合溶剂回收循环使用。`
【文档编号】C07D305/14GK103819430SQ201410063259
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2014年2月25日 优先权日:2014年2月25日
【发明者】赵俊宏, 李文锋, 樊燕鸽, 薛宝玉, 段显英 申请人:河南省科学院化学研究所有限公司