免疫球蛋白恒定区Fc受体结合剂的制作方法

免疫球蛋白恒定区Fc受体结合剂的制作方法
【专利摘要】本发明涉及免疫球蛋白恒定区Fc受体结合剂。自免疫学活性生物模拟物的重组和/或生化创建而衍生IVIG替换化合物。然后，在体外筛选这些替换化合物以评估每种替换化合物在调控免疫功能方面的效率。选择特定的替换化合物以进行进一步体内确认和剂量/施用优化。最后，使用替换化合物来治疗极其多种疾病，包括炎性和自身免疫性疾病。
【专利说明】免疫球蛋白恒定区Fe受体结合剂
[0001]本申请是申请日为2008年05月30日、中国申请号为200880101542.0、发明名称
为“免疫球蛋白恒定区Fe受体结合剂”的发明申请的分案申请。
发明领域
[0002]一般而言，本发明涉及免疫学、炎症、和肿瘤免疫学领域。更具体地，本发明涉及包含免疫球蛋白Fe域的生物学活性生物模拟物分子、包含此类生物模拟物的组合物、和使用此类生物模拟物的方法。
[0003]本发明还涉及由单核细胞衍生细胞介导的病理学疾患的治疗和预防，且更具体地，涉及IgG Fe片段的稳定化功能性部分用于此类治疗和预防的用途。
[0004]发明背景
[0005]自上世纪50年代早期以来便已经使用来自人血浆的免疫球蛋白产物来治疗免疫缺陷病症，并且新近，更通常用于自身免疫性和炎性疾病。
[0006]最初，通过肌肉内注射来施用免疫球蛋白产物。新近，已经使用静脉内免疫球蛋白(IVIG)，而且最初显示有效治疗自身免疫性疾病特发性血小板减少性紫癜(ITP) (ImbachP, Barandun S，d’Apuzzo V 等:High_dose intravenous gammaglobulin for idiopathicthrombocytopenic purpura in childhood.Lancetl981 年 6 月 6 日；I (8232):1228-31)。人IVIG (在本文中称为“hIVIG”)是自合并的人血浆制造的无菌的、纯化的免疫球蛋白G(IgG)产物的配制剂，其通常含有超过95%未修饰的IgG，以及仅少量且可变量的免疫球蛋白 A(IgA)或免疫球蛋白 M(IgM)(参见例如 Rutter A, Luger TA:High_dose intravenousimmunoglobulins:an approach to treat severe immune-mediated and autoimmunediseases of the skin.J Am Acad Dermato12001 年 6 月；44 (6): 1010-24)。目前，hIVIG的单一最常见临床用途是在ITP治疗中。
[0007]虽然hIVIG已经是有效的临床治疗方法，但是hIVIG配制剂有数项缺点，包括不充分无菌性的可能性、杂质的存在、可得性的缺乏、和批次间差异。具体地，hIVIG制品在其免疫球蛋白A(IgA)含量方面可以有极大的变化，这可以是令人忧虑的，因为IgA能在IgA缺陷的接受者中引起变应性和过敏性反应。
[0008]鉴于hIVIG的消极方面，需要治疗自身免疫性和炎性疾病的改良手段。
[0009]另外，自单核细胞衍生的细胞介导极其多种类型的多种病理学疾患。供许多(若不是全部)此类疾患中使用的简单治疗剂和/或预防剂会是无价的。
[0010]发明概述
[0011]IVIG的免疫调节特性存在于IgG分子的Fe域中。例如，在ITP的鼠模型中，未修饰的IVIG和单独的Fe片段两者均证明恢复血小板计数的治疗功效，而分离的 IVIG Fab 片段不是治疗性的(Samuelsson, A.，Towers, T.L.和 Ravetch, J.V.Ant1-1nflammatory Activity of IVIG Mediated Through the Inhibitory FeReceptor.Science291, 484-486 (2001)) ? 此外，Fe (而非 IVIG 的 Fab 片段)在儿童和成人特发性血小板减少性紫癜两者的治疗中也是治疗方面有效的(Follea，G.等.1ntravenous pIasmin-treated gammaglobulin therapy in idiopathicthrombocytopenic purpura.Nouv Rev Fr Hematol27，5-10 (1985);Solal-Celigny，P.，Bernard,J., Herrera, A.和 Biovin，P.Treatment of adult autoimmune thrombocytopenicpurpura with high—dose intravenous pIasmin-cleaved gammaglobulins.Scand JHaematol31, 39-44 (1983) ; DebrejM.和 Bonnet，M._C.1nfusion of Gcgamma fragmentsfor treatment of children with acute immune thrombocytopenic purpura.Lancet342，945-49 (1993) ; Burdachj S.E.，Evers, K.和 Geurson，R.Treatment of acute idiopathicthrombocytopenic purpura of childhood with intravenous immunoglobulinG:Comparative efficacy of7S and 5S preparations.J Pediatrl09，770-775(1986))。
[0012]IVIG的治疗效果最初经由Fe伽马受体(FcyR)介导，并且其长期致耐受性效应(long tolerogenic effect)依赖于树突细胞(DC)-巨嗷细胞对话(cross-talk) □Fe YRIIIa在起始物阶段中发挥必不可少的作用，而Fe YRIIb是ITP的鼠模型中的效应器阶段所需要的(Samuelsson, A.，Towers, T.L 和 Ravetch, J.V.Ant1-1nflammatoryActivity of IVIG Mediated Through the Inhibitory Fe Receptor.Science291, 484-486(2001) ;Siragamj V.等.Intravenous immunoglobulin ameliorates ITP via activatingFe [gamma] receptors on dendritic cells.Nat Medl2，688 (2006)) ?类似地，人研究证明抗Fcy受体抗体有效治疗顽固性ITP(Clarkson，S.等.Treatment of refractoryimmune thrombocytopenic purpura with an ant1-Fc gamma-receptor antibody.NEngl J Med314，1236-1239(1986))。重要的是，长期致耐受性效应是通过细胞-细胞相互作用而介导的，因为经IVIG处理的DC的过继转移有效治疗ITP的鼠模型(Siragam，V.等.1ntravenous immunoglobulin ameliorates ITP via activating Fe[gamma]receptors on dendritic cells.Nat Medl2，688(2006))。
[0013]IVIG的免疫调控效果需要Fe yR的聚集。Fe Y R的聚集是由IVIG中存在的 IgG 二聚物(占全部 IVIG 的 5-15%)介导的(Bleeker, W.K.等.Vasoactive sideeffects of intravenous immunoglobulin preparations in a rat model and theirtreatment with recombinant platelet-activating factor acetylhydroIase.Blood95, 1856-1861 (2000)) o例如，在ITP的鼠模型中，用具有高含量“二聚物”(完整免疫球蛋白分子的二聚物)的IVIG进行的处理增强血小板计数，而IVIG “单体”(完整免疫球蛋白分子)不是有效的(Teeling，J.L.等.Therapeutic efficacy of intravenousimmunoglobulin preparations depends on the immunoglobulin G dimers: studies inexperimental immune thrombocytopenia.Blood98, 1095-1099(2001))。此外，尽管事实是在IVIG的制造中例行使用离子交换树脂和聚乙二醇分级以除去IgG聚集物，但是IVIG的临床功效与患者血清中二聚物的存在相关联(Augener，W.，Friedman, B.和Brittinger，G.Are aggregates of IgG the effective part of high—dose immunoglobulin therapyin adult idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP) ?Blut50，249-252 (1985))。重要的是，二聚物的百分比还与血管活性副作用(其能用乙酰水解酶治疗)相关联(Bleeker，W.K.等.Vasoactive side effec ts of intravenous immunoglobulin preparations ina rat model and their tr eatment with recombinant platelet-activating factoracety!hydrolase.Blood95，1856-1861 (2000))。[0014]本发明涉及生物学活性生物模拟物分子、包含其的组合物、及使用其的方法。这些生物模拟物具有广泛的应用，用于治疗免疫学和炎性病症，包括但不限于自身免疫性疾病，而且它们具有作为用于癌症的生物免疫治疗剂的功效。此外，这些生物模拟物中的某些还具有作为试剂的功效，诸如在用于测试免疫细胞功能的免疫学测定法中和疾病的诊断中使用。此外，本发明的生物模拟物和组合物具有克服上文所列出的hIVIG局限性的优点。本发明还涉及由单核细胞衍生细胞介导的病理学疾患的治疗和预防，且更具体地，涉及IgG Fe片段的稳定化功能性部分用于此类治疗和预防的用途。
[0015]在第一个实施方案中，本发明涉及分离的串联Stradomer,其包含两个或更多个联合的Stradomer单体，其中每个所述Stradomer单体包含两个或更多个Fe域单体，其中所述两个或更多个Stradomer单体的联合形成两个或更多个Fe域，且其中所述串联Stradomer经由所述两个或更多个Fe域之第一个特异性结合第一 Fe Y受体并经由所述两个或更多个Fe域之第二个特异性结合第二 Fe Y受体。在一个优选的实施方案中，所述两个或更多个Stradomer单体是经由共价键、二硫键或化学交联而联合的。
[0016]在本发明的分离的串联Stradomer的一个优选的实施方案中，所述分离的串联Stradomer由两个联合的Stradomer单体构成。在一个同等优选的实施方案中，所述分离的串联Stradomer由两个联合的Stradomer单体构成，其中所述这两个Stradomer单体都包含两个Fe域单体,且其中所述两个Stradomer单体的联合形成两个Fe域。在涉及分离的串联Stradomer的这些实施方案的第一个具体的实例中,所述两个Fe域中至少一个包含IgG铰链和IgG CH2域。在第二个具体的实例中，所述两个Fe域之每一个独立包含IgG铰链和IgG CH2域。在第三个具体的实例中，所述两个Fe域中至少一个包含IgG铰链、IgGCH2域和IgGCH3域。在第四个具体的实例中，所述两个Fe域之每一个独立包含IgG铰链、IgG CH2域和IgG CH3域。在第五个具体的实例中，所述两个Fe域中至少一个包含IgGl铰链或IgG3铰链、IgGlCH2域或IgG3CH2域、和IgGlCH3域或IgG3CH3域。在第六个具体的实例中，所述两个Fe域中至少一个包含IgGl铰链或IgG3铰链、和IgGlCH2域或IgG3CH2域。在第七个具体的实例中，所述两个Fe域之每一个独立包含IgGl铰链或IgG3铰链、IgGlCH2域或IgG3CH2域、和IgGlCH3域或IgG3CH3域。在第八个具体的实例中，所述两个Fe域之每一个独立包含IgGl铰链、IgGlCH2域、和IgGlCH3域。在第九个具体的实例中，所述两个Fe域之每一个独立包含IgG3铰链、IgG3CH2域、和IgG3CH3域。在第十个具体的实例中，所述两个Fe域之每一个独立包含IgGl铰链、IgGlCH2域、和IgG3CH3域。
[0017]又在此第一个实施方案中，所述两个或更多个Fe域各自是相同免疫球蛋白Fe类的，且所述免疫球蛋白Fe类选自下组:IgGl、IgG2、IgG3、和IgG4。或者，所述两个或更多个Fe域各自是不同免疫球蛋白Fe类的，且所述免疫球蛋白Fe类选自下组:IgGl、IgG2、IgG3和 IgG4。
[0018]进一步在此第一个实施方案中，所述第一和第二 Fe Y受体各自独立是Fe Y受体I>Fcy受体I1、Fcy受体III或Fcy受体IV。优选地，所述第一和第二 Fe Y受体各自是Fe Y 受体 Ilia。
[0019]在第二个实施方案中，本发明涉及分离的串联Stradomer，其包含两个联合的Stradomer单体，其中所述Stradomer单体之每一个包含两个Fe域单体,其中所述两个Stradomer单体的联合形成两个Fe域,其中所述两个Fe域之每一个独立包含IgG铰链、IgGCH2域和IgG CH3域,且其中所述串联Stradomer经由所述两个Fe域之第一个特异性结合第一 Fcy受体并经由所述两个Fe域之第二个特异性结合第二 Fcy受体。在一个优选的实施方案中，所述两个或更多个Stradomer单体是经由共价键、二硫键或化学交联而联合的。
[0020]在此第二个实施方案的第一个具体的实例中，所述两个Fe域各自是相同免疫球蛋白Fe类的，且所述免疫球蛋白Fe类选自下组:IgGl、IgG2、IgG3、和IgG4。在第二个具体的实例中，所述两个Fe域各自是不同免疫球蛋白Fe类的，且所述免疫球蛋白Fe类选自下组:IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。在第三个具体的实例中，至少一个所述Fe域包含IgG铰链和IgG CH2域。在第四个具体的实例中，所述Fe域之每一个独立包含IgG铰链和IgG CH2域。在第五个具体的实例中，至少一个所述Fe域包含IgG铰链、IgG CH2域和IgG CH3域。在第六个具体的实例中，所述Fe域之每一个独立包含IgG铰链、IgG CH2域和IgG CH3域。在第七个具体的实例中，至少一个所述Fe域包含IgGl铰链或IgG3铰链、IgGlCH2域或IgG3CH2域、和IgGlCH3域或IgG3CH3域。在第八个具体的实例中，所述Fe域之每一个独立包含IgGl铰链或IgG3铰链、IgGlCH2域或IgG3CH2域、和IgGlCH3域或IgG3CH3域。在第九个具体的实例中，所述Fe域之每一个独立包含IgGl铰链、IgGlCH2域、和IgGlCH3域。在第十个具体的实例中，所述Fe域之每一个独立包含IgG3铰链、IgG3CH2域、和IgG3CH3域。在第
十一个具体的实例中，所述Fe域之每一个独立包含IgGl铰链、IgGlCH2域、和IgG3CH3域。
[0021] 在第三个实施方案中，本发明涉及分离的串联Stradomer,其进一步包含Fab域，其中所述Stradomer单体之每一个包含Fab片段重链和两个Fe域单体,其中所述Fab片段重链在所述两个Fe域单体氨基端或羧基端的位置中，其中Fab片段轻链独立与每个Fab片段重链联合，且其中所述Fab域具有抗原结合活性。在一个优选的实施方案中，所述Stradomer单体之每一个进一步包含免疫球蛋白铰链单体,且其中所述免疫球蛋白铰链单体在所述Fab片段重链和所述两个Fe域单体之间的位置中。
[0022]在第四个实施方案中，本发明涉及核心Stradomer,其包含与两个或更多个核心Stradomer单元连接的核心模块,其中所述两个或更多个核心Stradomer单元之每一个包含至少一个Fe域,且其中所述核心Stradomer单元之每一个独立选自下组:
[0023](a) Fe片段，其中所述Fe片段包含两个联合的Fe片段单体，其中所述Fe片段单体之每一个包含Fe域单体，且其中所述两个Fe片段单体的联合形成Fe域，
[0024](b)Fc部分片段，其中所述Fe部分片段包含两个联合的Fe部分片段单体，其中所述Fe部分片段单体之每一个包含Fe域单体，且其中所述两个Fe部分片段单体的联合形成Fe域，
[0025](c) Fe域，其中所述Fe域包含两个联合的Fe域单体，且其中所述两个Fe域单体的联合形成Fe域，
[0026](d)串联Stradomer,其中所述串联Stradomer包含两个或更多个联合的Stradomer单体,其中所述Stradomer单体之每一个包含两个或更多个Fe域单体,且其中所述两个或更多个Stradomer单体的联合形成两个或更多个Fe域,和
[0027](e)簇Stradomer,其中所述簇Stradomer包含两个或更多个多聚化的簇Stradomer单元,其中所述簇Stradomer单元之每一个包含多聚化区和至少一个Fe域,其中所述簇Stradomer单元之每一个包含两个联合的簇Stradomer单元单体,其中所述簇Stradomer单元单体之每一个包含多聚化区单体和至少一个Fe域单体,其中所述两个簇Stradomer单元单体的联合形成多聚化区和至少一个Fe域,且其中所述两个或更多个簇Stradomer单元的多聚化区进行多聚化以形成所述簇Stradomer,且
[0028]其中所述核心Stradomer经由所述两个或更多个核心Stradomer单元之第一个特异性结合第一 Fe Y受体并经由所述两个或更多个核心Stradomer单元之第二个特异性结合第二 Fe Y受体。
[0029]优选地，在此第四个实施方案中，所述核心模块选自下组:免疫球蛋白J链、清蛋白、脂质体、珠、肽和聚乙二醇。
[0030]在涉及核心Stradomer的优选实施方案中，所述两个或更多个核心Stradomer单元各自独立是Fe片段。或者，所述两个或更多个核心Stradomer单元各自独立是串联Stradomer0
[0031]在涉及核心Stradomer的又一个优选的实施方案中，所述核心Stradomer包含两个核心Stradomer单元,其中所述两个核心Stradomer单元之每一个各自独立是串联Stradomer,其中所述串联Stradomer包含两个联合的Stradomer单体，其中所述这两个Stradomer单体都包含两个Fe域单体,且其中所述两个Stradomer单体的联合形成两个Fe域。在此实施方案的第一个具体的实例中，所述两个或更多个核心Stradomer单元的至少一个Fe域包含IgGl铰链或IgG3铰链、IgGlCH2域或IgG3CH2域、和IgGlCH3域或IgG3CH3域。在第二个具体的实例中，所述两个或更多个两个核心Stradomer单元的至少一个Fe域包含IgGl铰链或IgG3铰链、和IgGlCH2域。在第三个具体的实例中，所述两个或更多个两个核心Stradomer单元的Fe域之每一个独立包含IgGl铰链、IgGlCH2域、和IgGlCH3域。在第四个具体的实例中，所述两个或更多个两个核心Stradomer单元的至少一个Fe域包含IgG铰链和IgG CH2域。在第五个具体的实例中，所述两个或更多个两个核心Stradomer单元的Fe域之每一个独立包含IgG铰链和IgG CH2域。在第六个具体的实例中，所述两个或更多个两个核心Stradomer单元的Fe域之每一个独立包含IgG3铰链、IgG3CH2域、和IgG3CH3域。在第七个具体的实例中,所述两个或更多个两个核心Stradomer单元的Fe域之每一个独立包含IgGl铰链、IgGlCH2域、和IgG3CH3域。
[0032]在此实施方案中，所述第一和第二 Fe Y受体各自独立是Fe Y受体1、Fe Y受体I1、Fe Y受体III或Fe Y受体IV。优选地，所述第一和第二 Fe Y受体各自是Fe Y受体IIIa0
[0033]在第五个实施方案中，本发明涉及簇Stradomer，其包含两个或更多个多聚化的簇Stradomer单元,其中所述簇Stradomer单元之每一个包含多聚化区和至少一个Fe域，其中所述簇Stradomer单元之每一个包含两个联合的簇Stradomer单元单体，其中所述簇Stradomer单元单体之每一个包含多聚化区单体和至少一个Fe域单体,其中所述两个簇Stradomer单元单体的联合形成多聚化区和至少一个Fe域,其中所述两个或更多个簇Stradomer单元的多聚化区进行多聚化以形成所述簇Stradomer,且其中所述簇Stradomer经由第一 Fe域特异性结合第一 Fe Y受体并经由第二 Fe域特异性结合第二 Fe Y受体。
[0034]在优选的实施方案中，所述多聚化区选自下组:IgG2铰链、IgE CH2域、亮氨酸、异亮氨酸拉链和锌指。
[0035] 在进一步优选的实施方案中，所述簇Stradomer包含2个、3个、4个或5个多聚化的簇Stradomer单元。[0036]在此第五个实施方案的第一个具体的实例中，至少一个所述Fe域包含IgGl铰链或IgG3铰链、IgGlCH2域或IgG3CH2域、和IgGlCH3域或IgG3CH3域。在第二个具体的实例中，所述Fe域之每一个独立包含IgGl铰链、IgGlCH2域、和IgGlCH3域。在第三个具体的实例中，至少一个所述Fe域包含IgG铰链和IgG CH2域。在第四个具体的实例中，所述Fe域之每一个独立包含IgG铰链和IgG CH2域。在第五个具体的实例中，所述Fe域之每一个独立包含IgG3铰链、IgG3CH2域、和IgG3CH3域。在第六个具体的实例中，所述Fe域之每一个独立包含IgGl铰链、IgGlCH2域、和IgG3CH3域。在第七个具体的实例中，所述Fe域之每一个独立包含IgG铰链、IgG CH2域和IgG CH3域。在第八个具体的实例中，至少一个所述簇Stradomer单元包含两个或更多个Fe域。在第九个具体的实例中,所述簇Stradomer单元之每一个包含两个或更多个Fe域。
[0037]在此实施方案中，所述第一和第二 Fe Y受体各自独立是Fe Y受体1、Fe Y受体
I1、Fe Y受体III或Fe Y受体IV。优选地，所述第一和第二 Fe Y受体各自是Fe Y受体IIIa0
[0038]在第六个实施方案中，本发明涉及一种Stradobody,其包含两个或更多个联合的Stradomer单体和Fab域，其中所述Stradomer单体之每一个包含Fab片段重链和两个或更多个Fe域单体，其中所述Fab片段重链在所述两个或更多个Fe域单体的氨基端或羧基端的位置中，其中所述两个或更多个Stradomer单体的联合形成两个或更多个Fe域,其中Fab片段轻链独立与每个Stradomer单体的所述Fab片段重链联合,其中所述Fab域具有抗原结合活性，且其中所述Stradobody经由所述两个或更多个Fe域之第一个特异性结合第一Fcy受体并经由所述两个或更多个Fe域之第二个特异性结合第二 Fe Y受体。
[0039]在优选的实施方案中，所述两个或更多个Stradomer单体是经由共价键、二硫键或化学交联而联合的。
[0040]在又一个优选的实施方案中，所述Stradobody的所述Stradomer单体之每一个进一步包含免疫球蛋白铰链单体，且其中所述免疫球蛋白铰链单体在所述Fab片段重链和所述两个Fe域单体之间的位置中。
[0041]在一个具体的实施方案中，所述Stradobody包含两个联合的Stradomer单体，其中所述Stradomer单体之每一个包含Fab片段重链和两个Fe域单体,且其中所述两个Stradomer单体的联合形成两个Fe域。在此实施方案的第一个具体的实例中,所述两个Fe域中至少一个包含IgG铰链、IgG CH2域和IgG CH3域。在第二个具体的实例中，所述两个Fe域之每一个独立包含IgG铰链、IgGCH2域和IgG CH3域。在第三个具体的实例中，所述两个Fe域中至少一个包含IgG铰链和IgG CH3域。在第四个具体的实例中，所述两个Fe域之每一个独立包含IgG铰链和IgG CH3域。在第五个具体的实例中，所述两个Fe域中至少一个包含IgGl铰链或IgG3铰链、IgGlCH2域或IgG3CH2域、和IgGlCH3域或IgG3CH3域。在第六个具体的实例中，所述两个Fe域之每一个独立包含IgGl铰链或IgG3铰链、IgGlCH2域或IgG3CH2域、和IgGl CH3域或IgG3CH3域。在第七个具体的实例中，所述两个Fe域之每一个独立包含IgGl铰链、IgGlCH2域、和IgGlCH3域。在第八个具体的实例中，所述两个Fe域之每一个独立包含IgG3铰链、IgG3CH2域、和IgG3CH3域。在第九个具体的实例中，所述两个Fe域之每一个独立包含IgGl铰链、IgGlCH2域、和IgG3CH3域。在第十个具体的实例中，所述两个Fe域中至少一个包含IgGl铰链或IgG3铰链、和IgGlCH2域或IgG3CH2域。在第十一个具体的实例中，所述两个Fe域中至少一个包含IgGl铰链或IgG3铰链、和IgGlCH2 域。
[0042]在此实施方案中，所述第一和第二 Fe Y受体各自独立是Fe Y受体1、Fe Y受体
I1、Fe Y受体III或Fe Y受体IV。优选地，所述第一和第二 Fe Y受体各自是Fe Y受体IIIa0
[0043]在第七个实施方案中，本发明涉及改变受试者中的免疫应答的方法，包括给有所需要的受试者施用包含治疗有效量的串联Stradomer和载体或稀释剂的药物组合物。在一个优选的实施方案中，所述药物组合物包含治疗有效量的串联Stradomer的异质混合物和载体或稀释剂。
[0044]在第八个实施方案中，本发明涉及改变受试者中的免疫应答的方法，包括给有所需要的受试者施用包含治疗有效量的核心Stradomer和载体或稀释剂的药物组合物。在一个优选的实施方案中，所述药物组合物包含治疗有效量的核心Stradomer的异质混合物和载体或稀释剂。
[0045]在第九个实施方案中，本发明涉及改变受试者中的免疫应答的方法，包括给有所需要的受试者施用包含治疗有效量的簇Stradomer和载体或稀释剂的药物组合物。在一个优选的实施方案中，所述药物组合物包含治疗有效量的簇Stradomer的异质混合物和载体或稀释剂。
[0046]在第十个实施方案中，本发明涉及改变受试者中的免疫应答的方法，包括给有所需要的受试者施用包含治疗有效量的Stradobody和载体或稀释剂的药物组合物。在一个优选的实施方案中，所述药物组合物包含治疗有效量的Stradobody的异质混合物和载体或稀释剂。
[0047]在第十一个实施方案中，本发明涉及对抗体筛选对免疫系统细胞的特定活性的方法，包括:(a)使所述免疫系统的同质细胞群体与候选抗体接触，(b)测量(a)的细胞群体的活性，(C)使与(a)中相同细胞类型的同质细胞群体与权利要求1的串联Stradomer接触，
(d)测量(C)的细胞群体的活性，并(e)比较(b)中测量的活性与(d)中测量的活性，由此在所述免疫系统的细胞上对抗体筛选特定活性。在一个优选的实施方案中，所述候选抗体和所述串联Stradomer是物种匹配的和同种型匹配的。在又一个优选的实施方案中，(e)中的所述比较是⑷中测量的活性对(b)中测量的活性的比率。
[0048]在第十二个实施方案中，本发明涉及抑制单核细胞衍生细胞(MDC)的活性的方法。该方法牵涉使所述细胞与包含具有与其结合的Fe试剂的基底(substrate)的组合物接触。所述接触可以是体外的、体内的、或回体(ex vivo)的。所述细胞可以在动物中，例如患有或者有风险形成单核细胞衍生细胞介导的疾患(MDCMC)的动物。所述细胞可以是例如树突细胞、巨噬细胞、单核细胞、或破骨细胞。
[0049]在第十三个实施方案中，本发明涉及治疗方法，该方法包括给动物施用包含具有与其结合的Fe试剂的基底的组合物，其中所述动物患有或者有风险形成单核细胞衍生细胞介导的疾患(MDCMC)。
[0050]以下内容是对于这两种方法(第十二个和第十三个实施方案)而言共同的实施方案。
[0051]所述动物可以是例如人。[0052]所述Fe试剂可以含有或者是人Fe片段(例如人IgGlFc片段、人IgG3Fc片段、人IgG2、或人IgG4Fc片段)的功能性部分(functional portion)。此外,它可以包括或者是IgG分子。所述Fe试剂还可以是或者包括非人Fe片段的功能性部分。
[0053]所述基底可以是或者包括合成聚合物,例如尼龙(nylon)、特氟隆(teflon)、漆绝(dacron)、聚氯乙烯(polyvinyl chloride)、PEU (聚(酯型氨基甲酸酯))(poly (esterurethane))、PTFE (聚四氟乙烯)(polytetrafluoroethylene)、或 PMMA (甲基丙烯酸甲酯)(methyl methacrylate)。所述基底可以包括或者是金属或金属合金,例如不锈钢、钼、铱、钛、钽、镍-钛合金、或钴-铬合金。所述基底可以含有或者是动物组织或动物组织产物，例如组织或器官移植物、骨(例如成骨骨(osteogenic bone))、或软骨。所述基底可以含有或者是蛋白质，例如胶原或角蛋白。所述基底还可以是或者含有多糖，例如琼脂糖。此外，所述基底可以含有或者是组织基质(tissue matrix)，例如无细胞组织基质。所述基底可以含有或者是动物细胞(例如，组织修复细胞诸如成纤维细胞或间充质干细胞)。所述基底可以含有或者是盐，例如硫酸钙。此外，所述基底可以是或者含有凝胶或乳膏。它还可以含有或者是硅或硅橡胶。它还可以含有或者是天然纤维，例如丝、棉、或羊毛。
[0054]所述基底可以是毛发移植栓(hair transplant plug)或可移入的医学装置诸如支架(例如，血管支架诸如冠状动脉支架；气道支架诸如气管内或鼻支架；胃肠支架诸如胆或胰腺支架；或泌尿器支架诸如输尿管支架)。它还可以是外科缝线(surgicalsuture)(例如，编织丝(braid silk)、铬肠线(chromic gut)、尼龙、塑料、或金属缝线(nylon, plastic, or metal suture)或外科夹(surgical clip)(例如,动脉瘤夹(aneurismclip)))。另外，所述基底可以是人工髋、人工髋关节、人工膝、人工膝关节、人工肩、人工肩关节、人工指或趾关节、骨板(bone plate)、骨桩(bone dowel)、骨不愈合植入物(bonenon-union implant)、椎间盘植入物、骨粘固剂(bone cement)、或骨粘固剂间隔物(bonecement spacer)。它可以是动脉-静脉分流器、可植入的金属丝、起搏器、人工心脏、心脏辅助装置、耳蜗植入物、可植入的除颤器、脊髓刺激器、中枢神经系统刺激器、外周神经植入物、假牙、或牙冠。此外，所述基底可以是大血管栓塞过滤装置或笼(large vessel embolicfiltering device or cage)、经皮装置(percutaneous device)、皮肤或粘膜下层贴片(dermal or sub-mucosal patch)、或可植入的药物投递装置。
[0055]所述基底还可以是大血管移植物，其中所述血管是例如颈动脉、股动脉、或主动脉。它还可以是皮下植入物、角膜植入物、眼内透镜(intraocular lens)、或接触镜。
[0056]所述基底可以是例如片(sheet)、珠(bead)、网(mesh)、粉末颗粒(powderparticle)、线(thread)、珠(bead)、或纤维(fiber)的形式。所述基底可以含有或者是固体、半固体或凝胶状物质。如此，基底包括在水溶剂中基本上不溶的物质，例如脂溶性脂质诸如脂质体。
[0057]所述MDCMC可以是炎性疾患、自身免疫性疾病、癌症、骨密度病症、急性感染、或慢性感染。
[0058]它可以是血液免疫学过程(hematoimmunological process),例如特发性血小板减少性紫癜(Idiopathic Thrombocytopenic Purpura)、同种免疫性/自身免疫性血小板减少(alloimmune/autoimmune thrombocytopenia)、获得性免疫性血小板减少(Acquired immune thrombocytopenia)、自身免疫性嗜中性粒细胞减少症(Autoimmuneneutropenia)、自身免疫性溶血性贫血(Autoimmune hemolytic anemia)、细小病毒 B19相关红细胞再生障碍(Parvovirus B19_associated red cell aplasia)、获得性抗因子VIII自身免疫(Acquired antifactor VIII autoimmunity)、获得性冯.威利布兰德病(acquired von Willebrand disease)(又叫获得性血管性血友病)、未知意义的单克隆丙种球蛋白病和多发性骨髓瘤(Multiple Myeloma and Monoclonal Gammopathy of UnknownSignificance)、败血病(Sepsis)、再生障碍性贫血(Aplastic anemia)、纯红细胞再生障碍(pure red cell aplasia)、戴-布二氏贫血(Diamond-Blackfan anemia)(又叫先天性再生障碍性贫血)、新生儿溶血病(hemolytic disease of the newborn)、免疫介导的嗜中性粒细胞减少症(Immune-mediated neutropenia)、血小板输注不应性(refractorinessto platelet transfusion)、新生儿输血后紫癒(neonatal post-transfusion purpura)、溶血性尿毒症综合征(hemolytic uremic syndrome)、系统性血管炎(systemicVasculitis)、血栓性血小板减少性紫癒(Thrombotic thrombocytopenic purpura)、或埃文斯综合征(Evan’ s syndrome)。
[0059]或者，所述MDCMC可以是神经免疫学过程(neuroimmunological process)，例如格-巴二氏综合征(Guillain-Barr6 syndrome)、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经根性神经病(Chronic Inflammatory Demyelinating Polyradiculoneuropathy)、副蛋白血症IgM脱髓鞘性多神经病(Paraproteinemic IgM demyelinating Polyneuropathy)、朗-伊二氏肌无力综合征(Lambert-Eaton myasthenic syndrome)、重症肌无力(Myasthenia gravis)、多灶性运动神经病(Multifocal Motor Neuropathy)、与抗GMl抗体有关的下位运动神经兀综合征(Lower Motor Neuron Syndrome associated with ant1-GMlantibodies)、脱髓鞘(Demyelination)、多发性硬化(Multiple Sclerosis)和视神经炎(opticneuritis)、僵人综合征(Stiff Man Syndrome)、具有抗Yo抗体的副肿瘤性小脑变性(Paraneoplastic cerebellar degeneration with ant1-Yo antibodies)、副月中瘤性脑脊髓炎(paraneoplastic encephalomyelitis)、具有抗 Hu 抗体的感觉神经病(sensoryneuropathy with ant1-Hu antibodies)、痛痫(epilepsy)、脑炎(Encephalitis)、脊髓炎(Myelitis)、脊髓病尤其是与人T细胞亲淋巴病毒-1有关的(Myelopathy especiallyassociated with Human T-cell lymphotropic virus-1)、自身免疫性糖尿病神经病变(Autoimmune Diabetic Neuropathy)、或急性特发性自主神经异常神经病(AcuteIdiopathic Dysautonomic Neuropathy)。
[0060] 所述MDCMC可以是风湿性疾病过程(Rheumatic disease process)，例如川畸氏病(Kawasaki’ s disease)、类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis)、费耳提氏综合征(Felty，s syndrome)、ANCA 阳性血管炎(ANCA-positive Vasculitis)、白发性多肌炎(Spontaneous Polymyositis)、皮肌炎(Dermatomyositis)、抗磷脂综合征(Antiphospholipid syndrome)、复发性自然流产(Recurrent spontaneous abortion)、系统性红斑狼疮(Systemic Lupus Erythematosus)、幼年型特发性关节炎(Juvenileidiopathic arthritis)、雷诺氏(Raynaud’s)、CREST 综合征(CREST syndrome)、或葡萄膜炎(Uveitis)ο
[0061]此外，所述MDCMC可以是皮肤免疫学疾病过程(dermatoimmunological diseaseprocess)，例如表皮坏死松解症(Epidermal Necrolysis)、坏疽(Gangrene)、肉芽肿(Granuloma)、自身免疫性皮肤起泡疾病(Autoimmune skin blistering disease)包括寻常型天疱疮(Pemphigus vulgaris)、大疱性类天疱疮(Bullous Pemphigoid)、和落叶型天疱疮(Pemphigus foliaceus)、白癜风(Vitiligo)、链球菌中毒性休克综合征(Streptococcal toxic shock syndrome)、硬皮病(Scleroderma)、系统性硬化症(systemic sclerosis)包括弥漫性和局限性皮肤系统性硬化症(diffuse and limitedcutaneous systemic sclerosis)、特应性皮炎(Atopic dermatitis)、或类固醇依赖性特应性皮炎(steroid dependent Atopic dermatitis)。
[0062]此外，所述MDCMC可以是肌肉骨豁免疫学疾病(musculoskeletal immunologicaldisease)，例如包涵体肌炎(Inclusion Body Myositis)、坏死性筋膜炎(Necrotizingfasciitis)、炎性肌病(Inflammatory Myopathies)、肌炎(Myositis)、抗饰胶蛋白聚糖(BJ抗原)肌病(Ant1-Decorin (BJ antigen)Myopathy)、副肿瘤性坏死肌病(Paraneoplastic Necrotic Myopathy)、X 连锁的形成空泡的肌病(X-linked VacuolatedMyopathy)、青霉胺诱发的多肌炎(Penacillamine-1nduced Polymyositis)、动脉粥样硬化(Atherosclerosis)、冠状动脉疾病(Coronary Artery Disease)、或心肌病(Cardiomyopathy)。
[0063]所述MDCMC还可以是胃肠免疫学疾病过程(gastrointestinal immunologicaldisease process)，例如恶性贫血(pernicious anemia)、自身免疫性慢性活动性肝炎(autoimmune chronic active hepatitis)、原发性胆汁性月干硬化(primary biliarycirrhosis)、乳糜?写(Celiac disease)、疱疫样皮炎(dermatitis herpetiformis)、隐源性肝硬化(cryptogenic cirrhosis)、反应性关节炎(Reactive arthritis)、克罗恩氏病(Crohn，s disease)、惠普尔氏病(Whipple，s disease)、溃痕性结肠炎(ulcerativecolitis)、或硬化性胆管炎(sclerosing cholangitis)。
[0064]所述MDCMC可以是例如移植物抗宿主病(Graft Versus Host Disease)、抗体介导的移植物排斥(Antibody-mediated rejection of the graft)、骨髓移植后排斥(Post-bone marrow transplant rejection)、传染病后炎症(Post-1nfectiousdisease inf lammation)、淋巴瘤(Lymphoma)、白血病(Leukemia)、瘤形成(Neoplasia)、哮喘(Asthma)、具有抗β细胞抗体的I型糖尿病(TypelDiabetes mellitus withant1-beta cell antibodies)、斯耶格伦氏综合征(Sjogren’ s syndrome)、混合性结缔组织病(Mixed Connective Tissue Disease)、阿狄森氏病(Addison，s disease)、伏格特-小柳-原田三氏综合征(Vogt-Koyanag1-Harada Syndrome)、膜性增生性肾小球肾炎(Membranoproliferative glomerulonephritis)、古德帕斯丘氏综合征(Goodpasture’ s syndrome)、格雷夫斯氏病(Graves’ disease)、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto’s thyroiditis)、韦格纳氏肉芽肿病(Wegener’s granulomatosis)、微多动脉炎(micropolyarterit)、丘-施二氏综合征(Churg-Strauss syndrome)、结节性多动脉炎(Polyarteritis nodosa)或多系统器官衰竭(Multisystem organ failure) 0
[0065]在所述MDCMC是癌症的情况中，它可以是纤维肉瘤(f ibrosarcoma)、粘液肉瘤(myxosarcoma)、脂肪肉瘤(Iiposarcoma)、软骨肉瘤(chondrosarcoma)、成骨肉瘤(osteogenic sarcoma)、脊索癌(chordoma)、血管肉瘤(angiosarcoma)、内皮肉瘤(endotheliosarco ma)、淋巴管肉瘤(Iymphangiosarcoma)、淋巴管内皮肉瘤(Iymphangioendotheliosarcoma)、滑膜瘤(synovioma)、间皮瘤(mesothelioma)、尤因氏瘤(Ewing’ s tumor)、平滑肌肉瘤(leiomyosarcoma)、横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcoma)、结肠癌(colon carcinoma)、膜腺癌(pancreatic cancer)、乳腺癌(breast cancer)、卵巢癌(ovarian cancer)、前列腺癌(prostate cancer)、鱗状细胞癌(squamous cellcarcinoma)、基底细胞癌(basal cell carcinoma)、腺癌(adenocarcinoma)、汗腺癌(sweatgland carcinoma)、皮月旨腺癌(sebaceous gland carcinoma)、乳头状癌(papillarycarcinoma)、乳头状腺癌(papillary adenocarcinomas)、囊腺癌(cystadenocarcinoma)、髓样癌(medullary carcinoma)、支气管癌(bronchogenic carcinoma)、肾细胞癌(renal cell carcinoma)、肝瘤(hepatoma)、胆管癌(bile duct carcinoma)、域毛膜癌(choriocarcinoma)、精原细胞瘤(seminoma)、胚胎性癌(embryonal carcinoma)、维尔姆斯氏肿瘤(Wilms’ tumor)、宫颈癌(cervical cancer)、睾丸肿瘤(testicular tumor)、月市癌(lung carcinoma)、小细胞肺癌(small cell lung carcinoma)、膀胱癌(bladdercarcinoma)、上皮癌(epithelial carcinoma)、神经胶质瘤(glioma)、星形细胞瘤(astrocytoma)、髓母细胞瘤(medulloblastoma)、颜咽管瘤(craniopharyngioma)、室管膜瘤(ependymoma)、松果体瘤(pinealoma)、成血管细胞瘤(hemangioblastoma)、听神经瘤(acoustic neuroma)、少突神经胶质瘤(oligodendroglioma)、脑脊膜瘤(meningioma)、黑素瘤(melanoma)、神经母细胞瘤(neuroblastoma)、视网膜母细胞瘤(retinoblastoma)、白血病(leukemia)、淋巴瘤(lymphoma)、多发性骨髓瘤(multiple myeloma)、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(Waldenstrom’ s macroglobulinemia)、骨髓/脊髓发育不良疾病(mye lodysp lasti c disease)、重链病(heavy chain disease)、神经内分泌肿瘤(neuroendocrine tumor)、和施旺细胞瘤(Schwanoma)。
[0066]在所述MDCMC是骨密度病症的情况中，它可以是骨质疏松(osteoporosis)、骨质减少(osteopenia)、骨硬化症(osteopetrosis)、特发性低促性腺素性性腺功能减退症(idiopathic hypogonado trop i c hypogonadism)、神经性厌食(anorexia nervosa)、不愈合性骨折(non-healing fracture)、绝经后骨质疏松(post-menopausal osteoporosis)、维生素D缺乏或过量(Vitamin D deficiency or excess)、原发性或继发性甲状旁腺功能允进(primary or secondary hyperparathyroidism)、甲状腺疾病(thyroid disease)、或二勝酸盐毒性(bisphosphonate toxicity) ?
[0067]在所述MDCMC是急性感染的情况中，它可以是:真菌病症，包括念珠菌病(Candidiasis)、念珠菌血症(Candidemia)、或曲霉病(Aspergillosis);细菌病症，包括葡萄球菌包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、链球菌皮肤和口咽疾患，或革兰氏阴性败血症；分支杆菌感染，包括结核病(tuberculosis);病毒感染，包括单核细胞增多症(mononucleosis)、呼吸道合胞体病毒感染、或带状疱疹感染；寄生虫感染包括疟疾(malaria)、血吸虫病(schistosomiasis)、或维虫病(trypanosomiasis)。
[0068]在所述MDCMC是慢性感染的情况中，它可以是甲真菌病(onchyomycosis, onychomycosis);细菌病症，包括幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)；分支杆菌感染，包括结核病；病毒感染，包括埃巴病毒感染、人乳头瘤病毒感染、或单纯疱疹感染；或寄生虫感染，包括疟疾 或血吸虫病。
[0069]在第十四个实施方案中，本发明涉及一种组合物，其含有或者是可植入的或可附着的医学装置和与其结合的Fe试剂。
[0070]在第十五个实施方案中，本发明涉及一种试剂盒，其含有可植入的或可附着的医学装置和Fe试剂。在这两个实施方案中，所述可植入的或可附着的医学装置和所述Fe试剂可以是那些在本文中所叙述的之任一种。试剂盒可以进一步含有合适的容器。
[0071]本发明的别的优点和特征从以下的详述、图和实施例(它们例示本发明的优选的实施方案)看会是显而易见的。
[0072]上述内容已经相当广泛地概述了本发明的特征和技术优点，以便可以更好地理解本发明随后的详述。下文会描述本发明的别的特征和优点，它们形成本发明的权利要求的主题。本领域技术人员应当了解的是，可以容易地利用所公开的概念和具体的实施方案作为基础来改良或设计用于实施本发明相同目的的其它结构。本领域技术人员还应当认识的是，此类等同的构建体不背离如所附权利要求书中所提出的本发明的精神和范围。在结合附图考虑时会更好地从以下描述理解被认为是本发明特征性的新特性(其构造和操作方法二者)以及其它的目的和优点。然而，要明确理解的是，仅出于例示和描述的目的而提供每幅图，并且不意图解释为本发明的限制。
[0073]附图简述
[0074]图1A以示意图形式显示了一种来自IgGl的天然Fe片段单体结构，其中铰链域连接CH2域连接CH3域；图1B显示了自两个联合的Fe片段单体形成的自聚集的、天然IgGlFc片段。
[0075]图1C以示意图形式显示了一种来自IgG3的天然Fe片段单体结构，其中铰链域连接CH2域连接CH3域；图1D显示了自两个联合的Fe片段单体形成的自聚集的、天然IgG3Fc片段。
[0076]图2A和图2B显示了图1B中所显示的天然Fe片段结构的更高阶聚集物。Fe片段可以天然多聚化成二聚物的二聚物(即四聚物)或甚至更高阶多聚体聚集物。
[0077]图3A显示了具有与Fe片段在Fe片段的铰链处连接的天然Fab片段的天然IgGl抗体的示意图；图3B显示了类似的IgG3结构。
[0078]图4A显不了一种Stradomer单体，其由两个IgGlFc域单体串联构成；图4B显不了一种备选的Stradomer单体结构,其具有串联连接的IgGlFc_IgG3Fc_IgE Fe。
[0079]图5A和图5B显不了图4A和图4B的Stradomer单体由于构件Fe域单体的固有能力而自二聚化成串联Stradomer。
[0080]图6A显示了含有IgGlFc-1gGl (铰链-CH2)的Stradomer单体；图6B显示了含有IgGl (铰链-CH2) -1gG3 (铰链-CH2) -1gE (铰链-CH2)衍生序列的 Stradomer。
[0081]图7A和图7B显示了图6A和图6B的Stradomer单体由于构件Fe域的固有能力而自二聚化成串联Stradomer。
[0082]图7C 显示了含有 IgE (铰链)-1gGlFc-1gGl (铰链 _CH2) -1gE (CH3)的串联Stradomer。图 7D 显不了含有 IgG3Fc_IgGlFc 的串联 Stradomer。
[0083]图8A显不了含有Fab及串联Stradomer结构的Stradobody构建体，其中每个Stradomer单体含有两个IgGlCH2_CH3衍生的Fe域单体；图8B显示了如8A中的Stradobody构建体，但是其中Stradomer结构含有IgGlFc连接IgG3Fc连接IgE Fe。
[0084]图9A 显示了 IgGlFc-1gGl (铰链 _CH2) Stradobody ;图 9B 显示了 IgGl (铰链-CH2) -1gG3 (铰链-CH2) -1gE (铰链-CH2) 3-Stradobody。
[0085]图1OA 显示了 IgGl (铰链-CH2)-1gG3CH3-1gM CH4Stradomer 单体和 J 链蛋白；图1OB显示了一种核心Stradomer,其基于图1OA的Stradomer通过经IgM CH4域对J链的联合形成的五聚物。
[0086]图1OC 显示了 IgGlFc-1gGlFc-1gM CH4Stradomer 单体和 J 链蛋白；图1OD 显示了一种核心Stradomer,其基于图1OC的Stradomer通过经IgM CH4域对J链的联合形成的五聚物。
[0087]图1lA 显示了 IgGlFc-1gGl (铰链-CH2) Stradomer 单体。图1lB 展示了图1lA 中的Stradomer单体如何能自二聚化以形成串联Stradomer。图1lC展示了图1lA中的相同Stradomer单体如何能使单体Fe域与另一个Stradomer单体上的相同或相似Fe域单体排列，但是不像自二聚物那样，由此形成由与自二聚物相同的Stradomer单体构成但具有拉链效应结构的Stradomer。
[0088]图12A 显不了 IgG3Fc_IgGlFc Stradomer 单体。图 12B 显不了添加第二个 IgG3Fc接着进行自二聚化能形成分支结构化IgG3Fc-1gGlFc_IgG3Fc Stradomer。
[0089]图 13A 显示了 IgE CH2-1gGlFc_IgGl (铰链-CH2)-1gE CH4Stradomer 单体。图13B显示了图13A单体的自二聚物，并突出显示了所形成的两个Fe Y R结合位点。
[0090]图14A显示了由通过接头连接的两个IgGlFc域构成的Stradomer。图14B显示了由通过接头连接的两个串联Stradomer (具体地,在每种情况中是2 (IgGlFc) Stradomer)构成的 Stradomer。
[0091]图15中的A显示了人IgGlFc片段的核酸(SEQ ID NO:1)和氨基酸(SEQ ID NO: 2)序列。图15中的B显示了人IgG2Fc片段的核酸(SEQ ID NO:3)和氨基酸(SEQ ID NO:4)序列。图15中的C显示了人IgG3Fc片段的核酸(SEQ ID NO:5)和氨基酸(SEQ ID NO:6)序列。图15中的D显示了人IgG4Fc片段的核酸(SEQ ID NO:7)和氨基酸(SEQ ID NO:8)序列。
[0092] 图16显示了包含{IgK信号序列-1gGlFc片段-1gGlFc片段}的构建体的核酸(SEQ ID NO: 17)和氨基酸(SEQ ID NO: 18)序列。IgK信号的氨基酸序列以粗体显示。第一个IgGlFc片段的氨基酸序列标有单下划线。第二个IgGlFc片段的氨基酸序列标有双下划线。标有星号的丝氨酸和赖氨酸是那些可以进行突变以改变Fe Y受体结合的氨基酸。
[0093]图17显示了包含{限制酶位点-1gK信号序列-限制酶位点-1gGl (铰链-CH2-CH3)-限制酶位点-表位标签(V5和His)-终止}的构建体的核酸(SEQ ID NO: 19)和氨基酸(SEQ ID NO:20)序列。IgK信号的氨基酸序列以粗体显示。IgGlFc片段的氨基酸序列标有单下划线。V5标签的氨基酸序列标有标有虚线的下划线。His标签的氨基酸序列标有下划线且以粗体显示。
[0094]图18显示了包含{限制酶位点-1gK信号-限制酶位点-1gGl (铰链-CH2-CH3)-XbaI 位点-1gGl (铰链-CH2-CH3)-终止}的构建体的核酸(SEQ ID NO: 21)和氨基酸(SEQ ID NO:22)序列。IgK信号的氨基酸序列以粗体显示。第一个IgGlFc片段的氨基酸序列标有单下划线。第二个IgGlFc片段的氨基酸序列标有双下划线。
[0095]图19显示了包含{限制酶位点-1gK信号-限制酶位点-1gGl (铰链-CH2-CH3) -XbaI位点-1gGl (铰链-CH2-CH3)-限制酶位点-表位标签(V5和His)-终止}的构建体的核酸(SEQ ID NO:23)和氨基酸(SEQ ID NO:24)序列。IgK信号的氨基酸序列以粗体显示。第一个IgGlFc片段的氨基酸序列标有单下划线。第二个IgGlFc片段的氨基酸序列标有双下划线。V5标签的氨基酸序列标有虚线的下划线。His标签的氨基酸序列标有下划线且以粗体显示。
[0096]图20中的A显示了 FcR Y IIIa的N端信号序列的核酸(SEQ ID NO: 31)和氨基酸(SEQ ID NO:32)序列，其中苯丙氨酸(F)多态性以粗体显示且标有下划线。可变的核酸也以粗体显示且标有下划线。图20中的B显示了 FcRy IIIa的N端信号序列的核酸(SEQ IDNO:33)和氨基酸(SEQ ID NO:34)序列，其中缬氨酸(V)多态性以粗体显示且标有下划线。可变的核酸也以粗体显示且标有下划线。两种构建体都含有供纯化用的C-端六His标签。
[0097]图21显示了包含{限制酶位点-1gK信号EcoRV位点_IgG3(铰链-CH2-CH3) -1gGl (铰链-CH2-CH3)-限制酶位点-表位标签(V5和His)-终止}的构建体的核酸(SEQ ID NO:25)和氨基酸(SEQ ID NO:26)序列。IgK信号的氨基酸序列以粗体显示。IgG3Fc片段的氨基酸序列标有单下划线。IgGlFc片段的氨基酸序列标有双下划线。V5标签的氨基酸序列标有虚线的下划线。His标签的氨基酸序列标有下划线且以粗体显示。
[0098]图22显示了包含{限制酶位点-1gK信号-EcoRV位点-1gE (CH2) -1gGl (铰链-CH2-CH3) -1gGl (铰链-CH2) -1gE (CH4)-终止}的构建体的核酸(SEQ ID NO: 27)和氨基酸(SEQ ID NO:28)序列。IgK信号的氨基酸序列以粗体显示。IgE(CH2)域的氨基酸序列标有单下划线。IgGl (铰链-CH2-CH3)域的氨基酸序列标有双下划线。IgGl (铰链-CH2)域的氨基酸序列标有虚线的下划线。IgE(CH4)域的氨基酸序列标有波形线的下划线。
[0099]图23中的A显示了 Fe片段，并展示了此类Fe片段由两个Fe片段单体构成，并进一步包含Fe域(虚线圆圈)和Fe部分域(铰链、CH2和CH3，如标示的)。图23中的B显示了串联Stradomer的组成，其由通过Stradomer单体间连接相连接的两个Stradomer单体构成。串联Stradomer包含至少两个Fe域(如虚线圆圈所标示的),并且任选地，可以包含域连接区。图23中的C显示了核心Stradomer的组成,其包含核心模块,各含有至少一个Fe域的核心Stradomer单元与该核心模块结合。核心Stradomer单元可以是Fe片段、串联Stradomer或簇Stradomer单元。图23中的D显示了簇Stradomer的组成,其包含多聚化的簇Stradomer单元,它们各具有多聚化区和含有至少一个Fe域的区域。簇Stradomer单元可以是Fe片段或串联Stradomer。多聚化区一旦进行多聚化便形成簇Stradomer的头部。簇Stradomer的腿部是由簇Stradomer单元中在空间上比簇Stradomer的多聚化头部受约束少的Fe域区域形成的。
[0100]图24显示了表3中所列出的Stradomer的氨基酸序列。
[0101]图25显示了人IgGl、IgG2、IgG3和IgG4的Fe部分域单体(铰链、CH2和CH3)的氨基酸序列(Kabat, EA, ffu, TT, Perry, HM, Gottesman, KS 和 Foeller, C.1991.Sequences of proteins of immunological interest 第 5 版 US Public HealthServices, NIH, Bethesda)。
[0102]发明详述
[0103]用于理性分子设计本文中所描述的hIVIG替换化合物的办法包括免疫学活性生物模拟物的重组和/或生化创建。在优选的方法中，体外筛选这些替换化合物以评估每种替换化合物在结合Fe Y受体和调控免疫功能方面的效率。选择特定的替换化合物以进行进一步的体内证实和剂量/施用优化。替换化合物具有用于治疗例如自身免疫性疾病、炎性疾病、骨质疏松、和癌症的效用。下文详细描述了每个方面以及具体的例示性实施方案。
[0104]如本文中所使用的，在与权利要求书和/或说明书中的术语“包含”结合使用时使用单词“一个”或“一种”可以指“一个/种”，但是它也与“一个/种或多个/种”、“至少一个/种”、和“一个/种或超过一个/种”的意义一致。
[0105]如本文中所使用的，术语“生物模拟物”、“生物模拟物分子”、“生物模拟物化合物”及相关术语指模拟另一种化合物(诸如合并的hIVIG、单克隆抗体或抗体的Fe片段)之功能的人造化合物。“生物学活性”生物模拟物指拥有与其天然存在的对应物相同或基本上类似的生物学活性的化合物。“免疫学活性”生物模拟物指展现出与天然存在的免疫学活性分子诸如抗体、细胞因子、白介素及本领域中已知的其它免疫学分子相同或基本上类似的免疫学活性的生物模拟物。在优选的实施方案中，本发明的生物模拟物指Stradomer和Stradobody,如本文中所定义的。[0106]本发明的免疫学活性生物模拟物被设计成拥有IgG Fe域的一种或多种免疫调控活性，而且至少具有⑴能够结合Fe Y R (包括Fe yR1、Fc yRI1、Fc YRIII和Fe YRIV)的第一 Fe 域，和(ii)能够结合 Fe YR (包括 Fe yR1、Fc yRI1、Fc YRIII 和 Fe yRIV)的第二Fe域。
[0107]以下段落定义本发明的生物模拟物的建筑块(在结构和功能两方面)，然后定义生物模拟物自身。然而，首先有帮助的是注意到，如上文所指明的，本发明的生物模拟物之每一种具有至少两个Fe域。在最低限度上，Fe域是包含两条进行联合以形成功能性Fe Y受体结合位点的肽链或臂(单体)的二聚体多肽(或较大多肽的二聚体区)。因此，一般而言，本文中所讨论的各片段和域的功能性形式以二聚体(或多聚体)形式存在。本文中所讨论的各片段和域的单体是必须与第二条链或臂联合以形成功能性二聚体结构的单链或臂。
[0108]Fe 片段
[0109]“Fe片段”指如下的本领域术语，其用于描述常规地在免疫球蛋白的羧基端找到的蛋白质区或蛋白质折叠结构(参见图3A-3B)。可以经由使用木瓜蛋白酶消化来将Fe片段与单克隆抗体的Fab片段分离，所述木瓜蛋白酶消化是不完全且未完成的方法(参见Mihaesco C和 Seligmann M.Papain Digestion Fragments Of Human IgM Globulins.Journal of Experimental Medicine,第 127 卷，431-453 (1968) )。Fe 片段连同 Fab 片段(含有抗体结合域)构成全抗体(这里指完整抗体)。Fe片段由抗体重链的羧基端部分构成。Fe片段中的每条链的长度在约220-265个氨基酸之间，并且这些链通常是经由二硫键相连接的。Fe片段通常含有一个或多个独立的结构折叠或功能性亚域。具体地，Fe片段包含Fe域，其在本文中定义为能结合Fe Y受体的最低限度结构(参见例如图1B和图1D)。分离的Fe片段由二聚化的两个Fe片段单体(例如抗体重链的两个羧基端部分；本文中进一步定义的)构成。在两个Fe片段单体联合时，所得的Fe片段具有Fe Y受体结合活性。
[0110]Fe部分片段
[0111]“Fe部分片段”指包含小于抗体整个Fe片段，但保留足以具有与Fe片段相同活性(包括Fe Y受体结合活性)的结构的域。因此，Fe部分片段可以缺乏部分或整个铰链区、部分或整个CH2域、部分或整个CH3域、和/或部分或整个CH4域，这取决于衍生该Fe部分域的抗体的同种型。Fe部分片段的例子包括如下分子，其包含IgG3的上部、核心和下部铰链区加上CH2 域(Tan, LK, Shopes, RJ, Oi, VT和Morrison, SL, Influence of the hinge regionon complement activation, Clq binding, and segmental flexibility in chimerichuman immunoglobulins, Proc Natl Acad Sci USA.1990January; 87 (I): 162-166)。如此,在此例子中，Fe部分片段缺乏IgG3Fc片段中存在的CH3域。Fe部分片段由两个Fe部分片段单体构成。如本文中进一步定义的，在两个此类Fe部分片段单体联合时，所得的Fe部分片段具有Fe Y受体结合活性。
[0112]Fe 域
[0113]如本文中所使用的，“Fe域”描述能结合Fe Y受体或能被Fe Y受体结合的最低限度区域(在较大多肽的语境中)或最小的蛋白质折叠结构(在分离的蛋白质的语境中)。在Fe片段和Fe部分片段两者中，Fe域指容许所述分子与Fe Y受体结合的最低限度结合区。虽然可以将Fe域限于被Fcy受体结合的离散多肽，但是也会清楚的是，Fe域可以是部分或整个Fe片段以及部分或整个Fe部分片段。在术语“Fe域”在本发明中使用时，它会被技术人员承认为超过一个Fe域的意义。Fe域由两个Fe域单体构成。如本文中进一步定义的，在两个此类Fe域单体联合时，所得的Fe域具有Fe Y受体结合活性。如此，Fe域指在功能上能结合Fe Y受体的二聚体结构。
[0114]Fe部分域
[0115]如本文中所使用的，“Fe部分域”描述Fe域的一部分。Fe部分域包括不同免疫球蛋白类和亚类的各重链恒定区结构域(例如CH1、CH2、CH3和CH4域)和铰链区。如此，本发明的 Fe 部分域包括 IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgAl、IgA2、IgD 和 IgE 的 CHl 域，IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgAl、IgA2、IgD 和 IgE 的 CH2 域，IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgAl、IgA2、IgD 和 IgE 的 CH3 域，IgM 和 IgE 的 CH4 域，和 IgGU IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgAl、IgA2、IgD和IgE的铰链区。本发明的Fe部分域可以进一步包含超过一个这些域和铰链的组合。然而，本发明的各Fe部分域及其组合缺乏结合FcyR的能力。因此，Fe部分域及其组合包含小于Fe域。可以将Fe部分域连接在一起以形成具有Fe Y受体结合活性的肽，如此形成Fe域。在本发明中，Fe部分域与Fe域一起作为建筑块使用以创建本发明的生物模拟物，如本文中所定义的。每个Fe部分域由两个Fe部分域单体构成。在两个此类Fe部分域单体联合时，形成Fe部分域。
[0116]如上文所指明的，Fe片段、Fe部分片段、Fe域和Fe部分域之每一种是二聚体蛋白质或域。如此，这些分子之每一种由进行联合以形成二聚体蛋白质或域的两个单体构成。虽然上文讨论了二聚体形式的特征和活性，但以下讨论单体肽。
[0117]Fe片段单体
[0118] 如本文中所使用的，“Fe片段单体”指在与另一个Fe片段单体联合时构成Fe片段的单链蛋白质。如此，Fe片段单体指抗体重链之一中构成全抗体之Fe片段的羧基端部分(例如，重链中包括IgG的铰链区、CH2域和CH3域的连续部分)(参见图1A和图1C))。在一个实施方案中，Fe片段单体在最低限度上包含铰链区的一条链(铰链单体)、CH2域的一条链(CH2域单体)和CH3域的一条链(CH3域单体)，它们被连续连接以形成肽。在另一个实施方案中，Fe片段单体至少包含铰链区的一条链、CH2域的一条链、CH3域的一条链、和CH4域的一条链(CH4域单体),它们被连续连接以形成肽。[0119]Fe域单体
[0120]如本文中所使用的，“Fe域单体”描述在与另一个Fe域单体联合时构成能结合Fe Y受体的Fe域的单链蛋白质。两个Fe域单体的联合创建一个Fe域。单独的Fe域单体(仅包含Fe域的一侧)不能结合Fe Y受体。
[0121]Fe部分域单体
[0122]如本文中所使用的，“Fe部分域单体”描述在与另一个Fe部分域单体联合时构成Fe部分域的单链蛋白质。图25中显示了 IgGl、IgG2、IgG3和IgG4的Fe部分域铰链、CH2和CH3单体的氨基酸序列。两个Fe部分域单体的联合创建一个Fe部分域。
[0123]Stradomer
[0124]在具体的实施方案中，本发明的生物模拟物包括Stradomer。Stradomer是能够结合两个或更多个Fe Y受体的生物模拟物化合物(参见例如图13B)。在一个优选的实施方案中，使用本发明的Stradomer来结合效应细胞诸如NK细胞和未成熟的树突细胞及其它单核细胞衍生细胞上的Fe Y受体。在一个实施方案中，Fcy受体是低亲和力Fe Y受体。Stradomer可以具有4种不同物理构象:串联、簇、核心或Fe片段，在以下段落中讨论其中每一种。会明显的是，在多种Stradomer构象的构建中使用上文所讨论的Fe片段、Fe部分片段、Fe域和Fe部分域。此外，首先生成，然后自我联合以形成二聚体结构(其是本发明的Stradomer)的正是各Fe域单体和Fe部分域单体(也在上文讨论的)。
[0125]串联 Stradomer
[0126]“串联Stradomer”指由两个在联合时形成两个或更多个Fe域的线性Stradomer单体构成的二聚体多肽。Stradomer的Fe域仅在两条肽链(Stradomer单体)联合时才是功能性的(即，在单体状态中是非功能性的)。如此，串联Stradomer指能够结合两个或更多个Fcy受体的生物模拟物化合物。在不同实施方案中，串联Stradomer可以具有2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或更多个Fe域，以及Fe部分域。串联Stradomer内的Fe域(和Fe部分域)可以通过域连接相连,如本文中进一步定义的。
[0127]如本文中所使用的，“Stradomer 二聚物”指特定形式的Stradomer,其仅由两个Stradomer构成。在一个实施方案中，Stradomer 二聚物是通过相关Stradomer单体的自我聚集形成的分子。在另一个实施方案中，Stradomer 二聚物中的Stradomer单体经由Stradomer单体间连接在物理上相连接,如本文中定义的。“多聚体Stradomer”由3个或更多个Stradomer构成,其通过Stradomer单体的自我聚集,或经由Stradomer单体间连接形成，如本文中所定义的。
[0128]Stradomer 单体
[0129]如本文中所使用的，术语“Stradomer单体”指在至少与第二 Stradomer单体联合时形成包含至少两个Fe域的多肽的单一、连续肽分子(参见例如图6A-6B，图12A)。虽然在优选的实施方案中，串联Stradomer由两个联合的Stradomer单体构成(参见例如图5A、图5B、图7A、图7B、图7C、图7D),串联Stradomer也可以含有3个(参见图11C)或更多个Stradomer单体。可以通过Stradomer单体间连接来使Stradomer单体联合以形成Stradomer,或者它们可以经由自我聚集而形成Stradomer。 [0130]Stradomer单体可以具有如下氨基酸序列，其在与另一个Stradomer单体联合以形成Stradomer时会形成I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或更多个Fe域。Stradomer单体可以进一步具有如下氨基酸序列,其在与另一个Stradomer单体联合以形成Stradomer时会形成I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或更多个Fe部分域。
[0131]可以仅从Stradomer单体分子的连续区域的羧基端至氨基端排列在Stradomer的语境中会形成Fe域和Fe部分域的Stradomer单体区域(参见例如图4A-4B)。或者,可以经由本文中称作“域连接”的肽序列来连接Stradomer单体的连续区域。构成Stradomer单体的特定Fe域单体和Fe部分域单体的排列不是至关重要的。然而，该排列必须容许两个Stradomer单体联合后形成两个功能性Fe域。
[0132]在本发明的Stradomer的一个实施方案中，生成如下Stradomer单体,其在该肽的N端含有强烈结合自身的Fe域单体或Fe部分域单体(诸如单个或两个末端IgE CH2域单体或部分IgG3铰链域单体)，以分别创建Fe域或Fe部分域。这些Stradomer单体之每一个具有Fe域单体和/或部分Fe域单体的必要互补物以在形成Stradomer后结合两个Fe Y受体。源自于此类Stradomer单体联合的Stradomer是能够结合两个或更多个Fe Y受体的生物模拟物。在一个优选的实施方案中，N端Fe域或Fe部分域含有额外的糖基化位点，诸如在IgE CH2域上存在的。[0133]作为一个阐明性的例子，技术人员会理解的是，可以如下构建本发明的Stradomer分子，即制备编码Fe域单体和Fe部分域单体的各种组合(但是是会形成最少两个Fe域单体的组合)的多核苷酸分子。可以将此类多核苷酸分子插入表达载体中，所述表达载体可以用于转化细菌群体。然后可以通过在合适的培养条件下培养经转化的细菌来生成Stradomer单体。然后Stradomer单体可以在Stradomer单体自我聚集后或者在使用Stradomer单体间连接进行Stradomer单体联合后形成功能性Stradomer。本发明包括经由具有相同氨基酸序列的Stradomer单体、具有基本上类似的氨基酸序列的Stradomer单体、或具有不相似的序列的Stradomer单体的联合形成的所有Stradomer。在后一种实施方案中，构成Stradomer的Stradomer单体的氨基酸序列仅需要具有使得能形成两个或更多个功能性Fe Y受体结合位点的相似性。
[0134]如上文所指明的，Fe域可以以其结合Fe Y受体的能力在功能上限定。因此，基于构成Fe域的Fe部分域，具体的Fe域氨基酸序列会有变化。然而，在本发明的一个实施方案中，Fe域包含免疫球蛋白分子的铰链区和CH2域。在又一个实施方案中，Fe域包含免疫球蛋白分子的铰链区、CH2域和CH3域。在又一个实施方案中，Fe域包含免疫球蛋白分子的铰链区、CH2域、CH3域和CH4域。在又一个实施方案中，Fe域包含免疫球蛋白分子的铰链区、CH2域和CH4域。
[0135]域连梓
[0136]如上文所指明的，“域连接”指构成本发明串联Stradomer或Stradobody之各Stradomer单体之每一个的Fe域单体和/或Fe部分域单体间的肽连接。域连接可以是I个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或更多个氨基酸。域连接不在以其天然序列存在的Fe部分域单体间发生。即，在使用相连接的Fe域单体之天然连续部分(诸如IgG的铰链区、CH2域和CH3域)的情况中，这些Fe部分域单体包含连续序列，并且这些元件间不需要域连接。比较而言，例如，在以不是天然存在的方式连接两个或更多个Fe域单体或部分Fe域单体以形成各Stradomer单体时，可以使用域连接。一个例子会是两个铰链/CH2/CH3肽间的连接,仓Il建包含铰链/CH2/CH3/L/铰链/CH2/CH3的Stradomer的各Stradomer单体，其中“L”指域连接(参见例如图4A，在那里所述域连接(未显示)在IgGlCH3域和IgGl铰链间发生)。在所描述的各种情况中，域连接可以是重链的天然存在部分的域连接，其连接抗体Fe域单体中的铰链和CH域。或者,域连接可以是任何其它如下氨基酸序列,其提供各Stradomer单体的Fe域单体和部分Fe域单体间所需要的间隔和柔性，而且容许各Stradomer单体彼此配对以形成本发明的Stradomer。
[0137]技术人员会理解的是，域连接的身份并不特别重要，只要其容许两个或更多个各Stradomer单体形成本发明的生物模拟物化合物，并且所得的化合物具有交联超过一个FcyR的能力。预想的是，每种免疫学活性生物模拟物化合物会优选在串联Stradomer或Stradobody的每个Stradomer单体中含有至少一个域连接,其会发挥将免疫学活性生物模拟物的Fe域维持在受限的空间区域内的功能，而且其会促进Fe Y R活化活性，例如通过经由与免疫学活性生物模拟物内的Fe域的共结合聚集Fe Y R来实现。优选地，域连接会容许与IgG分子铰链域提供的构象可变性相同或更大程度的构象可变性。所有上文的连接是本文中公知的。
[0138]Stradomer单体间连接
[0139]本发明的生物模拟物化合物中找到的区别的连接是“ Stradomer单体间连接”，其在构成本发明Stradomer和Stradobody的两个或更多个各Stradomer单体间发生。域连接是用来将构成生物模拟物化合物之各Stradomer单体的Fe域单体和部分Fe域单体彼此连接的短氨基酸序列，而Stradomer单体间连接用来连接构成生物模拟物化合物的两个或更多个各Stradomer单体。Stradomer单体间连接可以是能够稳定联合各Stradomer单体的任何连接。在一些实施方案中，Stradomer单体间连接可以是Stradomer单体间的共价连接。或者，Stradomer单体之间的Stradomer单体间连接可以是通过直接化学交联。在优选的实施方案中，Stradomer单体结构利用Fe域单体之间的天然自我聚集特性来创建自我聚集的Stradomer。在此类实施方案中，二硫键在各Stradomer单体间形成以形成Stradomer (参见例如图5A,在那里Stradomer单体间连接(未显示)用来连接Stradomer的两个Stradomer单体个体)。二硫键在构成生物模拟物分子的Fe域单体的半胱氨酸残基之间形成，其使用存在于天然Fe域单体序列中的半胱氨酸残基或通过定点诱变而掺入Fe域单体中的半胱氨酸残基来实现。还可以使用此类天然自我聚集特性来形成Stradomer多聚体中各Stradomer单体之间的Stradomer单体间连接。备选的实施方案包括Stradomer单体间连接，在那里二硫键在经由定点诱变而掺入构成各Stradomer单体的氨基酸序列中的半胱氨酸残基之间形成。
[0140]如上文所讨论的,在一个优选的实施方案中，形成Stradomer的Stradomer单体间连接是源自于Stradomer单体自我聚集的连接。在一个实施方案中，构成Stradomer的两个Stradomer单体是相同的肽，使得构成Stradomer的两个各Stradomer单体序列相同。然而，技术人员会理解，其它实施方案包括其中各个Stradomer单体在氨基酸序列上彼此不同的 Stradomer。
[0141] 两个Stradomer单体能通过例如平行排列以使得配对在Stradomer单体中的相同Fe部分域单体之间发生来形成Stradomer (参见例如图5A-5B)。然而,本发明还包括配对在不相同的Fe部分域单体间发生的实施方案,和配对在Stradomer单体中相同的Fe部分域单体间发生但两个Stradomer单体的排列有偏移的实施方案(参见图11C)。
[0142]为了控制Stradomer单体的生成和自二聚化，可以使用“加帽区”。例如，Stradomer单体序列可以包含以下Fe部分域:IgE CH2/IgGl铰链/IgGlCH2/IgGlCH3/IgGl铰链/IgGlCH2/IgE CH4 (参见图13A)，在那里IgE域充当帽以阻止“拉链效应”。拉链效应能在Stradomer单体(参见图11A)能自二聚化(参见图11B)或者能不像自二聚物那样但像平行交替的单体那样排列自身(参见图11C)时发生。本领域普通技术人员会理解的是，可以单独或组合使用多种Fe部分域，诸如任何免疫球蛋白的铰链或IgM或IgE的CH4域以在想要时指导Stradomer自二聚化和阻止拉链效应。其它非串联结构可以含有分支分子(参见图12B)，即两个或更多个由接头(诸如简单的共价键、肽接头、或非肽接头)连接的平行排列的Stradomer (参见图14A和图14B)。
[0143]核心 Stradomer
[0144]“核心Stradomer”由与两个或更多个核心Stradomer单元结合的核心模块构成，其中每个核心Stradomer单元包含至少一个Fe域，由此创建能够结合两个或更多个Fe Y受体的生物模拟物化合物。Fe片段、Fe部分片段、串联Stradomer或簇Stradomer单元可以各自独立充当核心Stradomer中的一个或两个(若它们包含两个Fe域的话)核心Stradomer单元，因为这些分子之每一种含有至少一个Fe域。如此,核心Stradomer可以包含与至少一个串联Stradomer结合的核心模块。
[0145]如本文中所使用的，核心Stradomer的核心模块是可以与核心Stradomer单元连接或共价结合的任何物理结构。可以充当核心模块的优选多肽包括匙孔虫戚血蓝蛋白、牛血清清蛋白和卵清蛋白。可以通过许多化学品使用公知的技术来实现此类核心模块和核心Stradomer单兀(例如Fe片段、Fe部分片段、Fe域、串联Stradomer和族Stradomer单元)之间的化学交联。通常适合于在交联中使用的例示性化学品包括戊二醛、碳二亚胺、琥珀酰亚胺酯(例如MBS、SMCC)、联苯胺、高碘酸酯、异硫氰酸酯；ΡΕ0(聚乙烯)/PEG(聚乙二醇)间隔物诸如双(NHS)PEO5、DFDNB (I，5-二氟-2，4-二硝基苯)；和胺反应性同双功能交联剂，包括醛活化的右旋糖酐、辛二酸双(磺基琥珀酰亚氨基)酯、双[2-(琥珀酰亚氨基氧羰氧)乙基]砜、二亚氨基己二酸二甲酯二盐酸盐(Dimethyl adipimidate.2HC1)、二亚氨基庚二酸二甲酯二盐酸盐(Dimethyl pimelimidate.2HC1)、二亚氨基辛二酸二甲酯二盐酸盐(Dimethyl Suberimidate.2HC1)、戍二酸二琥拍酰亚氨基酯、二硫代双(琥拍酰亚氨基)丙酸酯、辛二酸二琥珀酰亚氨基酯、酒石酸二琥珀酰亚氨基酯、3，3’ - 二硫代双亚氨基丙酸二甲酯二盐酸盐、3，3’-二硫代双(磺基琥珀酰亚氨基丙酸酯)、乙二醇双[琥珀酰亚氨基琥珀酸酯]、乙二醇双[磺基琥珀酰亚氨基琥珀酸酯]、β_[三(羟甲基)膦基]丙酸和氨基三乙酸三琥珀酰亚氨基酯。基于进行组合以形成免疫学活性生物模拟物的含有Fe域的多肽的序列和选定的具体核心模块，本领域技术人员会能够选择合适的交联化学品和条件° 参见例如 Wong, Shan S.Chemistry of protein conjugation and cross-linking.Boca Raton:CRC Press, cl991(ISBN0849358868)。
[0146] 在另一个优选的实施方案中，可以使用连接(J)链多肽作为核心模块。在使用J链作为核心模块时，可以使用半胱氨酸桥来连接各核心Stradomer单元以形成核心Stradomer (参见图10A-10D)。在核心Stradomer的一个实施方案中，含有末端IgM CH4域的串联Stradomer (充当核心Stradomer单元)与J链联合以形成核心Stradomer。包含IgM CH4域导致包含此Fe部分域及J链的Stradomer自我聚集以形成能够结合多个Fe Y受体的生物模拟物。另一种例示性的核心Stradomer是包含Fe域(充当核心Stradomer单元)的核心Stradomer，其中所述Fe域具有结构IgG3铰链/IgG3CH2/IgG3CH3/IgM CH4。此分子的构件Fe域不能单独结合超过一个Fe Y受体,但是整个结构在构件Fe域与J链联合时能结合5个Fe Y受体。
[0147]在另一个实施方案中，核心模块可以是非多肽实体。多种合适的组分可以在物理上与核心Stradomer单元联合以生成免疫学活性生物模拟物。可以使用无毒珠、超分支聚合物(hyperbranched polymer)和树状聚物(dendrimer)、纳米颗粒、和被FDA归为“通常认为安全”(Generally Regarded As Safe)的各种化合物(例如丙二醇、山梨糖醇、脂质体和娃酸钙)。参见例如 Nanoparticulates as Drug Carriers, VladimirP.Torchilin(编)，Imperial College Press(2006 年 9 月)ISBN:1860946305/ISBN-13:9781860946301。
[0148]本发明优选的核心模块包括珠、清蛋白、脂质体、肽和聚乙二醇。
[0149]簾 Stradomer
[0150]“簇Stradomer”指具有有中心模块“头部”和两个或更多个“腿部”的章鱼样形式的生物模拟物，其中每个腿部包含一个或多个能够结合至少一个Fe Y受体的Fe域，如此创建能够结合两个或更多个Fe Y受体的生物模拟物。每个簇Stradomer由超过一个二聚体蛋白质(每个称作“簇Stradomer单元”)构成。每个簇Stradomer单元由多聚化的区域和包含至少一个功能性Fe域的“腿部”区域构成。多聚化区一旦与另一个簇Stradomer单元的多聚化区进行多聚化便创建簇Stradomer“头部”。腿部区域能够结合与每个腿部区域中存在有的Fe域一样多的Fe Y受体。如此,簇Stradomer是能够结合两个或更多个Fe Y受体的生物模拟物化合物。
[0151]多聚化区可以是引起二聚体蛋白质进一步多聚化的肽序列，或者多聚化区可以是增强二聚体蛋白质的多聚化的糖基化。肽多聚化区的例子包括IgG2铰链、IgE CH2域、异亮氨酸拉链、和锌指。糖基化对肽多聚化的影响在本领域中有充分的记载(例如Roleof Carbohydrate in Multimeric Structure of Factor VIII/V on Willebrand FactorProtein.Harvey R.Gralnick, SybiI B.Williams 和 Margaret E.Rick.Proceedingsof the National Academy of Sciences of the United States of America,第 80卷，第 9 期，[Part1:Biological Sciences] (1983 年 5 月 I 日)，第 2771 页-第 2774页;Multimerization and collagen binding of vitronectin is modulated byits glycosylation.Kimie Asanuma, Fumio Arisaka 和 Haruko Ogawa.1nternationalCongress Series Volumel223, 2001 年 12 月，第 97 页-第 101 页)。
[0152] 熟练技术人员会认可的是,簇Stradomer单元自身可以包含串联Stradomer (含有两个或更多个Fe域)及多聚化区。如此，簇Stradomer的“腿部”可以由本文中所讨论的任何类型的串联Stradomer和/或一个或多个IgGlFc片段和/或IgG3Fc片段和/或单一Fe域构成。本领域熟练技术人员会认可的是，可以修饰此类生物模拟物中的IgGlFc片段和IgG3Fc片段之每一个以包含来自任何免疫球蛋白的部分Fe片段。构成簇Stradomer单元(如上文所指明的，其以两个肽的二聚体联合形式存在)的单体是“簇Stradomer单元单体”。已经制备的例示性簇Stradomer是:IgE CH2/IgGl铰链/IgGlCH2/IgGlCH3,其簇Stradomer单元在多聚化前不会结合超过一个低亲和力Fcy受体。
[0153]本领域熟练技术人员会认可的是,在使用串联Stradomer作为簇Stradomer的“腿部”时，每个“腿部”会能够结合超过一个Fe Y受体(因为至少两个Fe域存在于串联Stradomer中),如此创建能够结合超过一个Fe Y受体的生物模拟物。可以在包含腿部的个体簇Stradomer单元单体的末端放置Fe部分域、其它免疫球蛋白序列、和非免疫球蛋白序列以创建簇Stradomer，其中每个腿部具有优选的空间接近性以增加它们结合一个或超过一个Fe Y受体的可用性。
[0154]多聚化区可以是引起肽进行二聚化或多聚化的肽序列，并且包括IgG2铰链、IgE CH2域、异亮氨酸拉链和锌指。如本领域中知晓的是，人IgG2的铰链区能形成共价二聚物(Yoo, E.M.等.J.1mmunol.170, 3134-3138(2003) ; Salfeld NatureBiotech.25，1369-1372(2007))。IgG2的二聚物形成是潜在地经由IgG2铰链结构通过C-C键介导的(Yoo等2003)，提示单独的铰链结构能介导二聚物形成。如此，具有IgG2铰链(如此充当簇Stradomer单元)的串联Stradomer会形成可以包含两个串联Stradomer或者甚至三个串联Stradomer的族Stradomer。
[0155]人IgG2铰链单体的氨基酸序列如下:ERKCCVECPPCP (SEQ ID NO:36)。铰链的核心结构是铰链单体的C-X-X-C部分。如此,本发明的Stradomer单体可以包含IgG2铰链单体的完整的12个氨基酸的序列，或4个氨基酸的核心，以及Fe域单体。虽然核心结构的X-X可以是任何氨基酸，但是在一个优选的实施方案中，X-X序列是V-E或P-P。熟练技术人员会理解的是，在核心四氨基酸结构外，IgG2铰链单体可以由铰链序列的任何部分构成，包括所有IgG2铰链序列和一些或所有IgG2CH2和CH3域单体序列。可能的IgG2铰链-1gGlFc域串联Stradomer构建体的具体例子如下:
[0156]表1
[0157]
【权利要求】
1.一种分离的串联Stradomer,其包含两个或更多个联合的Stradomer单体,其中每个所述Stradomer单体包含两个或更多个Fe域单体，其中所述两个或更多个Stradomer单体的联合形成两个或更多个Fe域,且其中所述串联Stradomer经由所述两个或更多个Fe域之第一个特异性结合第一 Fe Y受体并经由所述两个或更多个Fe域之第二个特异性结合第二 Fe Y受体。
2.—种核心Stradomer,其包含与两个或更多个核心Stradomer单元连接的核心模块，其中所述两个或更多个核心Stradomer单元之每一个包含至少一个Fe域,且其中所述核心Stradomer单元之每一个独立选自下组: (a)Fe片段，其中所述Fe片段包含两个联合的Fe片段单体，其中所述Fe片段单体之每一个包含Fe域单体，且其中所述两个Fe片段单体的联合形成Fe域， (b)Fc部分片段，其中所述Fe部分片段包含两个联合的Fe部分片段单体，其中所述Fe部分片段单体之每一个包含Fe域单体，且其中所述两个Fe部分片段单体的联合形成Fe域， (c)Fc域,其中所述Fe域包含两个联合的Fe域单体,且其中所述两个Fe域单体的联合形成Fe域， (d)串联Stradomer,其中所述串联Stradomer包含两个或更多个联合的Stradomer单体，其中所述Stradomer单体之每一个包含两个或更多个Fe域单体,且其中所述两个或更多个Stradomer单体的联合形成两个或更多个Fe域,和 (e)簇Stradomer,其中所述簇Stradomer包含两个或更多个多聚化的簇Stradomer单元，其中所述簇Stradomer单元之每一个包含多聚化区和至少一个Fe域,其中所述簇Stradomer单兀之每一个包含两个联合的族Stradomer单兀单体，其中所述族Stradomer单元单体之每一个包含多聚化区单体和至少一个Fe域单体,其中所述两个簇Stradomer单元单体的联合形成多聚化区和至少一个Fe域,且其中所述两个或更多个簇Stradomer单元的多聚化区进行多聚化以形成所述簇Stradomer，且 其中所述核心Stradomer经由所述两个或更多个核心Stradomer单元之第一个特异性结合第一 Fe Y受体并经由所述两个或更多个核心Stradomer单元之第二个特异性结合第二 Fe Y受体。
3.一种簇Stradomer,其包含两个或更多个多聚化的簇Stradomer单元,其中所述簇Stradomer单元之每一个包含多聚化区和至少一个Fe域,其中所述簇Stradomer单元之每一个包含两个联合的簇Stradomer单元单体,其中所述簇Stradomer单元单体之每一个包含多聚化区单体和至少一个Fe域单体,其中所述两个簇Stradomer单元单体的联合形成多聚化区和至少一个Fe域,其中所述两个或更多个簇Stradomer单元的多聚化区进行多聚化以形成所述簇Stradomer,且其中所述簇Stradomer经由第一 Fe域特异性结合第一 Fe Y受体并经由第二 Fe域特异性结合第二 Fe Y受体。
4.一种Stradobody,其包含两个或更多个联合的Stradomer单体和Fab域，其中所述Stradomer单体之每一个包含Fab片段重链和两个或更多个Fe域单体,其中所述Fab片段重链在所述两个或更多个Fe域单体的氨基端或羧基端的位置中，其中所述两个或更多个Stradomer单体的联合形成两个或更多个Fe域,其中Fab片段轻链独立与每个Stradomer单体的所述Fab片段重链联合,其中所述Fab域具有抗原结合活性,且其中所述Stradobody经由所述两个或更多个Fe域之第一个特异性结合第一 Fe Y受体并经由所述两个或更多个Fe域之第二个特异性结合第二 Fe Y受体。
5.一种改变受试者中的免疫应答的方法，包括给有所需要的受试者施用包含治疗有效量的权利要求1的串联Stradomer、权利要求2的核心Stradomer、权利要求3的簇Stradomer或权利要求4的Stradobody和载体或稀释剂的药物组合物。
6.一种对抗体筛选对免疫系统细胞的特定活性的方法，包括: (a)使所述免疫系统的同质细胞群体与候选抗体接触， (b)测量(a)的细胞群体的活性， (C)使与(a)中相同细胞类型的同质细胞群体与权利要求1的串联Stradomer接触， (d)测量(C)的细胞群体的活性，并 (e)比较(b)中测量的活性与(d)中测量的活性，由此在所述免疫系统的细胞上对抗体筛选特定活性。
7.一种抑制单核细胞衍生细胞(MDC)的活性的方法，该方法包括使所述细胞与包含具有与其结合的Fe试剂的基底的组合物接触。
8.一种治疗方法，该方法包括给动物施用包含具有与其结合的Fe试剂的基底的组合物，其中所述动物患有或者有风险形成单核细胞衍生细胞介导的疾患(MDCMC)。
9.一种组合物，其包含可植入的或可附着的医学装置和与其结合的Fe试剂。
10.一种试剂盒，其包含可植入的或可附着的医学装置和Fe试剂。
【文档编号】C07K16/28GK103897063SQ201410106484
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2008年5月30日 优先权日:2007年6月1日
【发明者】斯科特.E.斯特罗姆, 丹.H.舒尔策, 戴维.S.布洛克 申请人:马里兰大学巴尔的摩分校, 格利克尼克股份有限公司