一种鸡胚蛋卵黄高磷蛋白磷酸肽的提取方法
【专利摘要】一种鸡胚蛋卵黄高磷蛋白磷酸肽的提取方法，属于食品添加剂【技术领域】。本发明通过收集孵化至一定天数的鸡胚蛋，经组织匀浆、离心沉淀、脱脂过滤等手段提取卵黄高磷蛋白，之后在超高压辅助条件下对其进行水解，随后通过超滤得到小分子组分，对产物进行干燥处理，得到磷酸肽产品。该方法相比从普通鸡蛋中制备磷酸肽的传统工艺而言，充分利用了鸡胚蛋内源酶对卵黄高磷蛋白的酶解与脱磷，从而省去了人工脱磷等步骤，大大缩短工艺时间，节省成本。所得磷酸肽产品具有促进矿物质吸收的功效，可以作为新型功能食品进行开发，或作为一种天然的促进矿物质吸收的食品添加剂加入到功能性食品当中。
【专利说明】一种鸡胚蛋卵黄高磷蛋白磷酸肽的提取方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种鸡胚蛋卵黄高磷蛋白磷酸肽的提取方法，特别涉及一种利用鸡胚蛋内源酶对卵黄高磷蛋白进行部分脱磷，再通过外源蛋白酶酶解得到的，具有促进矿物质吸收作用的磷酸肽的提取方法，属于食品添加剂【技术领域】。
【背景技术】
[0002]近年来，生物活性肽成为保健品行业研究和开发的热点，日本以及欧美国家目前已推出各种含有活性肽的功能性食品及食品添加剂。这种新型功能性食品有助于减少和控制与饮食有关的慢性疾病，成为一种具有极大商业前景的产业。
[0003]磷酸肽是被研究和开发最早的一种功能肽，因其含有大量的磷酸丝氨酸基团，因此能与Ca2+、Fe2+等矿物质离子在小肠弱碱性环境中形成可溶性络合物，具有促进矿物质吸收的生理活性，从而可以促进儿童骨骼和牙齿的发育，预防和改善中老年人骨质疏松症，促进骨折患者的康复，预防和改善缺铁性贫血，抗龋齿等多种功能。目前在国内食品行业，应用最广泛的是酪蛋白磷酸肽(CPP)。石家庄维平功能食品科技有限公司研制出了添加有CPP的富钙富铁的梨汁；山东中德啤酒有限公司研制出添加CPP的多肽啤酒；伊利乳业、圣元乳业、龙丹乳业等都有添加CPP的乳制品面世；恒寿堂研发的金乳钙中也添加有CPP。[0004]相比酪蛋白，鸡蛋中的卵黄高磷蛋白含有更多的磷酸丝氨酸基团(50%左右)，是自然界中磷酸化程度最高的一种蛋白质。因而相比酪蛋白，卵黄高磷蛋白被认为是一种新型的、更具有开发潜力的磷酸肽来源。自2000年以来，加拿大的Mine教授、江南大学的江波教授等团队对卵黄高磷蛋白磷酸肽(PPP)促进矿物质吸收的生理功效进行了广泛研究，本发明也对PPP的抗氧化活性进行了深入研究。结果表面，PPP可以有效促进矿物质离子吸收，并具有较高的抗氧化活性。另一方面，由于卵黄高磷蛋白中磷酸基团过多，反而降低其对蛋白酶的敏感度，导致磷酸肽的得率较低。为了克服这一缺点，在实际生产中，往往需要首先利用碱法对卵黄高磷蛋白进行部分脱磷，以增加其对蛋白酶的敏感度。这一步骤虽然可以提高卵黄高磷蛋白的水解度，但同时也增加了工艺步骤与生产成本。
[0005]鸡胚蛋是指受精鸡蛋孵化至一定天数尚未破壳，可食用的鸡蛋。在鸡蛋蛋黄中，80%的磷与95%的铁集中在卵黄高磷蛋白中。据Romano等人(2004)研究发现，在鸡胚蛋孵化期间，卵黄高磷蛋白会随着孵化时间的增长而逐步降解，为鸡胚发育提供营养与能量。可想而知，在鸡胚蛋孵化期间，该蛋白的构象与磷酸基团含量可能发生变化，以利于胚胎对其吸收利用；另一方面，一些内源性蛋白酶被激活，对该蛋白进行部分脱磷或水解作用，有利于磷酸肽的释放。同时，超高压可以改变蛋白构象，提高酶对底物的催化活性，是一种提高蛋白水解度的常用手段。目前关于这方面的研究，还未见相关报道。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种从鸡胚蛋中制备磷酸肽的方法，相比传统从普通鸡蛋中制备磷酸肽的方法，本发明涉及的方法省去了对卵黄高磷蛋白碱法脱磷的步骤，从而简化工艺、节省成本。同时，本发明包括了全部的工艺步骤和最佳工艺条件，并对最终产品的促进矿物质吸收能力进行了检验。对实际生产具有显著的指导意义。
[0007]本发明的技术方案，一种鸡胚蛋卵黄高磷蛋白磷酸肽的提取方法，步骤如下:
(O受精鸡蛋孵化:精选无损健康的受精鸡蛋，放入孵化箱内进行孵化；待孵化12-15天，取出鸡胚蛋，放入低温环境中结束其生命并保存，以备加工用；
(2)提取卵黄高磷蛋白:对步骤(1)所得鸡胚蛋表面进行消毒，去除蛋壳取出鸡胚胎，将鸡胚胎用组织匀浆机粉碎，并用无菌水稀释，调节PH 3飞，且充分搅拌得匀浆液；之后将匀浆液在3000g条件下离心20min，收集沉淀物，用正己烷和乙醇按3: I的体积比混合后形成的混合液充分脱脂，并过滤；将过滤得到的截留物用NaCl溶液(1-2 M)充分溶解，随后在60°C条件下保持IOmin以去除热不稳定蛋白，之后再次在3000g条件下离心20min,收集上层清液，即得到卵黄高磷蛋白；
(3)酶解卵黄高磷蛋白:将步骤(2)得到的卵黄高磷蛋白用蛋白酶在最适pH条件下进行水解，超高压辅助处理条件为10(Tl50MPa，温度40~43°C，时间l(Tl5min ;之后用5 kDa超滤膜在4°C条件下进行超滤，收集超滤得到小分子组分；
(4)后处理:将步骤(3)所得超滤组分用冷冻干燥机进行冷冻干燥，冷冻干燥压强参数为2(T25pa，温度为-35'30°C，收集冷冻后所得产物，即得鸡胚蛋卵黄高磷蛋白磷酸肽。
[0008]步骤(3)所述水解用蛋白酶为胰蛋白酶、胃蛋白酶、醇酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶中的一种或几种的复合酶。
[0009]本发明的有益效果:
1、相比于现有从普通鸡蛋中制备卵黄高磷蛋白磷酸肽的技术手段，本发明省去了对卵黄高磷蛋白碱法脱磷的步骤，简化了生产工艺，节约了成本；
2、相比于传统的酪蛋白磷酸肽(CPP)，鸡胚来源的卵黄高磷蛋白磷酸肽(PPP)具有更高的促进矿物质吸收的生理活性；
3、本发明方法制备得到的卵黄高磷蛋白磷酸肽，不仅具有促进矿物质吸收的活性，而且具有抗氧化性，可作为多功能肽开发为功能性食品或食品添加剂。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1是不同浓度磷酸肽促进钙吸收的结果。CPP为酪蛋白磷酸肽，PPP为鸡胚蛋卵黄高磷蛋白磷酸肽，DPP为普通鸡蛋卵黄蛋白磷酸肽，下同。
[0011]图2是不同浓度磷酸肽促进铁吸收的结果。
[0012]图3是不同磷酸肽抑制亚油酸氧化的结果。空白为不加磷酸肽的试样。
[0013]图4是本发明工艺流程图。
【具体实施方式】
[0014]实施例1
如图4所示，一种鸡胚蛋卵黄的高磷蛋白磷酸肽的提取方法，步骤如下:
(O受精鸡蛋孵化:精选无损健康的受精鸡蛋，放入孵化箱内进行孵化；待孵化12-15天，取出鸡胚蛋，放入低温环境中结束其生命并保存，以备加工用；
(2)提取卵黄高磷蛋白:对鸡胚蛋表面进行消毒，去除蛋壳取出鸡胚胎，将鸡胚胎用组织匀浆机粉碎，并用无菌水稀释，调节PH 3飞，且充分搅拌；之后将匀浆液在3000g条件下离心20min，收集沉淀物，用正己烷和乙醇按3: I的体积比混合后形成的混合液充分脱脂，并过滤；将过滤得到的截留物用NaCl溶液(1.74 M)溶解，随后在60°C条件下保持10 min以去除热不稳定蛋白，之后再次在3000g条件下离心20min，收集上层清液，即得到卵黄高憐蛋白；
(3)酶解卵黄高磷蛋白:将步骤(2)得到的卵黄高磷蛋白用蛋白酶进行充分水解，同时用超高压机(TFS-2L，Toyo Koatsu公司)予以辅助处理:压力120 MPa，温度42°C，时间12min。之后用5 kDa超滤膜在4°C条件下进行超滤，收集得到小分子组分；
(4)后处理:用Lyph-Lock12 (Labconco公司)冷冻干燥机进行冷冻干燥，冷冻干燥压强参数为2(T25pa，温度为-35'30°C，收集冷冻后所得产物，即得鸡胚蛋卵黄高磷蛋白磷酸肽。
[0015]步骤(3)所述水解用蛋白酶为胰蛋白酶、胃蛋白酶、醇酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶中的一种或几种的复合酶。
[0016]实施例2
对所制备得到的磷酸肽进行促钙吸收、促铁吸收、抑制亚油酸氧化的实验测定。具体实验方法如下:
促钙吸收:不同浓度的磷酸肽溶液(O mg/L、200 mg/L、400 mg/L和600 mg/L)与5mMCaCl2和20mM、500mL磷酸钠缓冲液(pH 8.0)充分混合。在20°C下反应30 min，用NaOH滴定使PH维持在7.8，之后通过原子吸收色谱测定上清液中可溶性钙含量。结果见附图1。
[0017]促铁吸收:不同浓度的磷酸肽溶液(O mg/L、200 mg/L、400 mg/L和600 mg/L)与5mM FeCl2和20禮、50011^磷酸钠缓冲液(pH 8.0)充分混合。在20°C下反应30 min，用NaOH滴定使PH维持在7.8，之后通过原子吸收色谱测定上清液中可溶性铁含量。结果见附图2。
[0018]抗氧化测定:将1.3mg的磷酸肽用磷酸钠缓冲液(pH 7.0, 50mM、IOmL)溶解，之后加入0.13mL的亚油酸溶液(稀释于IOmL的95%乙醇中)，并用无菌水定容至25mL，于40°C下暗处存放。每隔固定时间(24h)，取出100 μ L反应液与4.7mL的乙醇溶液、100 μ L的硫氰酸铵溶液(30%质量分数)、100 μ L的氯化亚铁(20mM溶于3.5%的盐酸)充分混合，静置3min后在500nm波长下测吸光度，吸光度越大说明氧化程度越高。结果见图3。
[0019]从结果可以看出，相比传统方法得到的磷酸肽，本发明方法得到的产品具有更高的促进矿物质吸收的能力，并且具有很高的抗氧化活性。因此，鸡胚蛋来源卵黄高磷蛋白磷酸肽具有巨大的 商业前景，可以加工成为具有促进矿物质吸收的功能性食品，或者作为功能因子添加到功能性食品中。
【权利要求】
1.一种鸡胚蛋卵黄高磷蛋白磷酸肽的提取方法，其特征在于步骤如下: (1)受精鸡蛋孵化:精选无损健康的受精鸡蛋，放入孵化箱内进行孵化；待孵化12-15天，取出鸡胚蛋，放入低温环境中结束其生命并保存，以备加工用； (2)提取卵黄高磷蛋白:对步骤(1)所得鸡胚蛋表面进行消毒，去除蛋壳取出鸡胚胎，将鸡胚胎用组织匀浆机粉碎，并用无菌水稀释，调节PH 3飞，且充分搅拌得匀浆液；之后将匀浆液在3000g条件下离心20min，收集沉淀物，用正己烷和乙醇按3: I的体积比混合后形成的混合液充分脱脂，并过滤；将过滤得到的截留物用1-2 M的NaCl溶液充分溶解，随后在60°C条件下保持10 min以去除热不稳定蛋白，之后再次在3000g条件下离心20min,收集上层清液，即得到卵黄高磷蛋白； (3)酶解卵黄高磷蛋白:将步骤(2)得到的卵黄高磷蛋白用蛋白酶在最适pH条件下进行水解，并辅以超高压辅助处理条件为10(Tl50MPa，温度4(T43°C，时间l(Tl5min ;之后用5kDa的超滤膜在4°C下进行超滤，收集超滤得到小分子组分； (4)后处理:将步骤(3)所得超滤组分用冷冻干燥机进行冷冻干燥，冷冻干燥压强参数为2(T25pa，温度为-35'30°C，收集冷冻后所得产物，即得鸡胚蛋卵黄高磷蛋白磷酸肽。
2.根据权利要求1所述鸡胚蛋卵黄高磷蛋白磷酸肽的提取方法，其特征在于:步骤(3)所述水解用蛋白酶为胰蛋白酶、胃蛋白酶、醇酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶中的一种或几种的复合酶。
【文档编号】C07K1/36GK103952456SQ201410162051
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年4月22日 优先权日:2014年4月22日
【发明者】徐学明, 段翔, 杨哪, 吴凤凤, 金征宇, 周星, 田耀旗, 焦爱权, 王金鹏, 赵建伟 申请人:江南大学