抗bst2抗体的制作方法
【专利摘要】以BST2抗体与人BST2抗原的各种剪接变体的结合性为指标来选择BST2抗体。其结果，成功得到了BST2抗体，该抗体特异性识别据报道在癌细胞中高度表达的BST2D。本发明的抗体与BST2D表达细胞进行特异性结合。通过在治疗中使用本发明的抗体，可以防止导致血中抗体浓度降低的、与靶组织以外的非特异性结合。或者，根据本发明的抗体，提供特异性检测BST2D表达组织的诊断药。
【专利说明】抗BST2抗体
[0001]本申请是国际申请日为2008年10月16日、国际申请号为PCT/JP2008/068794、进入国家阶段的申请号为200880122043.X、发明名称为“抗BST2抗体”的PCT申请的分案申请。
【技术领域】
[0002]本发明涉及与人BST2抗原结合的抗体及其用途。
【背景技术】
[0003]已知BST2是在以骨髓瘤为代表的各种癌细胞中高度表达的跨膜糖蛋白(非专利文献I~4)。迄今为止，有人报道了 BST2抗原中存在多种剪接变体(专利文献1、专利文献5)。有报道称:在这些变体中，BST2D在肿瘤中高度表达(非专利文献I)。更进一步已知:抗BST2单克隆抗体通过与在细胞表面表达的BST2(分子种相当于BST2D)结合，对该细胞具有细胞毒性(非专利文献2)。于是，应用该原理，人们尝试着开发以体内的肿瘤细胞为靶向的抗肿瘤药。例如，在人骨髓瘤细胞移植小鼠模型中得到了可以期待肿瘤的缩小或治愈的优异的抗肿瘤效果(非专利文献3、4)。
[0004]专利文献1:W01999/043803
[0005]专利文献2:W01998/035698
[0006]专利文献3:W02002/064159
[0007]专利文献4:W02005/034994
[0008]专利文献5:W02006/008886
[0009]专利文献6:TO2006/013923
[0010]非专利文献1:Goto Τ.等人，Blood84(6): 1922-30，1994
[0011]非专利文献2:Ohtomo T.等人.B1chem B1phys Res Commun ；258 (3):583-91,1999
[0012]非专利文献3:0zaki S.等人.Blood90 (8):3179-86,1997
[0013]非专利文献4:Koishihara Y.等人.Blood92 (s):107,1998
【发明内容】
[0014]发明所要解决的课题
[0015]迄今为止，有人报道了:人BST2抗原中存在以下几种剪接变体。
[0016]
核苷酸序列氨基酸序列氨基酸序列的长度
人 BST2D SEQID NO:1SEQ ID NO: 2 (180)
人 BST2H SEQ ID NO: 20 SEQ ID NO: 21 (158)
人 BST2HS SEQ ID NO: 22 SEQ ID NO: 23 (100)[0017]在这些剪接变体中，有人报道了尝试着将识别人BST2D的抗体用于治疗骨髓瘤等部分肿瘤。例如，作为抗BST2单克隆抗体的“HM1.24抗体”是确认对骨髓瘤具有疗效的代表性的单克隆抗体。“HM1.24抗体”是以人骨髓瘤细胞作为免疫原而建立的单克隆抗体。通过之后的表位分析，确认“HM1.24抗体”识别SEQ ID NO:2所示的人BST2D的氨基酸序列号116~127(SEQIDN0:24)。然而该区由与人BST2H共通的氨基酸序列构成(图1)。
[0018]具有这样的抗原识别特性的抗体可能还与表达BST2H的细胞或组织结合。即，例如在诊断中除了检测表达人BST2D的肿瘤外，可能还要检测表达BST2H的细胞。或者，在治疗中由于抗体还与表达BST2H的细胞结合，所以血中的抗体浓度有可能容易降低。本发明将解决该课题。即，本发明的课题在于提供:与人BST2D特异性结合的抗体及其用途。
_9] 解决课题的方法
[0020]本发明人等考虑:将HMl.24抗体给予人时，通过使其非特异性地吸附在人体内的肿瘤外组织上来降低血中的HMl.24抗体浓度，尝试着找出识别HMl.24抗体所识别的表位以外的序列的抗体，并进行了深入研究，从而完成了本发明。
[0021 ] 即，本发明人等以BST2抗体与人BST2抗原的各种剪接变体的结合性为指标来选择BST2抗体，抑制其与治疗及诊断目标外组织的非特异性吸附，成功得到了特异性的抗BST2抗体。通过使用该抗体来防止给药后血中浓度的降低，可以期待着以少于以往的抗体给药量得到目标治疗效果、或者得到能够可以有效预测该治疗效果的诊断的效果。
[0022]即，本发明涉及下述抗人BST2抗体、其制备方法以及其用途。 [0023][I]抗人BST2抗体或包含其抗原结合区的片段，所述抗人BST2抗体的特征在于:与人BST2D抗原结合、且实质上不与人BST2H抗原结合。
[0024][2] [I]所述的抗体或包含其抗原结合区的片段，该抗体的特征在于:识别包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的多肽。
[0025][3]抗体或包含其抗原结合区的片段，所述抗体是以具有SEQ ID NO:3中的全部或至少5个以上连续的氨基酸序列的肽作为免疫原而制作的。
[0026][4]抗体或包含其抗原结合区的片段，所述抗体与[I]~[3]中任一项所述的抗体所结合的BST2D蛋白的表位相同的表位相结合。
[0027][5] [I]~[4]中任一项所述的抗体、或包含其抗原结合区的片段，所述抗体为单克隆抗体。
[0028][6]单克隆抗体或包含其抗原结合区的片段，所述单克隆抗体是由以保藏号FERMAP-21303保藏的杂交瘤BST2#4LD产生的。
[0029][7] [I]所述的抗体或包含其抗原结合区的片段，其中在重链可变区和轻链可变区中含有下述氨基酸序列作为⑶R1、⑶R2和⑶R3:
[0030]重链可变区的CDRl:SGYYffN(SEQ ID NO:4)；
[0031]重链可变区的CDR2:YISYDGSNNYNPSLKNR(SEQ ID NO:5)；以及
[0032]重链可变区的CDR3:1LGRGY (SEQ ID NO:6)；
[0033]轻链可变区的CDRl:RASQSVSTSSYSYMH(SEQ ID NO:7)；
[0034]轻链可变区的CDR2:YASNLES (SEQ ID NO:8)；以及
[0035]轻链可变区的CDR3 =QHSffFIPYT (SEQ ID NO:9)。
[0036][8] [I]所述的抗体或包含其抗原结合区的片段，该抗体包含下述氨基酸序列作为重链可变区和轻链可变区:
[0037]SEQ ID NO: 11的重链可变区和SEQ ID NO:13的轻链可变区。
[0038][9]抗体或包含其抗原结合区的片段，所述抗体是在下述(A)或(B)任一项所述的抗体中I个或多个氨基酸被取代、缺失、添加和/或插入的抗体，该抗体与(A)或(B)中任一项所述的抗体具有同等的活性；
[0039](A)抗体，该抗体在重链可变区和轻链可变区中包含下述氨基酸序列作为⑶R1、CDR2 和 CDR3:
[0040]重链可变区的CDRl:SGYYffN(SEQ ID NO:4)；
[0041]重链可变区的CDR2:YISYDGSNNYNPSLKNR(SEQ ID NO:5)；以及
[0042]重链可变区的CDR3:1LGRGY (SEQ ID NO:6)；
[0043]轻链可变区的 CDRl:RASQSVSTSSYSYMH(SEQ ID NO:7)；
[0044]轻链可变区的CDR2:YASNLES (SEQ ID NO:8)；以及
[0045]轻链可变区的CDR3 =QHSffEIPYT (SEQ ID NO:9);或
[0046](B)抗体，该抗体包含下述氨基酸序列作为重链可变区和轻链可变区:
[0047]SEQ ID NO: 11的重链可变区和SEQ ID NO:13的轻链可变区。
[0048][10]抗体或包含其抗原结合区的片段，该抗体与[7]~[9]中任一项所述的抗体所结合的BST2D蛋白的表位相同的表位相结合。
[0049][11] [7]~[10]中任一项所述的抗体或包含其抗原结合区的片段，该抗体为单克隆抗体。
[0050][12] [I]~[11]中任一项所述的抗体或包含其抗原结合区的片段，该抗体的特征在于:对在细胞表面表达人BST2D抗原的细胞具有CDC活性。
[0051][13] [I]~[11]中任一项所述的抗体或包含其抗原结合区的片段，该抗体的特征在于:对在细胞表面表达人BST2D抗原的细胞具有ADCC活性。
[0052][14]多核苷酸，该多核苷酸编码[7]~[9]中任一项所述的抗体、或包含其抗原结合区的片段。
[0053][15]载体，该载体包含编码[7]~[9]中任一项所述的抗体或包含其抗原结合区的片段的多核苷酸。
[0054][16]转化细胞,该转化细胞保持能够表达[15]所述的载体。
[0055][17] [7]~[9]中任一项所述的抗体或包含其抗原结合区的片段的制备方法，该制备方法包括以下步骤:培养[16]所述的转化细胞，之后从其培养物中回收抗体或包含其抗原结合区的片段。
[0056][18]杂交瘤，该杂交瘤产生[I]~[5]中任一项所述的抗体。
[0057][19]杂交瘤BST2#4LD，其以保藏号FERMAP-21303进行保藏。
[0058][20]抗体的制备方法，该方法包括以下步骤:培养[19]所述的杂交瘤，之后从培养物中采集抗体。
[0059][21]抗人BST2D特异性抗体的制备方法，该方法包括以下步骤:
[0060](I)使抗人BST2D抗体与人BST2H和/或人BST2HS接触的步骤；以及
[0061](2)回收具有下述i和/或ii的反应特性的抗人BST2D抗体作为抗人BST2D特异性抗体的步骤；[0062]1.不与人BST2H结合的抗体；以及
[0063]ii不与人BST2HS结合的抗体。
[0064][22]抗人BST2D特异性抗体的制备方法，该方法包括以下步骤:
[0065](I)用肽免疫非人动物的步骤，所述肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列、或选自SEQID NO:3的氨基酸序列的至少5个以上连续的氨基酸序列；以及
[0066](2)从(I)的非人动物中回收抗体，或者回收抗体产生细胞、再回收该抗体产生细胞所产生的抗体的步骤。
[0067][23]治疗药，其为由表达人BST2D抗原的组织增殖而引起的疾病的治疗药，该治疗药含有[I]~[13]中任一项所述的抗体、或包含其抗原结合区的片段作为有效成分。
[0068][24]治疗药，其为表达人BST2D抗原的肿瘤的治疗药，该治疗药含有[I]~[13]中任一项所述的抗体或包含其抗原结合区的片段作为有效成分。
[0069][25] [24]所述的治疗药，其特征在于:肿瘤是源自骨髓细胞的肿瘤。
[0070][26] [25]所述的治疗药，其特征在于:源自骨髓细胞的肿瘤为骨髓瘤。
[0071][27] [26]所述的治疗药，其特征在于:骨髓瘤为多发性骨髓瘤。
[0072][28]检测表达人BST2D抗原的组织的诊断药，该诊断药含有[I]~[13]中任一项所述的抗体或包含其抗原 结合区的片段。
[0073][29]用于检测表达人BST2D抗原的肿瘤的诊断药，该诊断药含有[I]~[13]中任一项所述的抗体或包含其抗原结合区的片段。
[0074][30] [29]所述的诊断药，其特征在于:肿瘤是源自骨髓细胞的肿瘤。
[0075][31] [30]所述的诊断药，其特征在于:源自骨髓细胞的肿瘤为骨髓瘤。
[0076][32] [31]所述的诊断药，其特征在于:骨髓瘤为多发性骨髓瘤。
[0077][33]表达人BST2D抗原的肿瘤的治疗方法，该治疗方法包括:给予[I]~[13]中任一项所述的抗体或包含其抗原结合区的片段的步骤。
[0078][34] [I]~[13]中任一项所述的抗体或包含其抗原结合区的片段在制备用于治疗表达人BST2D抗原的肿瘤的药物组合物中的应用。
[0079]或者，本发明涉及[I]~[13]中任一项所述的抗体或包含其抗原结合区的片段在治疗表达人BST2D抗原的肿瘤中的应用。本发明还涉及[I]~[13]中任一项所述的抗体或包含其抗原结合区的片段在制备用于治疗表达人BST2D抗原的肿瘤的药物组合物中的应用。本发明还提供用于治疗表达人BST2D抗原的肿瘤的方法，该方法包括:对患者给予[I]~[13]中任一项所述的抗体或包含其抗原结合区的片段的步骤。
[0080]本发明还涉及[I]~[13]中任一项所述的抗体或包含其抗原结合区的片段在诊断表达人BST2D抗原的肿瘤中的应用。或者，本发明涉及[I]~[13]中任一项所述的抗体或包含其抗原结合区的片段在制备用于诊断表达人BST2D抗原的肿瘤的诊断药中的应用。本发明还提供用于在体内检测表达人BST2D抗原的肿瘤的方法，该方法包括:对患者给予[I]~[13]中任一项所述的抗体或包含其抗原结合区的片段的步骤。
[0081 ] 此外，本发明还提供用于治疗表达人BST2D抗原的肿瘤的药物组合物的制备方法，该方法包括将[I]~[13]中任一项所述的抗体或包含其抗原结合区的片段与药学上可接受的载体混合的步骤。或者，本发明涉及用于在体内检测表达人BST2D抗原的肿瘤的诊断药的制备方法，该方法包括:将[I]~[13]中任一项所述的抗体或包含其抗原结合区的片段与药学上可接受的载体混合的步骤。
[0082]发明效果
[0083]通过本发明提供抗人BST2D特异性抗体。本发明的抗体与人BST2的多个变体中表达人BST2D的细胞进行特异性结合。已知人体内有BST2H等剪接变体，但本发明的抗体实质上不与人BST2H表达细胞结合。因此，通过在治疗中使用本发明的抗体，可以以更少量的抗体达到治疗效果。或者，在诊断中使用本发明的抗体时，可以进一步特异性检测骨髓瘤等BST2D表达细胞。
【专利附图】
【附图说明】
[0084]图1是显示BST2的剪接变体蛋白结构的图。
[0085]图2是显示人BST2抗体的特异性研究结果的图，所述特异性研究包括:制作强制表达人BST2蛋白的剪接变体BST2(D)和BST2 (H)的CHO细胞株，利用流式细胞术测定HMl.24、小鼠#4LD、小鼠#19LD抗体的结合。
[0086]图3是显示HMl.24、小鼠#4LD抗体对BST2表达细胞的⑶C活性的测定结果的图。测定CDC活性时使用BST2 (D) -CH0、BST2 (H) -CH0、来自人骨髓瘤的RPMI8226。添加兔补体，在抗体浓度为0.01-10 μ g/mL下于37°C培养2小时，之后测定释放到培养液中的LDH量，作为细胞毒性(% )o
[0087]图4是显示HMl.24、小鼠#4LD、嵌合#4LD、小鼠#19LD抗体对BST2表达细胞的ADCC活性的测定结果的图。测定ADCC活性时，靶细胞使用BST2(D)-CH0和RPMI8226细胞。以人PBMC作为效应细胞，测定在E/Τ比为12.5-100之间作为细胞杀伤的结果渗漏到上清中的LDH量，以此作为ADCC活性)。加入人源化抗体HMl.24(AHM抗体)以进行比较。
[0088]图5是显示将人脾脏组织的冻结切片用#4LD抗体或#19LD抗体进行免疫染色时组织染色图像的照片。
[0089]图6是显示用#4LD抗体(上)或抗His tag抗体(下)检测带有His tag的重组人BST2蛋白的蛋白质印迹法的结果的照片。
[0090]图7是显示在移植了 RPMI8226细胞株的小鼠模型中给予4LD时肿瘤体积的变化的图。箭头表示给予抗体。使用最终测定日的肿瘤体积，通过Dunnett型多重比较法进行统计分析。**:P < 0.005，*:P < 0.05。
[0091]图8是显示在移植了 ARH77细胞株的小鼠模型中给予4LD时的生存期间的图。通过Kaplan-Meier法1grank检验进行统计分析。*:P < 0.05。
【具体实施方式】
[0092] 迄今为止已报道的人BST2抗原的剪接变体的例子见图1。各变体的氨基酸序列分别见以下各SEQ ID NO。
[0093]
【权利要求】
1.与人BST2D抗原结合、且实质上不与人BST2H抗原结合的抗人BST2抗体或包含其抗原结合区的片段，其中所述抗体识别由SEQ ID NO:37的氨基酸序列组成的多肽。
2.与人BST2D抗原结合、且实质上不与人BST2H抗原结合的抗人BST2抗体或包含其抗原结合区的片段，其中所述抗体是利用由SEQ ID NO:37的氨基酸序列组成的肽作为免疫原而制备的。
3.抗体或包含其抗原结合区的片段，其中所述抗体与权利要求1或2所述的抗体所结合的BST2D蛋白的表位相同的表位相结合。
4.权利要求1或2所述的抗体或包含其抗原结合区的片段，其中所述抗体为单克隆抗体。
5.抗体或包含其抗原结合区的片段，其中所述抗体与权利要求1或2所述的抗体所结合的BST2D蛋白的表位相同的表位相结合。
6.权利要求1所述的抗体或包含其抗原结合区的片段，其中所述抗体对在细胞表面表达人BST2D抗原的细胞具有⑶C活性。
7.权利要求1所述的抗体或包含其抗原结合区的片段，其中所述抗体对在细胞表面表达人BST2D抗原的细胞具有ADCC活性。
8.杂交瘤,所述杂交瘤产生权利要求4所述的抗体。
9.权利要求1所述的抗人BST2D特异性抗体的制备方法，所述制备方法包括以下步骤: (1)使抗人BST2D抗体与人BST2H和/或人BST2HS接触；以及 (2)回收具有下述反应特异性(i)和/或(ii)的抗人BST2D抗体作为抗人BST2D特异性抗体； (i).不与人BST2H结合；以及 (ii).不与人BST2HS结合。
10.权利要求1所述的抗人BST2D特异性抗体的制备方法，所述制备方法包括以下步骤: (1)用肽免疫非人动物，所述肽由SEQID NO:3的氨基酸序列或SEQ ID NO:37的氨基酸序列组成；以及 (2)从(I)的非人动物中回收抗体，或者回收抗体产生细胞、再回收来自所述抗体产生细胞的抗体。
11.治疗药，其用于由表达人BST2D抗原的组织增殖而引起的疾病，所述治疗药含有权利要求I所述的抗体或包含其抗原结合区的片段作为有效成分。
12.治疗药，其用于表达人BST2D抗原的肿瘤，所述治疗药含有权利要求1所述的抗体或包含其抗原结合区的片段作为有效成分。
13.权利要求12所述的治疗药，其特征在于:肿瘤源自骨髓细胞。
14.权利要求13所述的治疗药，其特征在于:源自骨髓细胞的肿瘤为骨髓瘤。
15.权利要求14所述的治疗药，其特征在于:骨髓瘤为多发性骨髓瘤。
16.检测表达人BST2D抗原的组织的诊断药，所述诊断药含有权利要求1所述的抗体或包含其抗原结合区的片段。
17.用于检测表达人BST2D抗原的肿瘤的诊断药，所述诊断药含有权利要求1所述的抗体或包含其抗原结合区的片段。
18.权利要求17所述的诊断药，其特征在于:肿瘤源自骨髓细胞。
19.权利要求18所述的诊断药，其特征在于:源自骨髓细胞的肿瘤为骨髓瘤。
20.权利 要求19所述的诊断药，其特征在于:骨髓瘤为多发性骨髓瘤。
21.权利要求1所述的抗体或包含其抗原结合区的片段在制备用于治疗表达人BST2D抗原的肿瘤的药物组合物中的应用。
【文档编号】C07K16/30GK104031150SQ201410162825
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2008年10月16日 优先权日:2007年10月16日
【发明者】鸭川由美子, 并木佐穗理, 赵民权, 石田晃司 申请人:Sbi生物技术有限公司