一种人血浆蛋白ｃ浓缩物的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种制备人血浆蛋白C浓缩物的方法，它包括如下步骤：（1）凝胶吸附：取凝胶，充分溶胀，用平衡液平衡，加入去冷沉淀血浆，加入量为凝胶的250～750倍（v/w），搅拌吸附，去上清，洗涤，洗脱，得洗脱液；（2）超滤，透析：将洗脱液超滤，得浓缩液，再透析至电导率低于10mS/cm；（3）S/D灭活；（4）肝素亲和层析：用缓冲液平衡肝素亲和层析柱，上样，用氯化钠浓度为0.01～0.1M的缓冲液洗涤，再用氯化钠浓度为0.1～0.18M的缓冲液洗脱，得洗脱液；（5）超滤，透析，无菌分装，冻干，干热病毒灭活，即可。本发明制备方法简单，成本低，得率很高，制得的产品纯度高，活性强，工业应用前景良好。
【专利说明】一种人血浆蛋白C浓缩物的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及血液制品的制备方法，特别涉及一种制备人血浆蛋白C浓缩物的方法。
【背景技术】
[0002]人血浆蛋白C，又称蛋白C (protein C，PC)是一种分子量约为62kD的糖蛋白，在血浆中含量约为2-6mg/L。PC是一种维生素K依赖性血浆蛋白，与其他维生素K依赖的蛋白质(如凝血因子I1、VI1、IX和X)理化性质相似，通过灭活凝血因子Va、VDa，增高纤溶酶原激活因子，从而维持血液凝血和纤溶系统的动态平衡。由PC及其辅助因子，抑制因子组成的PC系统，目前已确认为机体抗凝血机制的一个重要调节系统，在抗血栓性疾病中起着重要作用。目前，蛋白C主要从血浆中分离纯化而制得，得到的终产品通常称为人血浆蛋白C浓缩物。[0003]目前，采用离子交换层析和单克隆免疫亲和层析相结合的方法可以制备高纯度蛋白C浓缩物的方法，但是，该方法需要采用单克隆免疫亲和层析，成本太高，且有鼠源蛋白污染的可能性。
[0004]采用离子交换层析或者亲和层析的方法分离纯化，则需要采用多步离子交换或者亲和层析组合，步骤繁琐，且收率很低，难以大规模运用。如，Radosevich等(J.Chromatogr.B，2003，790:199 - 207 )公开了一种从血浆中分离纯化蛋白C浓缩物的方法，具体是凝胶吸附后，再通过 DEAE Sepharose CL 6B, DEAE Sepharose FF, DMAE-Fractogel EMD 及Heparin-Sepharose CL6B四步层析纯化,其获得的人血衆蛋白的活性较高,约58IU/ml,但收率太低，小于10%，步骤繁琐；沈永才等，“人血浆蛋白C的纯化与鉴定”，中国生物制品学杂志，2004年06期也公开一种纯化方法，具体是先采用凝胶吸附，再采用离子交换层析和肝素亲和层析组合纯化，其获得的人血浆蛋白C浓缩物的纯度为90.63%，但收率较低，仅12.5%，工艺也比较复杂。
【发明内容】
[0005]为了解决上述问题，本发明提供了一种新的人血浆蛋白C浓缩物的制备方法及该方法制备得到的人血浆蛋白C浓缩物。
[0006]本发明制备人血浆蛋白C浓缩物的方法，它包括如下步骤:
[0007](I)凝胶吸附:取凝胶，充分溶胀，用平衡液平衡，加入去冷沉淀血浆，加入量为凝胶的250~750倍(v/w)，搅拌吸附，去上清，洗涤，洗脱，得洗脱液；
[0008](2)超滤，透析:将洗脱液超滤，得浓缩液，再透析至电导率低于lOmS/cm ；
[0009](3) S/D 病毒灭活；
[0010](4)肝素亲和层析:用缓冲液平衡肝素亲和层析柱，上样，用氯化钠浓度为0.01~
0.1M的缓冲液洗涤，再用氯化钠浓度为0.1~0.18M的缓冲液洗脱，得洗脱液，其中，洗涤和洗脱采用的缓冲液中，氯化钠浓度不同时为0.1M ；[0011 ] (5)超滤，透析，无菌分装，冻干，干热病毒灭活，即可。
[0012]去冷沉淀血衆(Cryoprecipitate-reducedplasma, CRP)是新鲜冰冻血衆(Freshfrozen plasma, FFP)在一定温度条件下制备冷沉淀时分离所得的上清血衆。
[0013]v/w,即 L:kg。
[0014]M，即 mol/L。
[0015]步骤(1)中，所述凝胶为DEAE Sephadex A50、DEAE Sepharose Fast Flow 或 DEAESepharose CL6B。
[0016]步骤(1)中，搅拌吸附的转速为50-150转/分钟，优选为80转/分钟。
[0017]步骤(1)中,所述去冷沉淀血衆的加入量为凝胶的500倍(v/w)
[0018]步骤(1)中:
[0019]所述平衡液是氯化钠浓度为0.05~0.1M的缓冲液；
[0020]所述洗涤采用的洗涤液是氯化钠浓度为0.15~0.25M的缓冲液；
[0021 ] 所述洗脱采用的洗脱液是氯化钠浓度为0.4~2M的缓冲液。
[0022]优选地，所述平衡液的氯化钠浓度为0.08M ;所述洗涤液的氯化钠浓度为0.2M ;所述洗脱液的浓度为0.5M。
[0023]其中，所述缓冲液是浓度为0.005~0.025M的柠檬酸钠溶液，其pH为6.8-8.0。优选地，所述柠檬酸溶液的浓度为0.015M, pH为7.3。
[0024]步骤(1)中:
[0025]所述吸附的温度为2~8°C，时间为20~40分钟；
[0026]所述洗涤的次数为3~5次，每次20~40min ；
[0027]所述洗脱的次数为I~3次，每次20~40min。
[0028]优选地，
[0029]所述吸附是的时间是30分钟；
[0030]所述洗涤的次数为3次，每次30min ；
[0031]所述洗脱的次数为I~3次，每次30min。
[0032]步骤(4)中，洗涤采用的缓冲液中，氯化钠浓度为0.08M ;洗脱采用的缓冲液中，氯化钠浓度为0.16M。
[0033]步骤(4)中，平衡采用的缓冲液的电导率为2_8mS/cm ;洗涤采用的缓冲液的电导率为5-12mS/cm ;洗脱采用的缓冲液的电导率为10-20mS/cm。
[0034]步骤(4)中，所述缓冲液是浓度为0.001~0.01M的柠檬酸钠溶液或者浓度为
0.01~0.02M咪唑溶液；所述缓冲液的pH为5.5~6.5。
[0035]步骤(4)中，层析的温度范围为2~10°C，流速为50~144cm/h。
[0036]本发明还提供了前述方法制备的人血浆蛋白C浓缩物。
[0037]本发明药物组合物，它是以前述的人血浆蛋白C浓缩物为活性成分，加上药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成。
[0038]本发明人血浆蛋白C浓缩物的制备方法通过对工艺参数的特定选择，仅仅采用凝胶吸附与一步层析相结合的方法，就制备得到了纯度高达90%、活性高达30IU/ml的人血浆蛋白C浓缩物，收率也高达30%，制备方法简单，操作简便，成本低廉，具有良好的市场应用前景。[0039]显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0040]以下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
【具体实施方式】
[0041]实施例1用本发明方法制备人血浆蛋白C浓缩物
[0042]1、实验方法
[0043](1)人去冷沉淀血浆的制备
[0044]符合药典要求的人新鲜冰冻血浆约1000L (重量约为1000kg)，用酒精消毒血浆袋后，在0_5°C融化血浆，离心，除去冷沉淀，即得人去冷沉淀血浆。
[0045](2)凝胶吸附、纯化
[0046]①DEAE Sephadex A50吸附:将2kg的DEAE Sephadex A50凝胶干粉充分溶胀，用平衡液(0.015M柠檬酸钠，0.08M氯化钠，ρΗ7.3)平衡5次，每次60L，然后加入步骤(1)中得到的去冷沉淀血浆，在2-8°C搅拌(搅拌的转速为80转/分钟)吸附30分钟，上清液并入血浆罐,收集凝胶。
[0047]②洗涤:分别用60L pH7.3的含0.015M柠檬酸钠，0.20M氯化钠的洗涤液洗涤凝胶3次，每次搅拌30分钟(搅拌的转速为80转/分钟)。
[0048]③洗脱:分别用60L pH7.3的含0.015M柠檬酸三钠，0.5M氯化钠的洗脱液洗脱凝胶2次，每次搅拌20分钟(搅拌的转速为80转/分钟)。将两次洗脱得到的蛋白洗脱液混合置于洁净的容器中。
[0049](3)超滤、透析
[0050]对步骤(2)中所得蛋白洗脱液用IOkD孔径超滤膜超滤、透析，使最终得到的浓缩液的电导为5mS/cm。
[0051](4) S/D病毒灭活
[0052]将步骤(3)的浓缩液(40L，即40kg)按10:1 (w/w)比例缓慢加入S/D溶液(3.3%的磷酸三丁酯和11%的Tween80)4kg，搅拌均匀，24-26°C连续搅拌6小时(转速:100转/分钟)，每I小时记录温度一次。
[0053](5)肝素亲和层析
[0054]用0.45 μ m膜过滤经S/D灭活后的蛋白溶液，然后泵入肝素亲和层析柱(柱高20cm，底面直径450mm)中进行亲和层析。经过平衡、上样、洗涤、洗脱等步骤得到蛋白C原液，其中层析温度范围为2~10°C，线流速113cm/h (体积流速为180升/小时)。
[0055]①平衡:用120升平衡液(0.008M柠檬酸钠，pH5.8，电导约4mS/cm)对肝素亲和胶进行平衡；
[0056]②上样:将步骤(4) S/D病毒灭活所得蛋白溶液用0.45 μ m膜过滤，泵入层析柱中；
[0057]③洗涤:用160升洗涤液(0.008M柠檬酸钠，0.08M氯化钠，pH5.8，电导约为8mS/cm)对肝素亲和层析柱进行洗涤，观察在线紫外吸收线，至紫外吸收线趋于基线时停止洗涤；
[0058]④洗脱:对肝素亲和层析柱进行洗脱(0.008M柠檬酸钠，0.16M氯化钠，pH5.8电导为15mS/cm)，观察在线紫外吸收图谱，并用洁净的容器收集吸收峰处的流出液(40升)，即为蛋白C原液。
[0059](6)超滤、透析
[0060]对步骤(5)中所得蛋白C原液用IOkD孔径超滤膜超滤，将盐浓度降至0.15M，并适当浓缩使每毫升溶液中的蛋白C活性单位大于30IU。
[0061](7)无菌分装
[0062](8)冻干
[0063]①将步骤(7)分装后的制品于_30°C预冷冻，然后置于冻干机柜；
[0064]②将隔板温度在30分钟内快速降至_40°C，保持2小时；
[0065]③开启真空泵，真空度控制在7_15Pa ；
[0066]④1.5小时内将隔板温度升至_30°C，保持4小时；
[0067]⑤2小时内将隔板温度升至_20°C，保持6小时；
[0068]⑥4小时内将隔板温度升至0°C，保持20小时；
[0069] ⑦4小时内将隔板温度升至30°C，保持6小时；真空度控制在5Pa以下保持I小时；
[0070]⑧真空压塑料塞出柜
[0071](9)干热病毒灭活
[0072]100°C水浴干热灭活30分钟，即可。
[0073]2、检测
[0074]蛋白C活性检测方法:待测样品经蛇毒激活剂激活后，加入显色底物37°C孵育10分钟后，加入酸性终止液终止反应，然后在405nm检测吸光值。
[0075]SDS-PAGE检测蛋白C的纯度。
[0076]回收率=最后得到的蛋白C制品的活性/原料血浆中蛋白C的总活性X 100%。
[0077]3、检测结果
[0078]经检测，本发明方法的回收率约为30%，制备得到的蛋白C浓缩物的活性为30IU/ml,纯度为90%。
[0079]实施例2用本发明方法制备人血浆蛋白C浓缩物
[0080]1、实验方法
[0081]( I)人去冷沉淀血浆的制备
[0082]符合药典要求的人新鲜冰冻血浆约500L (重量约为1000kg)，用酒精消毒血浆袋后，用酒精消毒血浆袋后，在0-5°C融化血浆，离心，除去冷沉淀，即得人去冷沉淀血浆。
[0083](2)凝胶吸附、纯化
[0084]①DEAE Sephadex A50吸附:将2kg的DEAE Sephadex A50凝胶干粉充分溶胀，用平衡液(0.005M柠檬酸钠，0.05M氯化钠，pH6.8)平衡5次，每次60L，然后加入步骤(1)中得到的去冷沉淀血浆，在2-8°C搅拌(搅拌的转速为50转/分钟)吸附20分钟，上清液并入血浆罐,收集凝胶。
[0085]②洗涤:分别用60L pH6.8的含0.005M柠檬酸钠，0.15M氯化钠的洗涤液洗涤凝胶3次，每次搅拌20分钟(搅拌的转速为50转/分钟)。
[0086]③洗脱:分别用60L pH6.8的含0.005M柠檬酸三钠，0.4M氯化钠的洗脱液洗脱凝胶I次，每次搅拌10分钟(搅拌的转速为50转/分钟)。将两次洗脱得到的蛋白洗脱液混合置于洁净的容器中。
[0087](3)超滤、透析
[0088]对步骤(2)中所得蛋白洗脱液用IOkD孔径超滤膜超滤、透析，使最终得到的浓缩液的电导为5mS/cm。
[0089](4) S/D病毒灭活
[0090]将步骤(3)的浓缩液(40L，即40kg)按10:1 (w/w)比例缓慢加入S/D溶液(3.3%的磷酸三丁酯和11%的Tween 80) 4kg，搅拌均匀，24-26 °C连续搅拌6小时(转速:100转/分钟)，每I小时记录温度一次。
[0091](5)肝素亲和层析
[0092]用0.45 μ m膜过滤经S/D灭活后的蛋白溶液，然后泵入肝素亲和层析柱(柱高20cm，底面直径450mm)中进行亲和层析。经过平衡、上样、洗涤、洗脱等步骤得到蛋白C原液，其中层析温度范围为2~10°C，线流速50cm/h (体积流速为79.5升/小时)。
[0093]①#衡:用120升平衡液(0.008M柠檬酸钠或者0.01M咪唑溶液，，pH 5.5，电导约2mS/cm)对肝素亲和胶进行平衡；
[0094]②上样:将步骤(4) S/D病毒灭活所得蛋白溶液用0.45 μ m膜过滤，泵入层析柱中；
[0095]③洗涤:用160升洗涤液(0.0OlM柠檬酸钠或者0.01M咪唑溶液，氯化钠，pH 5.5，电导约为5mS/cm)对肝素亲和层析柱进行洗涤，观察在线紫外吸收线，至紫外吸收线趋于基线时停止洗涤；
[0096]④洗脱:对肝素亲和层析柱进行洗脱(0.008M柠檬酸钠或者0.01M咪唑溶液，，
0.1M氯化钠，pH 5.5电导为lOmS/cm)，观察在线紫外吸收图谱，并用洁净的容器收集吸收峰处的流出液(40升)，即为蛋白C原液。
[0097](6)超滤、透析
[0098]对步骤(5)中所得蛋白C原液用IOkD孔径超滤膜超滤，将盐浓度降至0.15M，并适当浓缩使每毫升溶液中的蛋白C活性单位大于30IU。
[0099](I)无菌分装
[0100](8)冻干
[0101]①将步骤(7)分装后的制品于_30°C预冷冻，然后置于冻干机柜；
[0102]②将隔板温度在30分钟内快速降至_40°C，保持2小时；
[0103]③开启真空泵，真空度控制在7_15Pa ；
[0104]④1.5小时内将隔板温度升至_30°C，保持4小时；
[0105]⑤2小时内将隔板温度升至_20°C，保持6小时；
[0106]⑥4小时内将隔板温度升至0°C，保持20小时；
[0107]⑦4小时内将隔板温度升至30°C，保持6小时；真空度控制在5Pa以下保持I小时；
[0108]⑧真空压塑料塞出柜[0109](9)干热病毒灭活
[0110]100°C水浴干热灭活30分钟，即可。
[0111]实施例3用本发明方法制备人血浆蛋白C浓缩物
[0112]2、实验方法
[0113](I)人去冷沉淀血浆的制备
[0114]符合药典要求的人新鲜冰冻血浆约1500L (重量约为1000 kg)，用酒精消毒血浆袋后，用酒精消毒血浆袋后，在0-5°C融化血浆，离心，除去冷沉淀，即得人去冷沉淀血浆。
[0115](2)凝胶吸附、纯化
[0116]④DEAE Sephadex A50吸附:将2kg的DEAE Sephadex A50凝胶干粉充分溶胀，用平衡液(0.025M柠檬酸钠，IM氯化钠，pH 8.0)平衡5次，每次60L，然后加入步骤(1)中得到的去冷沉淀血浆，在2-8°C搅拌吸附30分钟(搅拌的转速为150转/分钟)，上清液并入血浆罐，收集凝胶。
[0117]②洗涤:分别用60L pH 8.0的含0.025M柠檬酸钠，0.25M氯化钠的洗涤液洗涤凝胶5次，每次搅拌30分钟(搅拌的转速为150转/分钟)。
[0118]③洗脱:分别用60L pH8.0的含0.025M柠檬酸三钠，2M氯化钠的洗脱液洗脱凝胶3次，每次搅拌30分钟(搅拌的转速为150转/分钟)。将两次洗脱得到的蛋白洗脱液混合置于洁净的容器中。
[0119](3)超滤、透析
[0120]对步骤(2)中所得蛋白洗脱液用IOkD孔径超滤膜超滤、透析，使最终得到的浓缩液的电导为5mS/cm。
[0121](4) S/D病毒灭活
[0122]将步骤(3)的浓缩液(40L，即40kg)按10:1 (w/w)比例缓慢加入S/D溶液(3.3%的磷酸三丁酯和11%的Tween 80) 4kg，搅拌均匀，24-26 °C连续搅拌6小时(转速:100转/分钟)，每I小时记录温度一次。
[0123](5)肝素亲和层析
[0124] 用0.45 μ m膜过滤经S/D灭活后的蛋白溶液，然后泵入肝素亲和层析柱(柱高20cm，底面直径450mm)中进行亲和层析。经过平衡、上样、洗涤、洗脱等步骤得到蛋白C原液，其中层析温度范围为2~10°C，线流速144cm/h (体积流速为229升/小时)。
[0125]①「平衡:用120升平衡液(0.008M柠檬酸钠或者0.01M咪唑溶液，pH 6.5，电导约8mS/cm)对肝素亲和胶进行平衡；
[0126]②上样:将步骤(4) S/D病毒灭活所得蛋白溶液用0.45 μ m膜过滤，泵入层析柱中；
[0127]③洗涤:用160升洗涤液(0.008M柠檬酸钠或者0.01M咪唑溶液，0.1M氯化钠，pH
6.5，电导约为12mS/cm)对肝素亲和层析柱进行洗涤，观察在线紫外吸收线，至紫外吸收线趋于基线时停止洗涤；
[0128]④洗脱:对肝素亲和层析柱进行洗脱(0.008M柠檬酸钠或者0.01M咪唑溶液，
0.18M氯化钠，pH6.5，电导为20mS/cm)，观察在线紫外吸收图谱，并用洁净的容器收集吸收峰处的流出液(40升)，即为蛋白C原液。
[0129](6)超滤、透析[0130]对步骤(5)中所得蛋白C原液用IOkD孔径超滤膜超滤，将盐浓度降至0.15M，并适当浓缩使每毫升溶液中的蛋白C活性单位大于30IU。
[0131](2)无菌分装
[0132](8)冻干
[0133]①将步骤(7)分装后的制品于_30°C预冷冻，然后置于冻干机柜；
[0134]②将隔板温度在30分钟内快速降至_40°C，保持2小时；
[0135]③开启真空泵，真空度控制在7_15Pa ；
[0136]④1.5小时内将隔板温度升至_30°C，保持4小时；
[0137]⑤2小时内将隔板温度升至-20°C，保持6小时；
[0138]⑥4小时内将隔板温度升至0°C，保持20小时；
[0139]⑦4小时内将隔板温度升至30°C，保持6小时；真空度控制在5Pa以下保持I小时；
[0140]⑧真空压塑料塞出柜
[0141](9)干热病毒灭活
[0142]100°C水浴干热灭活30分钟，即可。
[0143]综上，本发明方法的收率高达30%，制备得到的蛋白C浓缩物的活性为30IU/ml，纯度为90%，制备方法简单，操作简便，成本低廉，具有良好的市场应用前景。
【权利要求】
1.一种制备人血浆蛋白C浓缩物的方法，其特征在于:它包括如下步骤: (1)凝胶吸附:取凝胶，充分溶胀，用平衡液平衡，加入去冷沉淀血浆，去冷沉淀血浆的加入量为凝胶的250~750倍(v/w)，搅拌吸附，去上清，洗涤，洗脱，得洗脱液； (2)超滤，透析:将洗脱液超滤，得浓缩液，再透析至电导率低于lOmS/cm； (3)S/D病毒灭活； (4)肝素亲和层析:用缓冲液平衡肝素亲和层析柱，上样，用氯化钠浓度为0.01~0.1M的缓冲液洗涤，再用氯化钠浓度为0.1~0.18M的缓冲液洗脱，得洗脱液，其中，洗涤和洗脱采用的缓冲液中，氯化钠浓度不同时为0.1M ； (5)超滤，透析，无菌分装，冻干，干热病毒灭活，即可。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(1)中，所述凝胶为DEAESephadexA50、DEAE Sepharose Fast Flow或DEAE Sepharose CL 6B ;所述去冷沉淀血衆的加入量为凝胶的500倍(v/w)。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(1)中: 所述平衡液是氯化钠浓度为0.05~0.1M的缓冲液； 所述洗涤采用的洗涤液是氯化钠浓度为0.15~0.25M的缓冲液； 所述洗脱采用的洗脱液是氯化钠浓度为0.4~2M的缓冲液； 优选地: 所述平衡液的氯化钠浓度为0.08M ； 所述洗涤液的氯化钠浓度为0.2M ； 所述洗脱液的浓度为0.5M ； 优选地: 所述缓冲液是浓度为0.005~0.025M的柠檬酸钠溶液，其pH为6.8-8.0 ； 进一步优选地:所述柠檬酸溶液的浓度为0.015M, pH为7.3。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(1)中: 所述搅拌吸附的温度为2~8°C，时间为20~40分钟，转速为50-150转/分钟； 所述洗涤的次数为3~5次，每次20~40min ； 所述洗脱的次数为I~3次，每次10~30min ； 优选地: 所述搅拌吸附是的时间是30分钟，转速为80转/分钟； 所述洗涤的次数为3次，每次30min ； 所述洗脱的次数为2次，每次20min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(4)中，洗涤采用的缓冲液中，氯化钠浓度为0.08M ;洗脱采用的缓冲液中，氯化钠浓度为0.16M。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(4)中，平衡采用的缓冲液的电导率为2-8mS/cm ;洗涤采用的缓冲液的电导率为5-12mS/cm ;洗脱采用的缓冲液的电导率为.10_20mS/cm。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(4)中，所述缓冲液是浓度为.0.001~0.01M的柠檬酸钠溶液或者浓度为0.01~0.02M咪唑溶液；所述缓冲液的pH为.5.5 ~6.5o
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(4)中，层析的温度范围为2~10°C，流速为50~144cm/h。
9.权利要求1~8任意一项所述方法制备的人血浆蛋白C浓缩物。
10.一种药物组合物，其特征在于:它是以权利要求9所述的人血浆蛋白C浓缩物为活性成分，加上药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成。
【文档编号】C07K14/47GK103910790SQ201410122447
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2014年3月28日 优先权日:2014年3月28日
【发明者】王玉梅, 王宗奎, 李长清, 杜晞, 袁靖, 陈云华, 刘欣晏, 杨刚, 夏志明, 邓靖 申请人:贵州泰邦生物制品有限公司, 中国医学科学院输血研究所