一种治疗肿瘤的重组多肽的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种治疗肿瘤的重组多肽。特别地，本发明的重组多肽包含三个免疫原性抗原肽、以及人表皮生长因子hEGF成熟肽，各抗原肽以及hEGF成熟肽之间通过2至10个氨基酸长度的连接肽连接。
【专利说明】一种治疗肿瘤的重组多肽
【技术领域】
[0001]本发明涉及用于一种重组多肽，以及其用于治疗肿瘤的用途。所述肿瘤选自直肠癌、肺癌、乳腺癌。
【背景技术】
[0002]目前，临床上对癌症患者最主要的治疗方式之一仍是药物疗法。但传统的抗肿瘤药物都是通过分布全身达到一定的血药浓度而发挥疗效，且这些药物的作用机理一般是针对代谢旺盛、增殖较快的细胞发挥毒性作用，选择性较差，因而对正常组织细胞也具有较大杀伤作用，产生明显毒副作用，给患者身心带来巨大痛苦，使这些药物的抗肿瘤治疗价值大大降低。近几年来，肿瘤分子生物学的迅速发展创新了肿瘤治疗的新模式，肿瘤生物治疗、肿瘤靶向生物治疗逐渐成为肿瘤治疗的新趋势，并取得一些突破性进展。肿瘤细胞一般特异表达某类分子或高表达与肿瘤增殖、侵袭相关的受体，而肿瘤相关血管表面通常也异常表达细胞因子类受体，这些分子与肿瘤生长增殖和侵袭转移密切相关，可作为抗肿瘤治疗的革巴点。肿瘤靶向生物治疗是利用抗原-抗体、配体-受体之间的特异性结合作用，将药物或其他杀伤肿瘤细胞的活性物质选择性地运送到肿瘤部位，或抗体本身作为治疗药物，使治疗作用或药物效应尽量局限在特定的靶细胞、组织或器官内，而不影响正常细胞、组织或器官的功能，从而提高疗效、减少毒副作用的一种方法。目前的实验室和临床研究结果表明，细胞因子类受体多作为肿瘤生物治疗的靶点，具有特异、广谱、高效的特点。常见的肿瘤治疗靶点，如:表皮生长因子受体(EGFR)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、⑶20和mTOR激酶等。[0003]EGFR家族靶向治疗是目前肿瘤治疗领域研究的热点，EGFR家族由4个不同的受体酪氨酸激酶(Receptor tyrosine kinase, RTK)组成，分别是 EGFR、HER2、HER3 和 HER4。它们参与激活一系列复杂的细胞信号转导途径，广泛表达于上皮、间质及神经组织，在正常组织中调控细胞的生长、分裂、分化等重要生理过程。其中EGFR的过表达或异常活化往往会引起正常细胞的癌变，在非小细胞肺癌、头颈癌、乳腺癌、卵巢癌、肾癌等多种肿瘤细胞中发现其表达量大大高于正常细胞，同时高表达的EGFR与肿瘤的高侵袭力、放化疗敏感性降低及预后不良有关。EGFR的天然配体是EGF,人表皮细胞生长因子(human epidermalgrowth factor, hEGF)的成熟肽是由53个氨基酸组成的小分子肽,能刺激细胞增殖、分化和迁移，在伤口愈合和器官发生中扮演着重要角色。至今，以EGFR为靶点的抗肿瘤治疗进入研究程序或应用领域主要有四类:①大分子单克隆抗体类，如西妥昔单抗和帕尼单抗等；
②小分子酪氨酸激酶抑制剂类，如吉非替尼、厄洛替尼和拉帕替尼等；③反义寡核苷酸类，如siRNA、miRNA和shRNA等；@ EGFR下游信号通路分子抑制剂等。前两类进入临床应用的较多，其中单克隆抗体类在动物实验中显示出较强的抗肿瘤活性，但是临床研究结果却不理想，主要原因有几下方面:1)鼠源性的靶向单抗在应用于人体治疗时，刺激产生人抗鼠抗体，不但会中和靶向抗体，使其被快速清除，而且能够引起人体过敏反应；2)人源单抗或基因工程抗体在亲和力和特异性方面存在问题，药物靶向性差；3)单抗类或单抗偶联物类，分子量较大，毛细血管穿透能力低，且肿瘤内部组织压力高，使到达肿瘤的药量不足；4)随着治疗时间的延长，肿瘤抗原发生调变或缺失，使单抗不能结合于靶细胞。另外，小分子酪氨酸激酶抑制剂类药物，临床研究显示仅10%~30%患者对其敏感，绝大多数患者存在耐药的情况，且随着治疗，绝大多数原来敏感的患者获得继发耐药性。主要原因是EGFR结构突变或其他许多位于EGFR下游信号途径或旁路激活途径的分子突变，导致这条信号通路在不依赖EGF的情况下持续活化。针对上述问题，目前国内外正积极开发新的靶向治疗药物，使其能解决上述不足。一些小分子重组多肽类药物，生物源性，由于其分子量小，易于透过肿瘤毛细血管，到达靶部位，具有较好的应用前景，但需要提高其靶向性。另外，具有免疫调节功能的小分子蛋白质靶向结合肿瘤细胞后，可激活机体免疫系统，促进免疫细胞迁移、增殖和活化，利用机体自身免疫机制发挥长时间抗肿瘤作用。
[0004]近年来，一些微生物来源的蛋白分子逐渐引起人们的重视。人体感染某种微生物病原体后，往往机体产生较强的免疫应答，主要是因为微生物与人体种属差异大，表达或分泌的蛋白分子免疫原性高，能充分激活机体的固有免疫和适应性免疫系统，调动免疫防御机制，从而利于病原体的杀灭和清除。在人体，肿瘤细胞之所以难以被机体彻底消灭，主要原因之一是肿瘤细胞来源于异常突变的正常细胞，抗原性不强，免疫细胞不能充分识别、活化和发挥杀伤功能。因此，利用微生物源性蛋白制备抗癌靶向生物治疗药物具有很好的应用前景。李斯特菌细胞溶解素(Listeriolysin O, LL0)是李斯特菌产生的一种重要蛋白，由于其一级结构和三维结构的独特性，LLO在抗肿瘤药物的开发方面逐渐被重视。李斯特菌(Listeria monocytogenes,Lm)是一种革兰染色阳性细菌,胞内寄生,通过被动吞卩遼或主动粘附可侵入多种类型细胞，主要是巨噬细胞等其他吞噬细胞。李斯特菌之所以能够寄生于细胞内部，主要是因为LLO可协助Lm从吞噬溶酶体中逃逸，进入细胞浆，引起的抗感染免疫应答主要是T细胞免疫。LLO本身具有很强的免疫原性，具有很多显性的⑶4+和⑶8+T细胞表位[1-4]，可诱导机体产生特异性的T细胞，在抗李斯特菌感染中发挥重要作用。经国外文献报道，已经 证实LLO分子中存在I个显性⑶8+T细胞表位和2个⑶4+T细胞表位[3，5，6]。这些抗原短肽被特异性的T细胞识别，促进T细胞扩增和活化。我们想到利用这些显性抗原表位，构建一重组小分子蛋白，使其既具有靶向结合肿瘤细胞的作用，同时还可以发挥免疫激活作用，促进T细胞增殖和分化为效应细胞，发挥靶向抗肿瘤的作用。
[0005]综合考虑目前肿瘤靶向治疗的靶点选择，我们想到利用EGFR的天然配体EGF作为构建小分子重组蛋白的“靶向导弹”。一方面，相对于单抗来说，EGF是由53个氨基酸组成的小分子肽，不易被机体内皮系统清除，易于透过毛细血管，可特异性地结合于肿瘤细胞高表达的EGFR，亲和力高；另一方面，由于肿瘤患者多存在EGFR结构突变，EGF结合EGFR不能激活肿瘤细胞的增殖信号，构建的重组蛋白还可与肿瘤细胞自身分泌的EGF竞争，结合于靶细胞的重组蛋白可发挥免疫激活作用，提高肿瘤细胞的抗原性，从而有利用免疫细胞对瘤细胞的特异性杀伤。
【发明内容】
[0006]本发明提供一种新的靶向抗肿瘤重组蛋白的构建和制备方法，该重组蛋白(pLLO-hEGF)不仅可以高效结合肿瘤细胞，而且在裸鼠移植瘤实验中可明显发挥抑制肿瘤生长的作用。[0007]本发明通过生物工程技术表达纯化，单一多肽链，147个氨基酸。N端94个氨基酸包含来自李斯特菌细胞溶解素的三个免疫显性抗原肽，抗原肽之间通过柔性连接肽连接，抗原性强，可有效激活机体免疫系统，促进淋巴细胞增殖和活化。C端53个氨基酸是人表皮生长因子EGF成熟肽的完整序列，EGF是EGFR的天然配体，可特异性的结合于EGFR。绝大多数肿瘤细胞高表达EGFR，是抗肿瘤药物的重要靶点。该重组蛋白质利用EGF特异结合EGFR的特性，靶向结合到肿瘤细胞表面，增加肿瘤细胞的抗原性，其N端的抗原肽趋化、活化免疫细胞，显著增强效应细胞对肿瘤细胞的杀伤。
[0008]本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:在重组蛋白的设计方面，LLO的三个显性抗原肽之间采用柔性连接肽连接，有利于被抗原递呈细胞降解递呈，抗原肽与hEGF之间采用连接肽连接，有利于hEGF三维空间结构的正确折叠，从而发挥重组蛋白靶向结合瘤细胞的“靶向导弹”作用。重组蛋白的DNA序列采用化学合成法合成，表达采用原核表达体系E.Coli BL(21)、pET-30a(+)载体，IPTG为诱导剂，诱导过程采用低温、低浓度诱导剂和长时间诱导，解决原核体系蛋白表达包涵体问题，重组蛋白大量以可溶活性形式表达。重组蛋白纯化采用Co2+亲和层析柱过柱纯化,Thrombin蛋白酶酶切,PBS洗脱目的蛋白，解决蛋白原核表达纯化过程中存在较多细菌性杂蛋白的问题。采用去内毒素纯化柱，去除纯化蛋白中的致热源脂多糖(LPS)，使纯化蛋白达到细胞和体内实验的应用级别。采用细胞爬片免疫化学染色的方法，荧光显微镜观察重组蛋白大量靶向结合肿瘤细胞表面；采用MTT法证明重组蛋白无潜在刺激癌细胞增殖的能力；采用刺激人外周血单个核细胞(PBMC)增殖的方法分析重组蛋白的免疫原性，重组蛋白可刺激淋巴细胞增殖，增殖活化的淋巴细胞对多种EGFR高表达肿瘤细胞具有明显杀伤活性；将高表达EGFR的人结直肠癌细胞系HCTl 16接种于裸鼠建立移植瘤模型，重组蛋白活化的淋巴细胞瘤旁注射裸鼠体内，可明显抑制肿瘤生长。
[0009]本发明的优点是:与目前抗肿瘤靶向治疗药物相比，该重组抑癌蛋白，生产制备简单，成本低，产量高，作为一种生物反应调节剂，即可靶向结合肿瘤，又可刺激淋巴细胞增殖活化，强化对肿瘤细胞的杀伤。
[0010]本发明提供了一种重组多肽，所述重组多肽包含三个免疫原性抗原肽、以及人表皮生长因子hEGF成熟肽，各抗原肽以及hEGF成熟肽之间通过2至10个氨基酸长度的连接肽连接。
[0011]进一步地，根据本发明所述的重组多肽，其中所述三个免疫原性抗原肽分别识别一个⑶8+T细胞的表位以及二个⑶4+T细胞的表位。
[0012]进一步地，根据本发明所述的重组多肽，其中三个免疫原性抗原肽分别选自SEQID NO:3-5所示的多肽。
[0013]进一步地，根据本发明所述重组多肽，其中所述连接肽具有6个氨基酸长度。
[0014]进一步地，根据本发明所述的重组多肽，其中所述连接肽的氨基酸序列如SEQ IDNO:8所示。
[0015]进一步地，根据本发明所述重组多肽，其中所述重组多肽的氨基酸序列如SEQ IDNO:2的第15位氨基酸至第161位氨基酸所示。
[0016]另一方面，本发明提供了编码本发明重组多肽的核酸分子。
[0017]进一步地，根据本发明的核酸分子，其中所述核酸的序列如SEQ ID NO:1所示。[0018]另一方面，本发明提供了根据本发明的重组多肽，在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途。
[0019]进一步地，根据本发明的用途，其中所述肿瘤选自直肠癌、肺癌、乳腺癌。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1A至图1B是重组抑癌蛋白质pLLO-hEGF的一级结构。图1A:蛋白酶切之前完整的一级氨基酸序列组成，不同短肽含义以及纯化过程中ThiOmbin酶切位点；图1B:重组抑癌蛋白质的最终氨基酸序列及各部分功能短肽的立体展示:1.N端序列，2.C端序列，
3.⑶8+T细胞表位和两边碱性氨基酸序列，4.⑶4+T细胞表位1，5.⑶4+T细胞表位2，6.连接肽。
[0021]图2A表示重组质粒构建流程示意图，图2B重组质粒的测序鉴定结果。
[0022]图3A-图3B重组蛋白小量诱导表达和大量表达酶切纯化结果。图3A:5ml重组菌37°C、lmM IPTG、诱导4h，重组蛋白的表达，箭头处为诱导的目的蛋白；图38:21^重组菌230C >0.5mM IPTG、诱导8~10h，超声裂解后经Co2+柱纯化，Thrombin酶切，重组蛋白的纯化，箭头处为纯化的目的蛋白。
[0023]图4A至图4F表示是重组蛋白靶向结合肿瘤细胞效果观察。图4A至4B:重组蛋白结合于结直肠癌细胞HCTl 16和HT29 ;图4C至4D:重组蛋白结合于肺癌细胞A549和NC1-H157 ;图4E至4F:重组蛋白结合于乳腺癌细胞SK-BR-3和MDA-MB-231。
[0024]图5A至图5L表示MTT增殖实验，证明重组蛋白无刺激癌细胞增殖的能力(EGF为蛋白对照，PBS为空白对照，设4个浓度梯度:10[-10]M/L；10[-9]M/L；10[-8]M/L ；10[-7]Μ/L)。图5A至:重组蛋白作用下，结直肠癌细胞HCT116和HT29的生长曲线；图5E至5H:重组蛋白作用下，肺癌细胞A549和NC1-H157的生长曲线；图51至5L:重组蛋白作用下，乳腺癌细胞SK-BR-3和MDA-MB-231的生长曲线。
[0025]图6A至图6G是重组蛋白(pLLO-hEGF)刺激淋巴细胞增殖活化和效应细胞对不同肿瘤细胞的杀伤效果。图6A至6B:重组蛋白刺激⑶3+T细胞增殖；图6C至6D:重组蛋白刺激⑶3+⑶4+T细胞增殖；图6E至6 F =ConA刺激⑶3+⑶8+T细胞增殖；图6G:细胞毒性实验表明重组蛋白活化的淋巴细胞对不同肿瘤细胞的杀伤率。
[0026]图7A至7F表明重组蛋白抑制裸鼠体内肿瘤生长的效果。图7A至7B:各组小鼠平均体重变化趋势；图7C至7D:各组小鼠体内肿瘤生长(体积)情况及各组瘤重；图7E:各组小鼠HCTl 16实体瘤示意图；图7?:各组小鼠瘤块石蜡切片HE染色结果；注:①:PBS对照组-,②:重组蛋白活化淋巴细胞注射组(d0) !③:Control组淋巴细胞注射组(d0):重组蛋白活化淋巴细胞注射组(d7) !⑤:ControI组淋巴细胞注射组(d7)。
【具体实施方式】
[0027]下面结合附图对本发明作进一步描述。
[0028]实施例1:
[0029]设计336bp DNA序列，包含来自LLO的三个显性抗原肽核苷酸序列和hEGF核苷酸序列，不同肽段编码序列之间是连接肽核苷酸序列。设计序列采用化学合成法人工合成，构建于模板质粒:A-336_pMA-T(Amp+)。在图2A中，采用碱裂解法抽提表达质粒pET_30a(+)，分别取I μ g加入到50 μ I感受态细胞DH5a和50 μ I感受态细胞BL21 (DE3)中，轻轻旋转混匀后，冰浴30min，42°C热休克60s，冰上置2min，分别加入LB培养基800 μ 1，置37°C摇床200rpm、振摇90min后,置离心机3000rpm离心5min,倒去上清,残留100 μ I培养基,小心重悬菌体后，用玻璃棒涂布于Kana抗性的平板上。平板置于37°C培养箱,倒置培养16h。挑取单克隆菌于LB液体培养基扩大培养。其中转化DH5a菌可保存质粒pET_30a (+)，转化BL21(DE3)菌作为质粒pET-30a(+)没有插入目的基因的空载菌。选取酶切位点Bam H I和 Xho I，设计目的基因 PCR 引物:Forward5’ -GCGGATCCAGAAAAGGTTAC-3’，Reverse5’ -GCTCGAGTTAGCGCAGTTC-3’。以A_336_pMA_T为模板PCR扩增目的基因，扩增产物和空载质粒pET-30a(+)同时进行双酶切(Bam H I,Xho I)。PCR产物37°C酶切5h，质粒酶切2h。酶切产物行1%TAE琼脂糖凝胶电泳30min，切胶回收。以PCR产物:质粒=5:1的摩尔浓度比，用T4DNA连接酶室温连接2h。20 μ I连接体系转化100 μ I感受态细胞BL21 (DE3)，经42°C热激60s、37°C摇床振摇后，铺于Kana抗性平板，37倒置培养16h后，挑取单克隆。单克隆用LB培养基扩大培养后，抽提质粒做模板，用上述PCR引物扩增目的基因。能够扩增出目的基因的质粒用Bam H I和Xho I进行双酶切验证，能够切出目的基因的单克隆送生物公司进行DNA测序。DNA测序结果输入GenBank数据库，与设计的目的基因序列进行Blast比对，100%match的测序质粒即为构建成功的重组质粒(图2B)。
[0030]实施例2:
[0031]如图3A所示，重组蛋白(pLLO-hEGF)的诱导表达。先将测序正确的重组单克隆菌液按按1:100的比例接种到5ml/支的LB培养基中，按1:1000的比例加入Kana抗生素，37°C、250rpm摇床振荡培养。待菌液的OD6tltl在0.6~0.8时，取I支5ml菌，用作重组蛋白的小量诱导表达。菌液中加入诱导剂IPTG，使其终浓度为ImM，继续37°C、250rpm振荡培养4h。重组蛋白在37°C诱导表达时，主要以包涵体形式存在。各取Iml诱导前和诱导后的菌液，1000Orp m离心lmin，加入100 μ IlX SDS上样缓冲液，100°C煮沸lOmin，冷却后12000rpm离心5min，取上清作为上样样品进行12%的SDS-PAGE，凝胶经0.05%考马斯亮蓝染色2h，脱色液脱色后观察。小量诱导重组蛋白表达，在16kDa处出现明显的诱导条带(图3B)。大量诱导重组蛋白表达和纯化，与小量诱导不同，经过摸索实验条件，确定低温、低浓度诱导剂和长时间诱导，可使目的蛋白以可溶形式表达。先取4支0D_在0.6~0.8的5ml菌，分别加入4个各含500ml LB培养基的锥形瓶中，同时按1:1000比例加入Kana抗生素，37°C、250rpm振荡培养3小时。加IPTG，终浓度为0.5mM，采用23°C、220rpm，低温诱导8~10h。收菌液，4°C、5500rpm离心30min，弃上清，沉淀用20ml过柱缓冲液重悬(TAL0N1XEquilibration/Wash)，置-80°C冻存，然后流水融化，反复3次裂解菌体。裂解菌体经超声处理，降低粘稠度，功率为400w (超10s、停5s、共30min)。4°C、12000rpm离心40min,弃沉淀留上清，上清中含有可溶性重组蛋白。上清经0.45 μ m滤膜过滤后，准备过TALON Co2+亲和层析柱纯化。Co2+亲和层析柱经预先激活处理:20倍柱床体积的MES溶液过柱，使柱子重生；10~20倍柱床体积的IX Equilibration/Wash过柱,平衡填料树脂。加样过柱后，用50~80ml TAL0N1X Wash Buffer洗去与柱子结合的杂蛋白。再用10倍柱床体积的IXEquilibration/Wash过柱,平衡树脂。然后用PBS稀释Thrombin(20U/ml),加入层析柱中。层析柱置于20°C，酶切12~16h后，用IOmlPBS过柱收取纯化蛋白(Iml/支)。38 μ I纯化蛋白加2 μ IlM DTT和8 μ 16Χ SDS上样缓冲液，100。。煮沸lOmin，样品行12%的SDS-PAGE,经染色和脱色处理后观察，在15kDa处有明显的纯化蛋白条带(图3-3)。纯化蛋白经0.22 μ m滤膜过滤、ToxinEraser? Endotoxin Removal Kit去内毒素、BCA法测浓度后,可用于淋巴细胞刺激和动物体内注射。
[0032]实施例3:
[0033]在图4A-4F中，重组蛋白(pLLO-hEGF)可靶向结合多种肿瘤细胞。采用细胞免疫化学染色的方法分析重组蛋白能否结合高表达EGFR的肿瘤细胞。制备不同肿瘤细胞的细胞爬片，包括结直肠癌细胞HCTl 16和HT29 (图4A和4B)，肺癌细胞A549和NC1-H157 (图4C和4D)，乳腺癌细胞SK-BR-3和MDA-MB-23K图4E和4F)。PBS洗细胞爬片3次，每次2min。4%多聚甲醛室温固定30min，小镊子夹住玻片浸入PBS洗3次，每次5min。3%BSA室温封闭30min，PBS洗2次，每次5min。设3组:抗EGFR Rabbit mAb组，即阳性对照组；EGF对照组；重组蛋白组。EGF组和重组蛋白组需分别加EGF和重组蛋白，在4°C孵育8h。抗EGFRRabbit mAb组二抗采用羊抗兔IgG-FITC，用含1%BSA的PBS按1:100稀释，室温孵育3h，PBS洗3次，每次5min。EGF组和重组蛋白组在分别加蛋白孵育后，PBS洗2次，每次5min。一抗均用小鼠抗人EGF抗体，用含1%BSA的PBS按1:200稀释，4°C孵育过夜。二抗采用羊抗鼠IgG-FITC，用含1%BSA的PBS按1:100稀释，室温孵育3h，PBS洗3次，每次5min。每组均用DAPI染核封片剂封片，荧光显微镜下观察细胞荧光(20X10倍)。与抗EGFR mAb对照组和EGF对照组相比，重组蛋白可有效结合靶细胞，结合能力相当。对高表达EGFR的不同肿瘤细胞，重组蛋白均可有效结合。[0034]实施例4:
[0035]如图5A至5L所示，不同浓度重组蛋白(pLLO-hEGF)对多种EGFR高表达肿瘤细胞的生长增殖无影响，即无潜在促进癌细胞增殖的作用。将T25培养瓶中的肿瘤细胞用0.25%的胰酶消化下来，用相应培养基(HCT116:5%FBS IMDM ；HT29:5%FBS IMDM/F12 ；A549:10%FBS McCoy’ 5A ;NCI_H157:10%FBS RPMI1640 ；SK-BR-3:10%FBS RPMI1640 ；MDA-MB-231:10%FBS L15)制成单个细胞悬液，Sc印terTM型细胞计数仪计数，不同肿瘤细胞以不同浓度接种 96 孔板(HCT116:1000/ 孔；HT29:2000/ 孔；A549:1000/ 孔;NCI_H157:2000/ 孔；SK-BR-3:2500/ 孔；MDA-MB-231:3000/ 孔)，每孔体积 100 μ 1，各用 4 个 96 孔板，取 4 个时间点检测细胞增殖情况。细胞接种24h后，以EGF为对照，加入不同浓度重组蛋白，浓度梯度为:10[_1CI]M/L ;10[_9]M/L ;10[_8]M/L ;10[_7]M/L，其中≤ 10[-10]M/L为正常体液生理浓度范围，每个浓度梯度设6个复孔。分别于加入重组蛋白后培养的24h、48h、72h和96h加入MTT进行呈色反应，每孔加入100 μ I MTT溶液(5mg/ml，用无菌PBS配制成0.5mg/ml)，继续孵育4h，终止培养，用真空负压泵小心吸弃孔内培养上清，每孔加100 μ I DMSO,摇床振荡lOmin，使结晶物充分溶解，酶标仪检测0D570处各孔的吸光度值。见图5，与EGF相同，在不同浓度下，重组蛋白均无刺激瘤细胞增殖的作用(PBS为对照)，对高表达EGFR的结直肠癌细胞HCTl 16 和 HT29 (图 5A-5D)，肺癌细胞 A549 和 NC1-H157 (图 5E-5H)，乳腺癌细胞 SK-BR-3和MDA-MB-231 (图51-5L)，不同浓度重组蛋白对其生长曲线均无影响。
[0036]实施例5:
[0037]在图6A至6G中，重组蛋白(pLLO-hEGF)可刺激人PBMC增殖和活化。从液氮中复苏冻存的健康人PBMC或从健康志愿者外周血中分离出PBMC，然后用含rhIL-2 (100U/ml)、青链霉素(100U/ml)、谷氨酰胺、10%进口胎牛血清(FBS)的RPMI1640完全培养基重悬。Scepter?型细胞分析计数仪计数，调整细胞浓度为2X106/ml，以每孔1ml，铺于24或48孔板，置于37°C、5%C02培养箱培养。设三组:空白组(Control )、重组蛋白刺激组(Antigen)、阳性对照组(ConA)。重组蛋白浓度设为10μg/ml, ConA浓度设为5 μ g/ml。分别于刺激培养的第3天、第7天和第14天，计数各组细胞绝对数和流式检测细胞群体中⑶3+、⑶3+⑶4+、⑶3+⑶8+T细胞的百分比，并计算出其绝对数。图6中，与对照组相比，重组蛋白组(pLLO-hEGF)⑶3+、⑶3+CD4+T细胞在第14天时，其百分比和绝对数均明显增加(图6A-6D)。ConA组与Control组相比，其CD3+、CD3+CD8+T细胞在第7天和第14天百分比和绝对数均明显增加(图6-1，6-3)，但⑶3+⑶4+T细胞百分比在第14时明显降低(图6C-6D)。⑶3+⑶4+T细胞的扩增和活化是特异性免疫应答过程的重要环节，重组蛋白(pLLO-hEGF)可刺激⑶3+⑶4+T细胞的扩增，启动免疫反应。ConA是非特异性的促T细胞有丝分裂剂，亦称为T细胞丝裂原，不能启动特异性免疫应答。以重组蛋白刺激14天的淋巴细胞为效应细胞,观察对不同肿瘤细胞的杀伤作用。将不同肿瘤细胞接种至96孔板，同时加重组蛋白(10μg/ml)，3h细胞贴壁后，加入刺激14天的淋巴细胞，效靶比(Effector:Target，E:T)设置为 50:1，12h 后加 MTT，置 37°C、5%C02 培养箱，4h 后检测每孔0D570值。重组蛋白(pLLO-hEGF)可有效杀伤肿瘤细胞，对不同肿瘤细胞的杀伤率(％)分别为:结直肠癌细胞:HCT11669.89±1.05，ΗΤ2960.40±2.33 ;肺癌细胞:Α54949.45±1.72，NC1-H15785.26±4.82 ;乳腺癌细胞:SK_BR-347.90±1.39 (图 6G)。
[0038]实施例6:[0039]如图7A-7F所示，重组蛋白活化的淋巴细胞可抑制裸鼠移植瘤的生长。以HCT116细胞为例，30只SPF级BALB/c-裸鼠(4~6w)，左侧腋窝下接种HCTl 16细胞，2X106细胞/只。设5组，每组6只，分别为:①PBS对照组；②重组蛋白-淋巴细胞注射组I ;③Control淋巴细胞注射组I 重组蛋白-淋巴细胞注射组2 Control淋巴细胞注射组2。其中
②和③组在接种肿瘤细胞的同时，瘤旁注射淋巴细胞，④和⑤组在接种肿瘤细胞7天后瘤旁注射淋巴细胞。以后每隔7天，①组注射PBS，100y I/只，②、③、④、⑤组均瘤旁注射I次淋巴细胞，不同组淋巴细胞均为培养14天后注射，每组均注射3次淋巴细胞。淋巴细胞用无血清RPMI1640培养基重悬，并加rhIL-2(200U/只)，调整细胞浓度，2X106细胞/100 μ 1，每只裸鼠注射100 μ I。②和④组在注射淋巴细胞的同时，腹腔注射重组蛋白40 μ g/只，维持淋巴细胞在体内的活化状态。接种肿瘤后每3天或4天称量体重，测量瘤长和瘤宽，25天后断颈处死小鼠后，无菌镊子分离实体瘤，称重，统计学分析②、③、④、⑤组与对照组相比有无差异，即抑瘤作用。瘤块用10%中性福尔马林固定液固定，48h后更换70%乙醇固定。然后经脱水、浸蜡、包埋，做成组织蜡块。石蜡切片机切成厚度为3μπι的组织薄片，载玻片贴片24h后经HE染色，观察瘤灶内淋巴细胞浸润和肿瘤细胞坏死程度。如图7A-7B所示，②和④组裸鼠体重在第25天处死时明显高于初始O天的体重，而其余各组均没有统计学差异(One-way ANOVA Analysis),说明重组蛋白组淋巴细胞注射荷瘤小鼠体内，可改善其生存质量，没有明显毒副作用。如图7C-7D所示，计算肿瘤体内生长曲线，②和④组荷瘤小鼠肿瘤生长速度明显小于①组；处死小鼠称量瘤重，②和④组瘤重显著小于①组(P〈0.05)，而
③和⑤组与①组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。说明重组蛋白刺激活化的淋巴细胞具有明显抑制体内肿瘤生长的作用(图7E)。各组小鼠瘤组织石蜡切片HE染色镜下观察结果显示:①组瘤组织坏死灶少(4X)，肿瘤细胞生长旺盛，细胞因生长较快产生缺血缺氧性坏死，细胞由圆形变成长梭形(20X)，瘤细胞生长致密，呈侵袭性生长(40X);②、③、④、⑤组瘤组织出现不同程度的坏死，其中②和④组坏死灶较多，瘤细胞呈结节样生长，出现大片坏死区(4X)，坏死区瘤细胞溶解坏死，形态不完整，HE染色呈桔红色(20X)，大量淋巴细胞浸润，多出现在淋巴细胞接种部位，呈片状或条索状分布(40X)(图7F)。HE染色结果表明重组蛋白活化的淋巴细胞可大量杀伤肿瘤细胞，其作用强于对照组未剌激淋巴细胞，重组蛋白作为一种生物反应调节剂，可发挥靶向抗肿瘤的作用。
[0040]参考文献
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【权利要求】
1.一种重组多肽，所述重组多肽包含三个免疫原性抗原肽、以及人表皮生长因子hEGF成熟肽，各抗原肽以及hEGF成熟肽之间通过2至10个氨基酸长度的连接肽连接。
2.根据权利要求1所述的重组多肽，其中所述三个免疫原性抗原肽分别识别一个⑶8+T细胞的表位以及二个⑶4+T细胞的表位。
3.根据权利要求2所述的重组多肽，其中三个免疫原性抗原肽分别选自SEQID NO:3-5所示的多肽。
4.根据权利要求3所述的重组多肽，其中所述连接肽具有6个氨基酸长度。
5.根据权利要求4所述的重组多肽，其中所述连接肽的氨基酸序列如SEQID NO:8所/Jn ο
6.根据权利要求5所述的重组多肽，其中所述重组多肽的氨基酸序列如SEQID NO:2的第15位氨基酸至第161位氨基酸所示。
7.编码权利要求1-6任一项的重组多肽的核酸分子。
8.根据权利要求7所述的核酸分子，其中所述核酸分子的序列如SEQID ΝΟ:1所示。
9.根据权利要求1 -6任一项所述的重组多肽，在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其中所述肿瘤选自直肠癌、肺癌、乳腺癌。
【文档编号】C07K19/00GK103897067SQ201410152549
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年4月16日 优先权日:2014年4月16日
【发明者】刘玉琴, 孙蕊, 朱琰 申请人:中国医学科学院基础医学研究所