一种重组人角质细胞生长因子-2突变体的活性稳定剂的制作方法
【专利摘要】本发明公开了属于生物【技术领域】的一种重组人角质细胞生长因子-2突变体(rhKGF-2M)的活性稳定剂。本发明通过对保护剂的组合方式进行筛选，将乳糖、右旋糖酐40和甘氨酸作为保护剂，将其溶于缓冲溶液中得到rhKGF-2M的活性稳定剂。将rhKGF-2M加入到活性稳定剂中，冻干后即可得到稳定的rhKGF-2M活性组合物，在18个月内仍维持98％以上的初始活性。本发明的活性稳定剂能增加rhKGF-2M的稳定性并长时间保持其生物学活性，为rhKGF-2M的后续应用奠定了基础。
【专利说明】一种重组人角质细胞生长因子-2突变体的活性稳定剂
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种重组人角质细胞生长因子-2突变体的活性稳定剂。
【背景技术】
[0002]角质细胞生长因子2(KGF_2)也叫成纤维细胞生长因子_10 (FGF-10)，是FGFs家族中角质细胞生长因子(keratinocyte growth factors,KGFs)亚家族的一员。KGFs亚家族目前只有两个成员，即KGF(FGF-7)和KGF-2，它们的蛋白序列及结构相似性高，而且都能与上皮细胞表面的受体FGFR2IIIb特异性结合，并促进上皮细胞的生长、增殖和分化。其中KGF因对放化疗引起的黏膜损伤有非常好的保护作用已经在2004年被美国FDA批准上市，而KGF-2同样也进入到临床试验阶段。
[0003]KGF-2能够参与血管生成、机体的损伤反应和修复、细胞的分化和迁移等众多过程。动物实验已表明，KGF-2在促进皮肤创口愈合，以及预防化疗和放疗过程引起的黏膜炎、治疗溃疡和肠炎等方面疗效显著。另外，KGF-2能降低辐射引起的局灶性肺炎和肺纤维化程度，还能够保护毛囊干细胞，减少辐射造成的脱发。另外，KGF-2由于其受体的特异性，使它只具有黏膜损伤保护作用，却没有潜在的副作用。Alderson等对人的乳腺痛、卵巢癌、肺癌等30种癌细胞系进行的体内外实验结果发现KGF-2并不促进这些肿瘤细胞生长，表明KGF-2只选择性作用于正常上皮细胞而不促进肿瘤细胞的增殖，同时也不影响肿瘤细胞对放疗的敏感性。
[0004]鉴于KGF-2在黏膜损伤防护及治疗方面的独特功效，目前已成为国内外医药领域的研究热点。美国的人类基因组科学公司(Human Genome Sciences, Inc.)曾经开展多年的KGF-2的相关研究，除临床前试验外，该公司已经完成I期临床研究，证明了其安全性，另外针对三个适应症进行了 II期临床试验，一是静脉溃疡，二是骨髓移植前高剂量放化疗引起的黏膜损伤修复，二是溃瘍性大肠炎。
[0005]我们在前期的研究中，系统地研究了 KGF-2的结构与功能关系，通过生物信息学和基因定点突变技术对KGF-2改构，构建并筛选获得了高活性KGF-2突变体，已经申请国家发明专利并获得授权(国家发明专利授权号:ZL200410034009.0)。
[0006]在此基础上我们建立并优化了重组人KGF-2突变体(recombinant humankeratinocyte growth factor2mutant,简称rhKGF_2M)的制备与纯化工艺，实现了高效可溶性表达，初步药效学研究表明其对放射性黏膜损伤有显著的治疗作用，因此是一个很有前景的放射防护和治疗药物。但是该突变体的稳定性较差，不易长期保存，因此需要添加活性稳定剂来保存该制品。如果没有合适的活性稳定剂来增强其稳定性并且保持其活性，将严重影响将来的临床应用。目前尚无明确的用于KGF-2突变体的活性稳定剂配方。
[0007]参考其他生长因子类药物，目前常用的蛋白保护剂如人血白蛋白或者牛血清白蛋白因为属于血液来 源，有潜在的感染其它血源性疾病的风险，故本制品不做优先考虑；而非血液来源的甘露醇-蔗糖-柠檬酸缓冲体系则不能很好的维持本生物制品的活性，因此我们通过对缓冲体系、保护剂和其它添加剂等进行组合分析，筛选得到最佳的活性稳定剂。
【发明内容】
[0008]本发明的目的就是提供一种重组人角质细胞生长因子-2突变体(recombinanthuman keratinocyte growth factor2mutant,简称 rhKGF_2M)的活性稳定剂，该剂型可以增强rhKGF-2M的稳定性并保持其生物学活性。
[0009]为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案:
[0010]一种rhKGF_2M的活性稳定剂，由缓冲盐溶液和保护剂组成；上述缓冲盐溶液的pH为6.0-8.0 ;上述保护剂由乳糖、右旋糖酐40和甘氨酸组成；在活性稳定剂中，乳糖的浓度为Iwt % -2wt%，右旋糖酐40的浓度为3wt% _4wt%，甘氨酸的浓度为20_50mM。
[0011]一种优选的rhKGF-2M的活性稳定剂，在活性稳定剂中，乳糖的浓度为lwt%，右旋糖酐40的浓度为3wt%，甘氨酸的浓度为20mM。
[0012]上述缓冲盐溶液为柠檬酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲液。
[0013]其中，磷酸盐缓冲液的配方如下:磷酸氢二钠:2.5-19.0mM ;磷酸二氢钠:
1.0-17.5mM ；EDTA:l-5mM ；NaCl:10-150mM ；pH6.0-8.0。
[0014]进一步优选的磷酸盐缓冲液的配方如下:磷酸氢二钠:15.4mM ;磷酸二氢钠:4.6mM ；EDTA:2mM ；NaCl:1OOmM ；pH7.3。
[0015]本发明还提供一种rhKGF_2M的活性稳定剂的制备方法，其步骤如下:首先根据上述配方，配置缓冲液；然后将乳糖、右旋糖酐40和甘氨酸溶解于缓冲液中，得到重组人角质细胞生长因子-2突变体的活性稳定剂；在活性稳定剂中，乳糖的终浓度为lwt% -2wt%，右旋糖酐40的终浓度为3wt% -4wt%，甘氨酸的终浓度为20-50mM。
[0016]进一步优选的制备方法，步骤如下:配制20mM pH为7.3的磷酸盐缓冲液，其配方如下:磷酸氢二钠:15.4mM ;磷酸二氢钠:4.6mM ；EDTA:2mM ；NaCl:100mM ;然后将乳糖、右旋糖酐40和甘氨酸溶解于缓冲液中，得到重组人角质细胞生长因子-2突变体的活性稳定剂；在活性稳定剂中，乳糖的浓度为Iwt %，右旋糖酐40的浓度为3wt%，甘氨酸的浓度为20mM。
[0017]本发明还提供一种包含rhKGF_2M的活性组合物，在上述活性稳定剂中添加rhKGF-2M，冻干后得到包含rhKGF_2M的活性组合物。
[0018]其中，在活性稳定剂中添加rhKGF-2M至其终浓度为2_5mg/ml。
[0019]若有rhKGF_2M粉末，可以直接将其加入到活性稳定剂中。而通常制备得到的rhKGF-2M存在于缓冲液中，针对rhKGF_2M的溶液存在形式，rhKGF_2M的活性组合物按如下方法得到:
[0020](I)配置缓冲盐溶液，将乳糖、右旋糖酐40和甘氨酸溶解于其中，使乳糖、右旋糖酐40和甘氨酸的终浓度为所述活性稳定剂中各浓度的N倍，得到NX活性稳定剂；
[0021](2)配置与步骤(1)中一致的缓冲盐溶液，使重组人角质细胞生长因子-2突变体溶于其中，得到重组人角质细胞生长因子-2突变体溶液； [0022](3)将重组人角质细胞生长因子-2突变体溶液与NX活性稳定剂按(N-1):1的体积比混合，使重组人角质细胞生长因子-2突变体的终浓度为2-5mg/ml，冻干。
[0023]步骤(1)中的N优选为2，2X活性稳定剂的具体配置方法如下:配置缓冲液溶液，如20mM pH为6.0-8.0的磷酸盐缓冲液，其配方如下:磷酸氢二钠:2.5-19.0mM ;磷酸二氢钠:1.0-17.5mM ；EDTA:l-5mM ；NaCl:10-150mM ;然后将乳糖、右旋糖酐40和甘氨酸溶解于缓冲液中，乳糖的终浓度为2wt% -4wt%，右旋糖酐40的终浓度为6wt% _8wt%，甘氨酸的终浓度为40-100mM，得到2X活性稳定剂。
[0024]在进行后续冻干时，将加入rhKGF_2M的活性稳定剂分装，如每瓶分装2_5ml，按常规方法进行冻干处理，即可以得到每瓶约IOmg的rhKGF-2M的活性组合物。
[0025]本发明的有益效果为:本发明通过筛选缓冲液与保护剂的组合，得到一种重组人角质细胞生长因子-2突变体(rhKGF-2M)的活性稳定剂，其可以在18个月内仍保持98%以上的活性。本发明的活性稳定剂能增加rhKGF-2M的稳定性并长时间保持其生物学活性，为rhKGF-2M的后续应用奠定了基础。
【具体实施方式】
[0026]下面结合具体实施例进一步说明本发明:
[0027]实施例1
[0028]将保护剂乳糖、右旋糖酐40和甘氨酸溶于不同的缓冲液体系中，溶解后乳糖、右旋糖酐40和甘氨酸的浓度分别均为1被％、3被(％和201111，然后将^11---21溶于其中。在2-8°C环境下放置2周后，测定其生物学活性，结果如表1所示。磷酸盐缓冲液和保护剂合用具有最佳的稳定效果，处理后的rhKGF-2M的仍有98%的初始活性；柠檬酸盐缓冲液和保护剂合并的效果次之，但处理后的rhKGF-2M的仍有92%以上的初始活性。
[0029]表1不同缓冲体系与保护剂的组合对稳定效果的影响
【权利要求】
1.一种重组人角质细胞生长因子-2突变体的活性稳定剂，其特征在于，由缓冲盐溶液和保护剂组成；所述缓冲盐溶液的PH为6.0-8.0 ;所述保护剂由乳糖、右旋糖酐40和甘氨酸组成；在活性稳定剂中，乳糖的浓度为1wt % -2wt%，右旋糖酐40的浓度为3wt% -4wt%,甘氨酸的浓度为20_50mM。
2.根据权利要求1所述的重组人角质细胞生长因子-2突变体的活性稳定剂，其特征在于，在所述活性稳定剂中，乳糖的浓度为lwt%，右旋糖酐40的浓度为3wt%，甘氨酸的浓度为 20mM。
3.根据权利要求1所述的重组人角质细胞生长因子-2突变体的活性稳定剂，其特征在于，所述缓冲盐溶液为柠檬酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲液。
4.根据权利要求3所述的重组人角质细胞生长因子-2突变体的活性稳定剂，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液的配方如下:磷酸氢二钠:2.5-19.0mM ;磷酸二氢钠:1.0-17.5mM ；EDTA:l-5mM ；NaC l:10-150mM ；pH6.0-8.0。
5.根据权利要求3所述的重组人角质细胞生长因子-2突变体的活性稳定剂，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液的配方如下:磷酸氢二钠:15.4mM ;磷酸二氢钠:4.6mM ；EDTA:2mM ；NaCl:1OOmM ；pH7.3。
6.一种包含重组人角质细胞生长因子-2突变体的活性组合物，其特征在于，在权利要求I中所述的活性稳定剂中添加重组人角质细胞生长因子-2突变体，冻干后得到所述活性组合物。
7.根据权利要求6所述的活性组合物，其特征在于，在所述活性稳定剂中添加重组人角质细胞生长因子-2突变体至其终浓度为2-5mg/ml。
【文档编号】C07K14/50GK103923208SQ201410166013
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2014年4月23日 优先权日:2014年4月23日
【发明者】陈惠华, 邹民吉, 徐东刚, 徐涛 申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所