一种降低牛乳过敏蛋白免疫特性的方法
【专利摘要】一种降低牛乳过敏蛋白免疫特性的方法，其特征是按以下步骤：（1）用0.05M，pH6.8的磷酸盐缓冲液将β-乳球蛋白稀释成0.2mg/ml的蛋白溶液；（2）将步骤（1）配制好的β-乳球蛋白溶液分装于密闭的PE管内，浸没于水浴超声处理装置，频率设定为40KHz，功率300W，处理时间30min。本发明实现了降低牛乳β-乳球蛋白的潜在致敏性的目的，经过超声波处理后β-乳球蛋白，通过竞争抑制性ELISA方法分析，其过敏原性显著降低，IgE的结合能力降低83.8%。
【专利说明】一种降低牛乳过敏蛋白免疫特性的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，特别涉及一种通过非热加工技术降低牛乳过敏原β-乳球蛋白潜在致敏性的方法。
【背景技术】
[0002]乳球蛋白是牛乳中主要的过敏原之一。由于乳球蛋白具有耐酸和耐蛋白酶水解等特性，因此该蛋白经过人体胃肠道消化后，还会有部分完整的β_乳球蛋白或其肽段，容易导致过敏人群产生过敏反应。因此利用各种加工手段降低β_乳球蛋白的过敏原性，可保障过敏人群的安全食用。
食物过敏原不是通过完整的蛋白质分子产生过敏反应，这些引起食物过敏反应的免疫学物质基础就是过敏原表位。而表位包括线性表位和构象性表位，是其过敏原性的结构基础。
[0003]目前已有用于降低牛乳过敏原蛋白β_乳球蛋白的加工方法包括生物加工、化学加工、物理加工等技术。其中，生物加工是利用基因工程技术改变过敏蛋白的基因序列；化学加工则通过酶改性和糖基化等方式改变过敏原蛋白的结构，从而达到降低其致敏性的目的。然而这些技术均存在一定的局限性:β_乳球蛋白主要是以构象性表位为主，难以通过序列变化大幅度改变构象性表位；而β_乳球蛋白具有耐酶解特性，导致酶改性的效果不佳，且糖基化过程中产生的中间产物，会引起人们对食物安全性的考虑。
[0004]物理加工又可分为热加工和非热加工。热加工是牛乳及其乳制品生产过程中常用的灭菌技术，加热过程中会导致牛乳过敏蛋白产生去折叠或聚合等结构变化，从而诱导牛乳过敏蛋白的潜在致敏性的改变。但是，热加工也会致使牛乳中部分营养物质的损失。而非热加工技术不仅能实现热加工预期的加工效果，并能降低食品中有害微生物菌群的数量，同时可维持食品原有的感官和营养品质，保留其中的热敏性营养成分。在非热加工处理中，同时改变牛乳的潜在致敏性。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种降低牛乳过敏蛋白免疫特性的方法。
[0006]本发明所要解决的技术问题通过以下步骤来实现。
[0007](I)制备蛋白溶液:用0.05Μ，ρΗ6.8的磷酸盐缓冲液将乳球蛋白稀释成
0.2mg/ml的均匀蛋白溶液。
[0008](2)将步骤(1)配制好的β -乳球蛋白溶液分装于密闭的PE管内，浸没于水浴超声处理装置，频率设定为40ΚΗζ，功率为300W，样品处理时间分别为30min。
[0009]水浴超声处理装置内部盛满样品，超声传感器附着于液体容器外侧，并且释放出超声波福射样品。
[0010]本发明建立了一种非热加工方法，即超声波技术，实现降低牛乳β-乳球蛋白的潜在致敏性。超声加工 技术应用于蛋白改性主要是依据蛋白质具有声空穴现象，当液体蛋白受到超声波冲击时，一系列的挤压和折射波引起液体介质中蛋白分子的变化。超声波处理的蛋白，其分子性能发生了很大的变化，这是由于超声处理是将电负性基团引入蛋白分子中的过程，增大蛋白分子的静电斥力，使其趋于分散，且构象发生变化，且蛋白与水分子之间的相互作用增强，因此溶解性和聚稳定性提高。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]附图1为本发明超声处理对β-乳球蛋白IgE结合能力的影响。
【具体实施方式】
[0012]本发明将通过以下实施例作进一步说明。
[0013]实施例1。
[0014]1、材料。
[0015]I)配制缓冲液:称取8.775g磷酸氢二钠，3.975g磷酸二氢钠，超纯水溶解并定容至1L，配制成0.05M, pH6.8的磷酸盐缓冲液。
[0016]2)制备蛋白溶液:用0.05M，ρΗ6.8的磷酸盐缓冲液将β-乳球蛋白稀释成0.2mg/ml的均匀蛋白溶液。
[0017]2、方法。
[0018]I)超声波技术处理β -乳球蛋白
超声波处理:将配制好的乳球蛋白溶液分装于密闭的PE管内，浸没于水浴超声处理装置(40KHz，300W)，样品处理时间分别为10、20、30、40、50、60min。
[0019]2) 乳球蛋白致敏性变化的定量分析。
[0020]超声波处理后的β_乳球蛋白溶液作为被分析的蛋白样品，通过竞争抑制性ELISA检测其潜在致敏性的变化。对照未处理蛋白，可以判断出该过敏蛋白潜在致敏性的降低程度。
[0021]3)检测超声处理后的乳球蛋白的致敏性变化
⑴构建牛乳过敏患者血清池:选定11位符合既定条件的牛乳过敏患者的血清混合制备而成。这些患者的血清符合以下条件:对牛乳过敏呈阳性；总的IgE水平均>100 IU/mL ；特异性IgE水平均>1 IU/mL。
[0022]⑵抗原包被:将不同超声波处理时间后的各个乳球蛋白溶液稀释至2.5yg /mL，在一块酶标板上分别包被上100 μ L，以未处理的β-乳球蛋白溶液为对照。4°C过夜后PBST洗板三次，每次5min。
[0023]⑶明胶封阻:每孔加入250 μ L 3%明胶，37°C封阻lh。洗板三次。
[0024]⑷一抗反应:另准备一块酶标板以同样的方式进行封阻，洗涤之后，每孔加入1:20稀释度的人血清100 μ L，37°C反应lh。反应时间结束后，每孔吸取100 μ L转移至第一块板内，37 °C孵育Ih，PBST洗板三次。
[0025](5)二抗反应:每孔加入1:5000稀释度的生物素标记羊抗人IgE 二抗100 μ L, 37°C反应lh。PBST洗板。
[0026](6)亲和素反应:每孔加入1:60稀释的HRP-链霉素标记的亲和素100 μ L,37°C反应，洗板。(7) OPD显色和检测:每孔加入100 μ L现配制的OPD显色液，37°C避光反应15min，反应结束后每孔50 μ L加入2Μ H2SO4终止液，在490nm处用酶标仪测定OD值
(8)结果的计算,IgE结合能力(%) = (1-B/B。)X 100%, B0:无竞争蛋白时的OD值；B:各加工条件下竞争蛋白对应的OD值。
[0027]3、结果。[0028]经过超声波处理后β -乳球蛋白，通过竞争抑制性ELISA方法分析其IgE结合能力的变化即潜在致敏性变化，如附图1所示。经过20min、40min、50min及60min的超声处理的β -乳球蛋白，过敏原性几乎无变化。但经过IOmin和30min的超声处理的β -乳球蛋白样品，其过敏原性均有显著降低，其中30min的超声处理可使其IgE的结合能力降低最明显。
【权利要求】
1.一种降低牛乳过敏蛋白免疫特性的方法，其特征是按以下步骤:(1)用0.05M, pH6.8的磷酸盐缓冲液将β -乳球蛋白稀释成0.2mg/ml的蛋白溶液； (2)将步骤(1)配制好的β-乳球蛋白溶液分装于密闭的PE管内，浸没于水浴超声处理装置，频 率设定为40ΚΗζ，功率300W，处理时间30min。
【文档编号】C07K1/113GK103910792SQ201410148144
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2014年4月15日 优先权日:2014年4月15日
【发明者】陈红兵, 李欣, 白雨鑫, 高金燕, 龙伟, 吴志华, 杨安树, 佟平 申请人:南昌大学