一种纤维胶凝蛋白及其编码基因和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种纤维胶凝蛋白及其编码基因和应用。纤维胶凝蛋白基因，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1的第42位-935位碱基所示。纤维胶凝蛋白，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。本发明的牡蛎ficolin基因在细菌感染后显著上调，能够选择性的结合病原微生物，促进血细胞的吞噬功能，说明这个基因参与了宿主的免疫机制，合理的利用这个基因在免疫学中的应用，将进一步提升养殖贝类的种质创新能力，支撑产业的高效可持续性发展。
【专利说明】一种纤维胶凝蛋白及其编码基因和应用
【技术领域】:
[0001]本发明属于生物化学与分子生物学领域，具体涉及一种纤维胶凝蛋白及其编码基因和应用。
【背景技术】:
[0002]纤维胶凝蛋白(ficolin，FCN)被发现存在于脊索动物以上的物种中。该蛋白与甘露聚糖结合凝集素(mannan binding lectin, MBL)具有类似的结构和功能,均属于补体凝集素，都是一种重要天然免疫、糖类模式识别分子。Ficolin的空间结构跟MBL和补体蛋白Clq分子很相似，能通过其球形的头部的FBD结构域与病原体的糖类结合位点结合，而其胶原样区介导调理吞噬。Ficolin介导的调理吞噬可能通过两条途径进行:一是与病原体结合后通过胶原样区激活MASP，后者激活下游序列调理素，间接促进吞噬细胞内吞作用。二是直接与吞噬细胞表面的ficolin特异性受体结合，直接参与病原体的吞噬和清除。ficolin的FBG区与MBL的CRD区功能相似，是一种重要的糖类模式识别受体，参与对病原微生物表面糖类配体的识别，但是不同的ficolin对于不同的糖类具有选择性，因此，可以选择性的结合不同的病菌。ficolin的活化与MBL不同，Ficolin的凝集素活化不需Ca2+参与而MBL需要。Ficolin和MBL的微生物识别谱有部分重叠，但ficolin的糖结合特异性不同于MBL,而且两者的配体也不完全相同。
【发明内容】
:
[0003]本发明的第一个目的是提供一个新的贝类免疫相关的基因，即纤维胶凝蛋白基因。
[0004]本发明的纤维胶凝蛋白基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1的第42位-935位碱基所示。
[0005]本发明的第二个目的是提供纤维胶凝蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ IDN0.2所示。
[0006]纤维胶凝蛋白基因对于不同的病源刺激应答剧烈，对于有病原感染的牡蛎个体，可以采用定量PCR的方法，鉴定牡蛎是否受到病源感染。
[0007]因此，本发明的第三个目的是提供上述纤维胶凝蛋白基因作为牡蛎健康状况的标志性基因在制备牡蛎的病理检测试剂中的应用。
[0008]重组的纤维胶凝蛋白能够选择性的结合酵母，葡萄球菌，因此，纤维胶凝蛋白可以用于饲料添加剂，提升牡蛎的抗菌能力；此外，该蛋白可以促进牡蛎血细胞对微球的吞噬作用，因此，利用FCN重组蛋白可以用于体内注射，提高牡蛎血细胞的吞噬功能。这些功能可用于牡蛎饲料添加剂或者牡蛎免疫增强剂开发与应用。
[0009]因此，本发明的第四个目的是提供纤维胶凝蛋白在制备牡蛎饲料添加剂或者牡蛎免疫增强剂中的应用。
[0010]本发明在牡 蛎转录组测序的基础上，发现了一个与ficolin蛋白同源的基因，具有FBG结构域，但是胶原样区结构域不是很清楚。通过RACE技术，我们获得了该基因的全长，该基因编码的多肽序列与已知的ficolin具有高度的同源性，其中保守结构域FBG的编码序列(101_276aa)约有68%同源于小鼠ficolin B (AAC98781.1)，但是，该蛋白只含有很短的胶原样区结构域，仅含有2个重复GXX肽:GRD GVY,而通过BLASTEN分析，发现海鞘的ficolin B (BAB60705)的胶原样区结构域有5个重复GXX肽:GRI GKA GPQ GPP GKV ;而小鼠的ficolin B (AAC98781.1)的胶原样区结构域有15个重复GXX肽:GCP GLP GAA GPKGEA GAK ⑶R GES GLP GIP GKE GPT GPK GNQ GEK GIR GEK GDS GPS，因此，我们可以推断胶原样区结构域的GXX三肽重复序列是随着物种的进化而变化的。因此，这个基因可能是高等动物补体系统ficolin蛋白的起源，是解决软体动物是否存在补体系统争议的钥匙。该基因在软体动物中尚属首次发现，定量PCR实验表明，本发明的牡蛎ficolin基因在细菌感染后显著上调，能够选择性的结合病原微生物，促进血细胞的吞噬功能，说明这个基因参与了宿主的免疫机制，合理的利用这个基因在免疫学中的应用，将进一步提升养殖贝类的种质创新能力，支撑产业的高效可持续性发展。
【专利附图】
【附图说明】:[0011]图1.实时定量PCR检测FCN mRNA在不同组织中的分布。实验结果表明FCN在鳃中丰度最高、而在肌肉和性腺中有中度表达，在其他组织表达不是很明显。
[0012]图2.病原菌刺激诱导FCN的表达。溶藻弧菌(V.alginolyticus) (A)、葡萄球菌(S.haemolyticus) (B)与酵母菌(S.cerevisiae) (C)等病原菌分别刺激后,血细胞中FCN的表达显著上调。星号(**)指示和对照组差异极其显著。
[0013]图3.FCN重组蛋白能够结合酵母，葡萄球菌，但是对溶藻弧菌没有结合功能，其中in pull为阳性参照，免疫检测标签抗体为His标签抗体(IP His),Trx (硫氧还蛋白)为纯化对照蛋白，Trx-FCN为融合蛋白(FCN重组蛋白)。
[0014]图4.FCN重组蛋白能够促进牡蛎血细胞对微球的吞噬作用，null代表没有微球的牡蛎血细胞，Trx为纯化对照蛋白，Trx-FCN为融合蛋白(FCN重组蛋白)，小写字母表示具有显著性差异，P〈0.05。
【具体实施方式】:
[0015]以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0016]实施例1:
[0017]一、RNA提取及反转录
[0018]a).香港牡贩细胞或组织加Trizol后,采用组织研磨器研磨,室温放置5min,使其充分裂解。
[0019]b).12，OOOrpm 离心 5min,弃沉淀。
[0020]c).按200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿,振荡混匀后室温放置15min。
[0021]d).4°C 12，OOOg 离心 15min。
[0022]e).吸取上层水相，至另一离心管中。
[0023]f).按0.5ml异丙醇/ml Trizol加入异丙醇混匀，室温放置5-lOmin。
[0024]g).4°C 12，OOOg 离心 IOmin,弃上清，RNA 沉于管底。[0025]h).按lml75%乙醇/ml Trizol加入75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。
[0026]i).4°C 8, OOOg 离心 5min,尽量弃上清。
[0027]j).室温晾干或真空干燥5-10min。
[0028]k).可用 50ul H20, TE buffer 或 0.5%SDS 溶解 RNA 样品，55_60°C，5-lOmin。
[0029]I).在室温孵育 15min 之后，加入 250 μ L DNase Stop Solution (DSA),在13, 000 X g 离心 lmin。
[0030]m).重复步骤a-j，加IOOyL无核酸酶水，然后，在13，OOOXg离心lmin，弃离心柱，使用分光光度计测量所收集的溶液中的RNA的浓度，分装后，贮存于_80°C。
[0031 ] η).第一条链cDNA的合成
[0032]l)DNase I 消化
[0033]按照如下组分分别将各组的RNA加入到PCR离心管中
[0034]
【权利要求】
1.一种纤维胶凝蛋白基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1的第42位-935位碱基所示。
2.—种纤维胶凝蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
3.权利要求1所述的纤维胶凝蛋白基因作为牡蛎健康状况的标志性基因在制备牡蛎的病理检测试剂中的应用。
4.权利要求2所述的 纤维胶凝蛋白在制备牡蛎饲料添加剂或者牡蛎免疫增强剂中的应用。
【文档编号】C07K14/435GK103937803SQ201410137128
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年4月4日 优先权日:2014年4月4日
【发明者】向志明, 瞿符发, 喻子牛 申请人:中国科学院南海海洋研究所