抗氯霉素和克伦特罗的双特异性单克隆抗体及其制备方法
【专利摘要】抗氯霉素和克伦特罗的双特异性单克隆抗体及其制备方法，属于生物【技术领域】。该双特异性单克隆抗体对氯霉素和克伦特罗同时具有特异性。该单克隆抗体制备方法如下：合成氯霉素和克伦特罗的半抗原和人工抗原；利用氯霉素人工抗原制备分泌抗氯霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株；利用克伦特罗人工抗原制备分泌抗克伦特罗单克隆抗体的杂交瘤细胞株；抗氯霉素的杂交瘤细胞株和抗克伦特罗的杂交瘤细胞株细胞融合后筛选得到四体杂交瘤细胞，四体杂交瘤细胞分泌抗氯霉素和克伦特罗的双特异性单克隆抗体。本发明的双特异性单克隆抗体性状稳定、检测灵敏度高、能大量生产，并用这个抗体建立了ELISA分析方法，为氯霉素和克伦特罗的快速检测提供技术基础。
【专利说明】抗氯霉素和克伦特罗的双特异性单克隆抗体及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种抗氯霉素和克伦特罗的双特异性单克隆抗体及其制备方法。
【背景技术】
[0002]免疫分析法(Immunoassay, IA)起始于20世纪50年代，首先应用于体液大分子物质的分析，I960年，美国学者Yalow和Berson等将放射性同位素示踪技术和免疫反应结合起来测定糖尿病人血浆中的胰岛素浓度，创立了放射免疫分析技术。1968年，Oliver将地高辛同牛血清白蛋白结合，使之成为人工抗原，免疫动物后成功获得了抗地高辛抗体，从而开辟了用免疫分析法测定小分子药物的新领域。在RIA的基础上，随着新的标记物质的发现及新的标记方法的使用，以及电子计算机、自动控制技术的广泛应用，派生出许多新的检测技术，使免疫分析法逐渐发展成为一门新型的独立学科。
[0003]由于免疫分析试剂在免疫反应中所体现出的独特的选择性和极低的检测限，使这种分析手段在临床、生物制药和环境化学等领域得到广泛应用。各种标记技术(放射性标记、酶标记、荧光标记、金标记、化学发光等)的发展，使免疫分析的选择性更加突出。标记免疫分析一般是将酶、荧光素、放射性核素等标记物对抗体或抗原进行标记，这种标记物既保持了抗体或抗原的活性，也不影响标记物的活性，当它与相应抗体或抗原反应后，可以直接测定复合物中的标记物，从而直接对目标物质进行定量分析。通过标记物的信号放大作用，可以提高免疫分析技术的敏感性。免疫学检测技术以其特异性强、灵敏度高、方便快捷、分析容量大、检测成本 低、安全可靠等优点，已成为21世纪最具竞争性和挑战性的检测分析技术。
[0004]目前采用免疫分析方法进行多残留检测常有两种方法，一种是采用一类药物的共有结构作为免疫半抗原，获得对同类药物具有特异性识别反应的广谱抗体。另一种是采用将多个药物的半抗原偶联到载体蛋白上制备成人工抗原，经过动物免疫获得对目标农药有特异性识别的“宽谱特异性抗体(broad specificity antibody)”,达到多残留检测的目的。抗体在多残留免疫分析中的作用非常关键，抗体质量的好坏直接影响免疫分析的准确性和灵敏度，因此获得好的抗体是多残留免疫分析技术的首要工作，已报道的药物多残留免疫检测的抗体均为多克隆抗体，由于多克隆抗体会随着动物种类及个体差异而有变化，生产数量上也会受到一定的限制，制备的抗体可重复性差，在应用中会受到一定的限制，随着单克隆抗体技术的出现，解决了抗体制备过程中抗体性状不稳定的问题，并且单克隆抗体技术获得的杂交瘤细胞在体外能无限量分泌性状稳定的抗体，因此，在小分子药物免疫分析中单克隆抗体已逐渐取代多克隆抗体。
[0005]传统的免疫快速诊断技术中使用的抗体不论是多克隆抗体还是普通单克隆抗体，一个抗体分子均只识别一种或者一类抗原，使检测范围受到很大的限制，随着单克隆杂交瘤技术的发展和不断完善，Milstein等首次报道了一株能分泌双特异性单克隆抗体(Bispecific Monoclonal Antibodies, BisMcAb)的杂交-杂交瘤(Hybrid Hybridomas)细胞，标志着双特异性单克隆抗体技术的创立。双特异性单克隆抗体是结构上双价，功能上单价的免疫球蛋白分子。其基本结构中两个Fab端的结构和功能不相同，能分别结合两种不同抗原。由于双特异性单克隆抗体在结构上的特殊性，具有两个不同的抗原识别位点，如果能把该抗体技术引入到药物残留快速诊断技术中来，特别是在面临多残留快速检测技术需求的背景下，在一定程度上能满足多残留检测所面临的新的要求，该技术从抗体的结构和特性上入手，区别于传统的多残留免疫分析技术在半抗原和人工抗原的结构上进行一系列的改造，通过杂交-杂交瘤技术获得能特异性识别两种同类药物甚至是结构差异大得两类药物的双特异性单克隆抗体，与传统的抗体快速检测相比具有质的飞跃，为探索药物多残留快速检测技术新的研究领域和发展方向方面具有重要意义。
[0006] 氯霉素(chloramphenicol, CAP)是一种广谱抗生素,对革兰氏阳性、阴性细菌均有抑制作用，是治疗伤寒、副伤寒和沙门氏病的首选药物，对乳房炎也有很好的疗效，广泛应用于动物各种传染性疾病的治疗，造成在动物组织的残留。其毒副作用表现为抑制骨髓造血功能，引起人类的早产儿灰色综合症，再生障碍性贫血等，因此动物组织中氯霉素的残留对人类健康产生严重的威胁。许多国家严禁将氯霉素用于食品动物(特别是鸡蛋和奶牛)，并规定氯霉素的MRL为0-0.01mg/kgo我国和美国均规定在动物性食品中不得检出氯霉素(含量在Ing/mL以下)。欧盟不允许氯霉素用于产奶母牛和产蛋鸡，严格规定肉中的氯霉素残留量不得检出，所以发展适宜的方法以快速、灵敏的检测动物组织中的氯霉素残留就显得非常重要。目前，氯霉素残留分析方法主要有微生物检测法、理化检测法和免疫检测法等。微生物法虽然普遍适用于抗菌药物的残留检测，它易受组织中其他抗生素的影响，特异性低，灵敏度也不高，但操作简便，样品用量少，预处理简单，在基层大规模筛选工作中有很大的应用价值。理化检测法虽然结果准确，但检测设备昂贵，需专业人员操作，样品前处理方法烦琐，不适于批量样品的筛选检测任务，因此，开发一种简单、快速，适于现场监控的痕量分析法-免疫分析方法具有重要的现实意义。
[0007]盐酸克伦特罗(Clenbuterol hydrochloride),又名瘦肉精,具有改变养分代谢途径、提高瘦肉率等作用，被广泛用于饲料添加剂，然而研究表明瘦肉精的毒性危害很大，为此农业部于2002年发布第176号公告将盐酸克仑特罗列为禁用药品，但盐酸克伦特罗的违规使用和滥用现象还时有发生，因此加强对盐酸克伦特罗的快速、高通量、现场监测的技术
研究非常重要。
[0008]目前，盐酸克伦特罗的分析技术主要以仪器分析为主，仪器分析法虽然结果准确，但检测设备昂贵，需专业人员操作，样品前处理方法烦琐，不适于批量样品的筛选检测任务，因此，开发一种简单、快速，适于现场监控的痕量分析法-免疫分析方法具有重要的现实意义。
[0009]目前虽然有氯霉素和克伦特罗的免疫分析技术报道，但均局限于单一的分析技术和手段，在面临多残留分析需求的背景下，建立能同时检测两种或者两类目标化合物的免疫分析技术就显得尤为迫切，而制备优质的双特异性单克隆抗体是建立免疫多残留分析技术的新的手段和方法。
【发明内容】
[0010]针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种抗氯霉素和克伦特罗的双特异性单克隆抗体及其制备方法的技术方案。
[0011]所述的一种抗氯霉素和克伦特罗的双特异性单克隆抗体，其特征在于所述的单克隆抗体对氯霉素和克伦特罗同时具有特异性。
[0012]所述的一种抗氯霉素和克伦特罗的双特异性单克隆抗体的制备方法，其特征在于包括以下步骤:
1)合成氯霉素和克伦特罗的半抗原和人工抗原；
2)利用氯霉素人工抗原筛选分泌抗氯霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并进行HGPRT酶或TK酶缺陷筛选；
3)利用克伦特罗人工抗原筛选分泌抗克伦特罗单克隆抗体的杂交瘤细胞株并进行TK酶或HGPRT酶缺陷筛选；
4)分泌抗氯霉素单抗的杂交瘤细胞株和分泌抗克伦特罗单抗的杂交瘤细胞株进行细胞融合后筛选得到四体杂交瘤细胞，所述的四体杂交瘤细胞分泌抗氯霉素和克伦特罗的双特异性单克隆抗体。
[0013]所述的抗氯霉素和克伦特罗的双特异性单克隆抗体的制备方法，其特征在于所述的步骤2)中分泌抗氯霉素的杂交瘤细胞株通过以下方法制备得到:以琥珀酸氯霉素为半抗原，合成人工抗原后免疫 小鼠，再取脾细胞与SP2/0细胞进行融合、筛选，获得分泌抗氯霉素的杂交瘤细胞，然后经过含8-杂氮鸟嘌呤或5-溴-2-脱氧尿苷筛选，获得HGPRT酶或者TK酶缺陷的分泌抗氯霉素的杂交瘤细胞株。
[0014]所述的抗氯霉素和克伦特罗的双特异性单克隆抗体的制备方法，其特征在于所述的步骤3)中分泌抗克伦特罗的杂交瘤细胞株通过以下方法制备得到:克伦特罗活化后为半抗原，重氮化法合成人工抗原后免疫小鼠，再取脾细胞与SP2/0细胞进行融合、筛选,获得分泌抗克伦特罗的杂交瘤细胞，然后经过含5-溴-2-脱氧尿苷或8-杂氮鸟嘌呤筛选，获得TK酶或者HGPRT酶缺陷的分泌抗克伦特罗的杂交瘤细胞株。
[0015]本发明制备得到的双特异性单克隆抗体性状稳定、检测灵敏度高、能大量生产，并用这个抗体建立了 ELISA分析方法，为氯霉素和克伦特罗的快速检测提供技术基础。
【具体实施方式】
[0016]以下结合实施例来进一步说明本发明。
[0017]1.免疫原的制备
1.1氯霉素半抗原、免疫原和包被抗原的的制备 1.1.1琥珀酸氯霉素的合成
称取氯霉素2.0 g和丁二酸酐0.75 g，置于100 mL三口烧瓶中，回流冷凝管接氯化钙干燥管或抽真空充氮气保持反应过程无水无氧。注入15 mL -30 mL经无水无氧处理的吡啶，搅拌溶解后60-90 °C反应2 h-12 h，待反应液(深玫瑰红色)自然冷却至室温后，加入50 mL 7K，用6 mol/L盐酸调节混合液pH值为5，用乙酸乙酯30 mL提取3次，用I mol/L碳酸氢钠水溶液3 X 25 mL提取有机相，收集水相，用乙醚3 X 15 mL，洗涤水相，弃去乙醚层，再以6 N盐酸调节水相pH值约为5，以乙酸乙酯3 X 30 mL提取水相，收集乙酸乙酯层，以少量水洗涤乙酸乙酯，经无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得少量红色粘稠液体，将其冷冻干燥，用体积分数95%乙醇将固体重结晶，晶体真空干燥后得到产物即为琥珀氯霉素。[0018]1.1.2免疫原的合成与纯化
将80 μ mo I氯霉素半抗原溶解在I mL DMF中，然后加入等当量的DCC和NHS，让其在室温下搅拌反应过夜，反应液经4000 r/ min离心10 min后，吸取上清液500 μ L缓慢滴加到6 mL溶于0.01 mol/L,pH9.6碳酸盐缓冲溶液的20 mg/mL牛血清蛋白(BSA)溶液中，磁力搅拌反应6-10 h，待反应完成后，装入透析袋，先用蒸馏水透析2-4次，然后用0.01mol/L, pH7.4的PBS透析3 d，取出分装，于-20 °C保存。
[0019]1.1.3包被抗原的合成
取氯霉素半抗原80 μπιο?用I mL DMF溶解，然后加入等当量的正三丁胺和氯甲酸乙酯，室温下搅拌反应I h，取反应液400 UL缓慢加入到6 mL pH 9.0，0.2 mol/L的碳酸盐缓冲溶液溶解的20 mg/ mL的OVA溶液中，室温下搅拌反应2 h后，装入透析袋，先用蒸馏水透析2次，然后用PBS透析3d后，取出分装，于-20 °C保存。
[0020]1.2克伦特罗人工抗原的制备 1.2.1盐酸克伦特罗的活化成 取3 mg CL，加入I mL lmol/L HCL和500 PL蒸馏水于反应烧杯中，同时调节pH至
0.5，然后在4 1:下往其中连续缓慢加入60 μL 0.2 mol/L NaNO2,4°C低速搅拌1_3 h。
[0021]L 2.2人工抗原的合成与纯化
准确称取牛血清白蛋白(BSA)或卵清蛋白(0VA)，溶于pH值7.0-8.0磷酸盐缓冲液(PBS)中。将偶氮后的盐酸克伦特罗慢慢滴入牛血清白蛋白溶液中(盐酸克伦特罗和蛋白载体分子比在20-30之间)，用I mol/L氢氧化钠调节pH在7.0-8.0之间，滴加结束后在暗处继续搅拌2-5 h。反应结束后，反应液置于处理过的透析袋内，4 1:搅拌透析72 h后，-20°C保存备用。
[0022]2.免疫动物
实验选用6-10周龄的BALB/C小鼠，20-22 g，免疫5_10只小鼠。取6 — 8周龄体重18-20 g BALB/C雌性小鼠，将制备的CAP-HS-BSA交联物和CL-BSA交联物分别与等体积弗氏完全佐剂混合，充分乳化后，经腹部皮下多点注射，剂量为50-100 μδ/只，以后每隔3周，取抗原(与一免等剂量)和等体积的弗氏不完全佐剂充分乳化后腹腔和皮下注射加强免疫，加强免疫共4次，末免以加倍剂量的抗原进行腹腔注射，3 d后取脾细胞进行融合。
[0023]3.细胞融合
取上述免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)按5-12:1的比例，在无血清的RPM1-1640培养基中混匀，1500 rpm离心5 min，去除培养基，用50 % PEG (Sigma)作为融合剂，在37 °C下水浴下加入0.5-0.7 ml，使其融合2 min，用无血清的RPM1-1640培养基终止融合后1500 rpm离心5 min，沉淀用HAT培养基悬浮，分装到96孔含有饲养细胞的细胞板中，37 °C, 5 % C02的细胞培养器皿中培养。
[0024]4.杂交瘤细胞、阳性孔的筛选及其克隆
细胞在细胞培养板中培养5 d后，用HAT培养基换液一次，第10天用HT培养基换液，等到融合细胞覆盖孔底10%-50%时，常规间接ELISA方法筛选阳性孔。氯霉素筛选共获20多个对上述抗原有反应的阳性孔，选择其中12个呈强阳性反应的细胞孔进行间接ELISA，最后筛选6个较理想的阳性孔，这6个阳性孔进行有限稀释法克隆，最终获得I株能分泌抗氯霉素的特异性抗体的杂交瘤细胞6D9，经6个月以上体外传代和多次冻存复苏后，该株细胞株均能良好生长，并稳定分泌抗体。克伦特罗筛选共获50多个对上述抗原有反应的阳性孔，选择其中20个呈强阳性反应的细胞孔进行间接ELISA，最后筛选8个较理想的阳性孔，这8个阳性孔进行有限稀释法克隆，最终获得I株能分泌抗盐酸克伦特罗的特异性抗体的杂交瘤细胞7C7,经6个月以上体外传代和多次冻存复苏后，该株细胞株均能良好生长，并稳定分泌抗体。
[0025]5.四体杂交瘤细胞的制备
对6D9细胞株用含8-杂氮鸟嘌呤(8-AG)浓度为100-300 Pg/mL的RPMI1640培养基培养3-6周，使6D9细胞HGPRT酶缺失；对7C7细胞株采用含5-溴-2-脱氧尿苷(5_BrdU)浓度为50-300 Pg/mL的RPMI1640培养基中培养4_8周，使7C7细胞胸苷激酶(TK)缺失；将上述两种酶缺陷型细胞进行再融合制备杂交-杂交瘤细胞，以氯霉素包被抗原和克伦特罗包被抗原进行阳性和灵敏度筛选，以对氯霉素和克伦特罗具有较好的特异性和灵敏度为筛选依据，最终筛选获得2株四体杂交瘤细胞7E12和9A8，经3个月以上体外传代和多次冻存复苏后，该株细胞株均能良好生长，并稳定分泌抗体。经扩大培养后，用于腹水制备和液氮保存。
[0026]7.双特异性单克隆抗体腹水制备及纯化
取8周龄左右BALB/C小鼠，腹腔注射0.3-0.5 ml降植烷(Sigma)，7_10天后腹腔注入
5-10 X IO6个7B2杂交瘤细胞，注射后7-10天可见小鼠腹部明显膨大，采取腹水，3000 rpm离心3 min，收集上清液，即为双特异性单克隆抗体腹水。取I倍体积腹水加4倍体积0.06 MpH4.8醋酸缓冲液稀释，加辛酸(30 μΙ/mL腹水)，室温下边加边搅拌，4 °C澄清I h，12000rpm离心20 min，收集上清，再用50%饱和硫酸铵沉淀免疫球蛋白，4 °C放置2 h，3000 rpm离心20 min，沉淀用2倍体积的PBS溶液溶解，在4 1:流动透析24 h后即获纯化的腹水抗体，-70 °C保存。
[0027]8.双特异性单克隆抗体ELISA分析方法的建立
8.1氯霉素ELISA分析方法的建立
采用包被抗体-酶标半抗原的反应模式，建立ELISA分析方法。具体步骤如下:
1.确定工作浓度。采用正交实验法梯度包被双特异性单克隆抗体浓度为0.125-16Pg/mL于ELISA板，37 V 2 h，PBST洗涤三次后用I — 10%的脱脂奶粉或1 — 3% BSA或
3- 6%牛血清封闭30-60 min，加入浓度梯度为0.5-16 ng/mL酶标半抗原CAP-HS-HRP，100 uL/孔，37 0C 1- 2 h，PBST洗涤四次后，用OPD-H2O2底物显色，2 mol/L H2SO4终止反应后，用酶标仪读取OD49tl的值，OD值在1.0左右的抗体-酶标半抗原的浓度组合为初选工作浓度，然后将初选的双特异性单克隆抗体包被ELISA板，37 V 2 h，PBST洗涤三次后用
1- 10%的脱脂奶粉或I 一 3% BSA或3 — 6%牛血清封闭30-60 min ;加入梯度稀释的氯霉素标准溶液50 μ 1，再加入经缓冲液稀释的2倍浓度的酶标半抗原50 μ 1,37 V I 一 2h，PBST洗涤四次后，用OPD-H2O2底物显色，2 mol/L H2SO4终止反应后，用酶标仪读取OD49tl的值，根据抑制与浓度之间的半对数关系作图即得到标准曲线。
[0028]ELISA方法的标准曲线以抑制率与农药浓度的半对数曲线表示，抑制率以下式计
算:抑制率
【权利要求】
1.一种抗氯霉素和克伦特罗的双特异性单克隆抗体，其特征在于所述的双特异性单克隆抗体对氯霉素和克伦特罗同时具有特异性。
2.一种抗氯霉素和克伦特罗的双特异性单克隆抗体的制备方法，其特征在于包括以下步骤: 1)合成氯霉素和克伦特罗的半抗原和人工抗原； 2)利用氯霉素人工抗原制备分泌抗氯霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株； 3)利用克伦特罗人工抗原制备分泌抗克伦特罗单克隆抗体的杂交瘤细胞株； 4)分泌抗氯霉素抗体的杂交瘤细胞株和分泌抗克伦特罗抗体的杂交瘤细胞株进行细胞融合后筛选得到四体杂交瘤细胞，所述的四体杂交瘤细胞分泌抗氯霉素和克伦特罗的双特异性单克隆抗体。
3.如权利要求2所述的抗氯霉素和克伦特罗的双特异性单克隆抗体的制备方法，其特征在于所述的步骤2)中分泌抗氯霉素的杂交瘤细胞株通过以下方法制备得到:以琥珀酸氯霉素为半抗原，合成人工抗原后免疫小鼠，再取脾细胞与SP2/0细胞进行融合、筛选,获得分泌抗氯霉素抗体的杂交瘤细胞，然后经过含8-杂氮鸟嘌呤或5-溴-2-脱氧尿苷筛选，获得HGPRT酶或者TK酶缺陷的杂交瘤细胞株。
4.如权利要求2所述的抗氯霉素和克伦特罗的双特异性单克隆抗体的制备方法，其特征在于所述的步骤3)中分泌抗克伦特罗的杂交瘤细胞株通过以下方法制备得到:克伦特罗活化后为半抗原，重氮化法合成人工抗原后免疫小鼠，再取脾细胞与SP2/0细胞进行融合、筛选，获得分泌抗克伦特罗的杂交瘤细胞，然后经过含5-溴-2-脱氧尿苷或8-杂氮鸟嘌呤筛选，获得TK酶或者HGPRT酶缺陷的分泌抗克伦特罗的杂交瘤细胞株。
【文档编号】C07K16/46GK103951755SQ201410173658
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年4月28日 优先权日:2014年4月28日
【发明者】金仁耀, 桑永玉 申请人:浙江工商大学