一种利用双酶协同水解制备金属螯合肽的方法
【专利摘要】本发明提供一种金属（Ca、Fe、Zn）螯合肽，具体涉及一种利用双酶协同水解制备金属螯合肽的方法，以海洋源鱼皮、鱼鳞蛋白为原料，采用复合蛋白酶及风味蛋白酶复配对其进行酶解，分离纯化、冷冻干燥得到金属螯合肽，得到肽的氨基酸序列为：kngedg。氨基酸和小肽具有促进锌吸收的作用，而且氨基酸或肽的金属复合体如Fe、Zn的生物学利用率比无机盐高且无毒副作用。因此，研究开发这种生物态锌-蛋白酶解物螯合锌，具有十分重要的意义。
【专利说明】—种利用双酶协同水解制备金属螯合肽的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种金属(Ca、Fe、Zn)螯合肽，更具体地涉及了一种利用双酶协同水解制备金属螯合肽的方法，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]海洋蛋白源生物活性肽具有极高的营养价值、食用安全性及生理保健功能，在促进机体的生长、发育和疾病防治等方面都起着重要的作用，可作为功能性食品或食品添加剂乃至药品应用到人们日常生活中。
[0003]钙质缺乏是全球性的营养问题，我国人民由于以植物性膳食为主，缺钙的现象更加严重，因此补钙成为我国膳食营养研究中的重要课题。传统的无机钙盐，如碳酸钙、磷酸钙、氯化钙等，对维生素有一定破坏作用，生物学效价较低；有机钙盐，如柠檬酸钙、乳酸钙、葡萄糖钙等，虽然钙吸收率有所提高，但其溶解度大易溶失，且价格高。研究表明，多肽螯合钙由于其独特的螯合体制和转运机制，易被吸收、安全无毒、价格低、可同时补充氨基酸和钙，而成为补钙首选。
[0004]铁对人类健康特别是对婴幼儿和儿童的生长发育有重要作用。虽然大分子蛋白质也可以与铁离子结合，但这些大分子蛋白质本身也存在相对分子质量较大而很难通过肠黏膜的问题。而研究发现，氨基酸、多肽螯合铁可以大大提高铁离子的吸收率。
[0005]尽管自然界中锌源十分丰富，但锌在人体内的吸收代谢受种种因素的限制，锌缺乏已成为我国及许多发展中国家的公共卫生问题。研究发现氨基酸和小肽具有促进锌吸收的作用，而且氨基酸或肽的金属复合体如Fe、Zn的生物学利用率比无机盐高且无毒副作用。因此，研究开发这种生物态锌-蛋白酶解物螯合锌，具有十分重要的意义。
[0006]因此，如何获得具有金属螯合活性的肽，就成为制备新型金属元素补充剂迫切的研究方向。
【发明内容】
[0007]为了解决上述问题，本发明提供了一种利用双酶协同水解制备金属螯合肽的方法，使金属(Ca、Fe、Zn)螯合活性得以高效地实现。
[0008]为实现上述目的，本发明采用如下技术方案:
一种金属螯合肽，是由6个氨基酸所构成的肽，所述肽的氨基酸序列为:kngedg。
[0009]所述的金属为Ca、Fe或Zn。
[0010]一种金属螯合肽 的制备方法，以海洋源鱼皮、鱼鳞蛋白为原料，采用复合蛋白酶及风味蛋白酶复配对其进行酶解，分离纯化、冷冻干燥得到金属螯合肽。
[0011]酶解条件为:底物浓度5%，酶解pH为7.0、温度49°C、酶解时间为7小时、酶-底物重量配比为1:25 ;所述酶为复合蛋白酶和风味蛋白酶，两种酶的重量复配比为复合蛋白酶:风味蛋白酶=2:1。
[0012]所述分离纯化的具体步骤为:酶解产物首先利用TOYOPEARL DEAE-650M阴离子交换色谱进行分离，洗脱液为浓度梯度为含有o-0.5 mol/L NaCl的0.02 mol/L、pH 9.0的磷酸缓冲液，流速为0.5 mL/min,洗脱峰在214 nm下进行测量；收集具有最高金属螯合活性的峰，再用Sephadex G-25凝胶过滤色谱进行分离,洗脱液为去离子水,流速为0.3 mL/min,洗脱峰在214 nm下进行测定；收集具有最高金属螯合活性的峰，利用半制备RP-HPLC-C18反相高效液相色谱再进行进一步分离，分离条件是用体积比为0-30%乙腈溶液作为洗脱液梯度洗脱，流速为4 mL/min，收集具有最高金属螯合活性的峰，再利用RP-HPLC-C18反相高效液相色谱再进行进一步的分离，反相HPLC的分离条件是用10-90%乙腈溶液作为梯度洗脱液，流速为lmL/min，洗脱液自含体积比为10%乙腈和90%水的混合液开始，至体积比为90%乙腈和10%水的混合液结束，进行梯度洗脱，收集体积比5%乙腈和85%水处的洗脱峰，得到金属螯合肽。
[0013]本发明立足于多肽具备与金属离子螯合的作用位点，能够与其形成稳定的化合物，且多肽-金属螯合物具有独特的螯合体制和转运机制，易被吸收、可同时补充氨基酸和金属的理论基础，以来自于鱼皮、鱼鳞蛋白为原材料，通过复合蛋白酶及风味蛋白酶的切割条件控制，切割制备具有高金属(Ca、Fe、Zn)螯合活性的肽，而使金属螯合活性得以高效地实现。本发明为海洋源蛋白的应用提供了一条新思路。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1纯化海洋源蛋白金属螯合肽的CLC - HPLC-C18色谱图。
【具体实施方式】
[0015]实施例1
制备方法如下:
(1)海洋源蛋白酶解条件的优化
本技术所采用的海洋源蛋白来自于实验室自制，酶购自诺维信生物技术有限公司(中国?天津)。采用单因素实验，分别对四个酶解因素进行考察，分别为底物浓度(1%，3%，5%和7%)、酶解温度(40，50，55和60 °C )、酶的复配比(复合蛋白酶:风味蛋白酶=1: 1，1: 2，1:3和 2:1 w/w)，酶-底物配比(1:100，1:50，1:25 和 1:20 w/w)以及酶解时间(1，3，5，7，9小时)。称取一定质量蛋白溶解于蒸馏水中，然后用2mol/L NaOH将其pH调节至7.0。先将该溶液水浴加热到需要温度，接着再按不同的酶-底物配比加入相应量的酶，按照预定的反应时间开始反应。接着再在沸水浴中灭酶10分钟，冷却后再1000Orpm离心10分钟。上清液收集后，分别对金属(Ca、Fe、Zn)螯合活性进行测定，以确定最佳酶解条件。得到具有最大金属螯合活性的酶解液的酶解条件是:底物浓度5%，酶解pH为7.0、温度49°C、酶解时间为7小时、酶-底物配比为1:25 (w/w);所述酶为复合蛋白酶和风味蛋白酶，两种酶的复配比为复合蛋白酶:风味蛋白酶=2:1 (w/w)。
[0016]称取5.0克海洋源蛋白溶解于100ml蒸馏水中，然后用2mol/L NaOH将其pH调节至7.0。先将该溶液水浴加热到49°C，接着再按照酶-底物配比为1:25的比例加入相应量的酶，复合蛋白酶与风味蛋白酶的质量比为2:1，酶解时间为7小时。接着在沸水浴中灭酶10分钟，冷却后再1000Orpm离心10分钟，收集上清液备用。
[0017](2)酶解产物的分离、纯化将上清液用TOYOPEARL DEAE-650M阴离子交换色谱(长50 cm，外径1.6cm)进行分离，洗脱液为浓度梯度0-0.5M的NaCl的0.02 mol/L pH 9.0的磷酸缓冲液，流速为0.5 mL/min,收集各峰样品并测定金属(Ca、Fe、Zn)螯合活性。
[0018]对TOYOPEARL DEAE-650M阴离子交换色谱分离的具有最高金属(Ca、Fe、Zn)螯合活性的洗脱峰再进行下一步的分离，用S印adex G-25凝胶过滤色谱收集具有最高金属(Ca.Fe.Zn)螯合活性的峰，再利用分析型RP_HPLC_C18反相高效液相色谱再进行进一步分离，反相HPLC的分离条件是用10-90% (v/v)乙腈溶液作为梯度洗脱液，流速为I mL/min，收集各峰进行金属(Ca、Fe、Zn)螯合活力测定,洗脱液自含10%乙腈和90%水(v/v)的混合液开始，至90%乙腈和10%水(v/v)的混合液结束，进行梯度洗脱，收集5%乙腈和85%水(v/V)处的洗脱峰，即洗脱时间为7.083分钟处的洗脱峰，得到高纯度的金属螯合肽。
[0019]冷冻干燥得到本发明的金属(Ca、Fe、Zn)螯合肽。
[0020](3)金属螯合活性的测试
I)采用邻-甲酚酞比色法，测定金属螯合肽对钙离子的螯合作用。将I mL 5 mmol/L的CaCl2和2 mL 0.2 mol/L的磷酸盐缓冲液(pH 8.0)加入具塞试管中，再加入I mL清蛋白肽溶液，置于恒温加热水浴摇床中37°C温育2h，取出后10000 r/min常温离心10 min。取I mL上清液，加入邻-甲酚酞显色液5 mL，摇匀。放置10 min后于分光光度计570 nm处测定吸光值，将数值代入标准曲线中计算出可溶性钙结合量。
[0021]标准曲线的制作:分别取标准Ca工作液(10 ug/ mL) 0,0.2,0.4,0.6,0.8, 1.0mL于10 mL试管中，分别加去离子水1.0，0.8，0.6，0.4，0.2，O mL，加入邻-甲酚酞显色液5 mL，摇匀，放置10 min后 于分光光度计570 nm处测定吸光值。以可溶性钙含量(ug/ mL)为横坐标，吸光值为纵坐标做图，得标准曲线公式为:y = 0.0974x - 0.0402, R2= 0.9996。
[0022]2)采用邻菲罗啉比色法，测定金属螯合肽对铁离子的螯合作用。将0.05 g样品置于100 mL烧杯中，加入2 mL浓盐酸，待样品完全溶解后，用蒸馏水定容至100 mL容量瓶中。准确吸取5 mL样品液于50 mL容量瓶中，加入I mol/L的HCl溶液I mL，10%的盐酸羟胺I mL，0.12%邻菲罗啉I mL，然后加入10%醋酸钠5 mL，用水稀释至刻度，摇匀。以不加铁的试剂空白溶液作参比液，在510 nm波长处测定吸光度，将数值代入标准曲线中计算出铁结合量。
[0023]标准曲线的制作:吸取10 ug/mL铁的标准溶液0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL,分别置于50 mL容量瓶中，加入I mol/L的HCl溶液I mL，10%的盐酸羟胺I mL，0.12%邻菲罗啉I mL，然后加入10%醋酸钠5 mL，用水稀释至刻度，摇匀。以不加铁的试剂空白溶液作参比液，在510 nm波长处测定吸光度，绘制标准曲线，得标准曲线公式为:y =
0.1717x+0.003，R2= 0.9994。
[0024]采用EDTA滴定法，测定金属螯合肽对锌离子的螯合作用。称量螯合物100 mg于100 mL小烧杯中，加水50 mL，加入6 mol/L盐酸数滴。摇匀后于水浴上加热使之完全溶解，冷却后定容至100 mL,从中吸取10 mL于三角瓶，平3份，加入NH3-NH4CI缓冲液(pH 10) 10mL,铬黑T指示剂适量，然后用0.01 mol/L Na2EDTA液滴至蓝色；纪录消耗EDTA的毫升数，计算螯合物含锌量。
[0025]应用TOYOPEARL DEAE-650M 阴离子交换色谱、Sephadex G-25 分子筛、RP-HPLC 反相高效液相色谱等分离纯化手段，实现显著活性的金属螯合蛋白肽的高效分离纯化。[0026]利用蛋白质测序仪(AppliedBiosystems Model 476A, Perkin Elmer C0.MA,U.S.A)测定金属螯合肽的氨基酸全序列。
[0027]纯化得到的特异性金属螯合肽具有很高的金属(Ca、Fe、Zn)螯合活性，由表1可以看出，与酶解液相比，螯合肽的金属螯合力有了很大提高。
[0028]表1纯化的特异性金属螯合肽的金属螯合力
【权利要求】
1.一种金属螯合肽，其特征在于:所述肽的氨基酸序列为:kngedg。
2.根据权利要求1所述的一种金属螯合肽，其特征在于:所述的金属为Ca、Fe或Zn。
3.—种如权利要求1所述的一种金属螯合肽的制备方法，其特征在于:以海洋源鱼皮、鱼鳞蛋白为原料，采用复合蛋白酶及风味蛋白酶复配对其进行酶解，分离纯化、冷冻干燥得到金属螯合肽。
4.根据权利要求3所述的一种金属螯合肽的制备方法，其特征在于:酶解条件为:底物浓度5%，酶解pH为7.0、温度49°C、酶解时间为7小时、酶-底物重量配比为1:25 ;所述酶为复合蛋白酶和风味蛋白酶，两种酶的重量复配比为复合蛋白酶:风味蛋白酶=2:1。
5.根据权利要求3所述的一种金属螯合肽的制备方法，其特征在于:所述分离纯化的具体步骤为:酶解产物首先利用TOYOPEARL DEAE-650M阴离子交换色谱进行分离，洗脱液为浓度梯度为含有0-0.5 M NaCl的0.02 M、pH 9.0的磷酸缓冲液，流速为0.5 mL/min,洗脱峰在214 nm下进行测量；收集具有最高金属螯合活性的峰，再用Sephadex G-25凝胶过滤色谱进行分离，洗脱液为去离子水，流速为0.3 mL/min，洗脱峰在214 nm下进行测定；收集具有最高金属螯合活性的峰，利用半制备RP-HPLC-C18反相高效液相色谱再进行进一步分离，分离条件是用体积比为0-30%乙腈溶液作为洗脱液梯度洗脱，流速为4 mL/min，收集具有最高金属螯合活性的峰，再利用RP-HPLC-C18反相高效液相色谱再进行进一步的分离，反相HPLC的分离条件是用10-90%乙腈溶液作为梯度洗脱液，流速为lmL/min，洗脱液自含体积比为10%乙腈和90%水的混合液开始，至体积比为90%乙腈和10%水的混合液结束，进行梯度洗脱，收集体积比5%乙腈和85%水处的洗脱峰，得到金属螯合肽。
【文档编号】C07K1/18GK103788193SQ201410079702
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年3月6日 优先权日:2014年3月6日
【发明者】汪少芸, 唐梦茹, 何庆燕, 邵彪, 方卫东, 赵立娜, 江勇 申请人:福州大学