表达人血清白蛋白的慢病毒载体及其构建方法
【专利摘要】本发明公开了一种表达人血清白蛋白的慢病毒载体：包含有人血清白蛋白基因，以及进行人血清白蛋白表达调控的鸡源的鸡卵清蛋白的启动子区序列，如SEQIDN0.3所不，人血清白蛋白基因的5’端连接有kozak序列；同时，上游还包含有进行药物筛选的neo基因，下游包含有报告基因ZsGreen?本发明的表达人血清白蛋白的慢病毒载体可用于制备转基因鸡，该转基因鸡繁殖后，其产生的卵（鸡蛋）中将会特异性地表达人血清白蛋白，而转基因鸡的其它细胞并不会表达人血清白蛋白，分离纯化方便，且由转基因鸡生产出来的人血清白蛋白在经过修饰之后更近似于人类体内正常的血清白蛋白，更有利于其发挥生物学功能。
【专利说明】表达人血清白蛋白的慢病毒载体及其构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种表达人血清白蛋白的慢病毒载体，尤其涉及构建带有鸡卵清白蛋 白启动子区和人血清白蛋白基因的慢病毒表达载体pLVX-Neo-pOVA-hALB-IRES-ZsGreen， 属于基因工程技术和生物制药领域。
【背景技术】
[0002] 人血清白蛋白是由585个氨基酸组成的单链蛋白质，分子量为67kDa，白蛋白是血 浆中含量最高的蛋白质。白蛋白具有维持血液渗透压、抗休克、运输与解毒、促进肝细胞修 复与再生等作用，是国际上使用最多的血液制品。临床上主要用于烧伤、失血性休克、水肿、 低蛋白血症等的治疗。
[0003] 医用血清白蛋白的传统获得方法是从健康人血浆中提取，但由于血浆制品具有污 染人原病毒的可能以及目前血液源的枯竭，使该方法受到很大限制，难以得到足够的血液 制品。目前我们国家每年需要白蛋白120吨，而通过献血能制备的白蛋白仅为所需求量的 1/3,因此，白蛋白供应严重紧缺。
[0004] 目前重组生物制药中普遍采用酵母、大肠杆菌发酵制备，但此方法存在诸多的缺 点，例如：微生物与人体环境差异大，表达产品生物活性低、掺杂的微生物毒素难以彻底去 除，生产工艺复杂，很难形成规模化生产，因此，迄今为止，还没有相关产品上市。最近也有 国际公司利用转基因技术制备转基因动物来制备人重组蛋白产品，与传统的微生物表达系 统相比，动物生物反应器具有以下特点：1)生产的蛋白质生物活性高，能够对重组蛋白质 进行多种翻译后加工，非常接近天然产品；2)表达量大、成本低；3)产品易提纯、质量高，避 免了其他生产方式的化学及生物毒素的污染，安全可靠；4)易产业化：转移的目的基因能 够遗传，使某一群体都具有同一特性，可通过动物繁殖扩群，进行规模化生产。
[0005] 最早的进行转基因鸡的方法是通过逆转录病毒（Lentiviral vector)来进行的， 这些病毒能够感染处在分裂期的细胞，在其宿主的正常生命周期中专一性的将基因整合到 宿主的染色体中。但是由于逆转录病毒在干细胞中表达效率低，要得到转基因动物是比较 困难的。目前ALV载体已经用于产生转基因禽类，但是转化的效率不是很高，只有10%，而 且在56只小公鸡中只有一只能够产生携带转基因精子。而且这只小公鸡产生的转基因精 子的比率也十分的低，只有0. 7 %，效率很低。
[0006] 相比之下，慢病毒载体较逆转录病毒载体有更广的宿主范围，容纳外源性基因片 段大，可以长期表达等显著优点。慢病毒能够有效感染非周期性和有丝分裂后的细胞。慢 病毒载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效 果。对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，使用慢病毒载体，能 大大提高目的基因的转导效率，且目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，能够 比较方便快捷地实现目的基因的长期、稳定表达。此外慢病毒不产生任何有效的细胞免疫 应答，可作为一种转基因的工具。慢病毒载体介导的转基因表达能持续数月，且无可观察到 的病理学现象。
[0007] 近年来转基因鸡的技术已经十分成熟并且成为了新的研究热点，全世界有多种抗 体以及医疗用蛋白通过转基因鸡生产，无论是实验技术、实际效果还是经济效益上，利用鸡 输卵管作为生物反应器生产有药用价值重组蛋白质的前景都十分光明。
【发明内容】
[0008] 针对上述现有技术，本发明提供了一种表达人血清白蛋白的慢病毒载体，以及进 一步培育出鸡蛋中能够表达人血清白蛋白的转基因鸡的方法。
[0009] 本发明旨在通过转染效率高的慢病毒对鸡胚胎进行遗传修饰，将外源的人血清白 蛋白基因随机插入到鸡胚的细胞中，改变这些细胞基因组的组成，一旦被感染的胚胎细胞 中包括了生殖细胞，那么将会在其子代中出现可遗传的带有人血清白蛋白的转基因鸡，由 于通过基因工程的方法将慢病毒载体中的CMV启动子换成了鸡卵清白蛋白的启动子，从而 将非特异性的表达变成了组织特异性的表达，即目的基因的表达会与卵清蛋白的表达位置 相同。这样通过杂交筛选能够培育出在鸡卵（鸡蛋）中表达人类血清白蛋白的转基因鸡， 并且确保这种遗传修饰的改变能够被子代继承，长久的传递下去。
[0010] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0011] 本发明将适合人血清白蛋白在鸡蛋蛋清中表达的调控反应元件以及人血清白蛋 白的基因重组于鸡卵清白蛋白序列的元件，并进行基因工程克隆，构成人血清白蛋白在鸡 输卵管组织特异性表达的慢病毒载体pLVX-Neo-pOVA-hALB-IRES-ZsGreen，具体技术方案 如下：
[0012] 一种表达人血清白蛋白的慢病毒载体，结构为：包含有人血清白蛋白基因（序列 如SEQIDN0. 2所示，所表达的蛋白序列如SEQIDN0. 1所示），以及进行人血清白蛋白表达调 控的鸡源的鸡卵清蛋白的启动子区序列，其大小为I. 7kb(SEQIDN0. 3所示），人血清白蛋白 基因的5'端连接有kozak序列，kozak序列为GCCACC ;同时，上游还包含有进行药物筛选的 neo基因，下游包含有报告基因 ZsGreen。
[0013] 所述表达人血清白蛋白的慢病毒载体的构建方法，该方法的关键在于构建一种可 以将人血清白蛋白插入到鸡胚细胞的基因组中并能够成功表达人血清白蛋白的慢病毒，经 过扩增和纯化后，将这种慢病毒显微注射到Stagel3-15期的胚胎中，鸡胚孵化后经过培养 杂交，能够获得转基因鸡。该转基因鸡在形成卵的过程中表达产生人血清白蛋白，并且在其 后代中稳定的传递转基因修饰，产生子代转基因鸡。构建方法具体如下：
[0014] 通过NCBI进行检索，得到目的基因（人血清白蛋白的基因）后，设计特异性引物， 进行鸡卵清蛋白的启动子区序列和人血清白蛋白基因的扩增（人血清白蛋白基因扩增后， 在5'端增加了一个kozak序列）；然后，以pLVX-Neo-IRES-ZsGreen慢病毒载体（该慢病毒 载体为商品化载体，可常规市场购买得到）为基础，用于构建产生慢病毒：用PBluescript II SK(+)载体（商品化的载体）构建鸡卵清蛋白的启动子区序列与人血清白蛋白基因融 合（鸡卵清蛋白的启动子区序列重组到pBluescriptIISK(+)载体上,再将人血清白蛋白基 因重组到pBluescript II SK(+)载体上，利用特异性引物将鸡卵清蛋白的启动子区序列与 人血清白蛋白基因的融合基因克隆下来），然后将融合基因经过PCR扩增后连接到修饰的 pLVX-Neo-IRES-ZsGreen慢病毒载体上，即得表达人血清白蛋白的慢病毒载体；所有序列 经过PCR获得。
[0015] 所述修饰的pLVX-Neo-IRES-ZsGreen慢病毒载体是通过以下方法得到的：通过限 制性核酸内切酶Nsil和BamHI对载体进行酶切，目的在于将载体本身的CMV启动子破坏 掉，便于以后引入鸡卵清蛋白的启动子区序列发挥作用；酶切后的载体经过T4DNA连接酶 补平末端后连接成环状，即得，修饰的pLVX-Neo-IRES-ZsGreen慢病毒载体用于载体构建。 [0016] 所述特异性引物如下：
[0017] 用于扩增鸡卵清蛋白的启动子区序列的引物为F1、F2 :
[0018] Fl :5' -CCGCGGCCGCTCTATGGCGTCAAAGGTCA-3' ；如 SEQIDN0. 4 所示；
[0019] F2 :5' -CCCCCCGGGGAAAATGTAAGGATGG-3' ；如 SEQIDN0. 5 所示；
[0020] 用于扩增人血清白蛋白基因的引物为F3、F4 :
[0021] F3 :5' -CCCGGGGCCGAAATGAAGTGGGTAACCTTTAT-3' ；如 SEQIDN0. 6 所示；
[0022] F4 :5' -CCATCGATTTATAAGCCTAAGGCAGCTTGAC-3' ；如 SEQIDN0. 7 所示；
[0023] 引物F5, F6用于将连接到pBlueSCriptIISK(+)载体上的鸡卵清蛋白的启动子区 序列+人血清白蛋白基因克隆并重组到pLVX-Neo-IRES-ZsGreen :
[0024] F5 :5' -CCGCTCGAGGCTCTATGGCGTCAAAGGTC-3' ；如 SEQIDN0. 8 所示；
[0025] F6 :5, -CCGGCGGCCGCTTATAAGCCTAAGGCAGCTT-3,；如 SEQIDN0. 9 所示。
[0026] 上述方法中：
[0027] 鸡卵清蛋白的启动子区序列与人血清白蛋白融合基因上包含（5' -3'顺序）5'同 源臂（1.7kb)，为鸡卵清蛋白基因上游序列，包含有卵清蛋白启动子，5'同源臂两端引入两 个酶切位点5' NotI/3' XmaI ;
[0028] Kozak(9bp) +人血清白蛋白cDNA序列（I. 8kb)含有终止密码子，kozak序列存在 于真核生物mRNA的一段序列，其在翻译的起始中有重要作用能够增强基因表达，酶切位点 引入 5, XmaI/3, ClaI ;
[0029] 鸡卵清蛋白的启动子区序列，kozak9bp+人血清白蛋白cDNA序列均为PCR扩展产 物，将kozak序列设计到引物中连接到人血清白蛋白cDNA序列的5'端；鸡卵清蛋白的启动 子区序列、kozak9bp+人血清白蛋白cDNA序列先连接到pBluescriptIISK(+)之后通过PCR 扩增后引入酶切位点5' XhoI/3' NotI再连接到pLVX-Neo-IRES-ZsGreen载体上。
[0030] 所述表达人血清白蛋白的靶向载体在制备转基因鸡中的应用：将上述的表达人血 清白蛋白的慢病毒载体转化293T细胞制备慢病毒，经过鉴定能够表达人血清白蛋白之后， 扩大培养，收集纯化慢病毒，利用显微注射技术，将纯化的慢病毒注射入鸡胚胎中，培育出 转基因鸡，该转基因鸡繁殖后，其产生的卵（鸡蛋）中将会特异性地表达人血清白蛋白，而 转基因鸡的其它细胞并不会表达人血清白蛋白。
[0031] 一种获得表达人血清白蛋白的转基因鸡的方法，步骤为：利用慢病毒感染的方法 将上述表达人血清白蛋白的慢病毒载体转化293T细胞制备慢病毒，收集并纯化能够表达 人血清白蛋白的慢病毒，然后将慢病毒注射入鸡胚胎中，从而将鸡卵清蛋白的启动子区序 列、kozak9bp+人血清白蛋白cDNA序列整合到鸡胚的胚胎细胞中，培育出转基因鸡，该转基 因鸡繁殖后，其产生的卵（鸡蛋）中将会特异性地表达人血清白蛋白（以鸡输卵管为生物 反应发生器），而转基因鸡的其它细胞并不会表达人血清白蛋白。
[0032] -种制备生物反应器的方法，所述生物反应器由转基因鸡输卵管组成，方法包括 用上述构建的表达人血清白蛋白的慢病毒载体制备转基因鸡。
[0033] -种从转基因鸡输卵管产生人血清白蛋白的方法，步骤为：利用慢病毒感染的方 法将上述表达人血清白蛋白的慢病毒载体转化293T细胞制备慢病毒，收集并纯化能够表 达人血清白蛋白的慢病毒，然后将慢病毒注射入鸡胚胎中，从而将表达人血清白蛋白的慢 病毒随机插入到鸡胚细胞的基因组中，培育出转基因鸡，培育转基因鸡雌雄性个体至性成 熟并传代（为增加产量，可分析或Fl代雌性转基因鸡个体所产的鸡蛋蛋清组分中人血 清白蛋白的含量，选择高产个体作为生物反应器的宿主动物或作为生物反应器种鸡），然后 从转基因鸡雌性个体所产的鸡蛋中分离纯化人血清白蛋白。
[0034] 本发明构建慢病毒表达载体，通过慢病毒将人血清白蛋白基因整合到鸡的基 因组中，通过特异性的启动子序列以鸡的输卵管作为生物反应器来表达的目的蛋白，制 备出转基因鸡。本发明通过基因工程的方法选择性的将鸡卵清蛋白的启动子区插入到 PLVX-Neo-IRES-ZsGreen 中，称为 pLVX-Neo-pOVA-hALB-IRES-ZsGreen，鸡的卵清白蛋白只 在输卵管中表达，即便慢病毒将基因整合到其他位置，这样的操作也会使得只有在输卵管 的位置才能够表达人血清白蛋白，本发明引入的基因不会在鸡体内其他的部位表达。相 对于其他方法，利用转基因鸡产生人血清白蛋白有着极为明显的优势：1)鸡具有世代间隔 短、生产性能高、易于饲养和管理、成本低。2)通过转入功能蛋白基因在鸡输卵管表达，将鸡 输卵管作为生物反应器，能够使鸡蛋中含有人血清白蛋白，由于组成鸡蛋蛋清的蛋白质只 有8种，转基因蛋白质容易从鸡蛋的成分中分离和收集。3)鸡蛋具有天然的无菌环境，表达 的人血清白蛋白不容易受到污染。4)与其他的转基因方式产生的白蛋白相比以鸡输卵管作 为生物反应器制备的蛋白不仅可正确糖基化，在鸡体内附着在新生多肽上的寡聚糖类比哺 乳动物的更近似人类，所以有转基因鸡生产出来的人血清白蛋白在经过修饰之后更近似于 人类体内正常的血清白蛋白，更有利于其发挥生物学功能5)利用慢病毒制备转基因鸡的 技术相对成熟，国内国际上已经有较多的成功案例，而且慢病毒的转染效率极高，能够达到 50 %左右的成功效率。
【专利附图】
【附图说明】
[0035] 图1 :慢病毒载体构建示意图。
【具体实施方式】
[0036] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
[0037] 实施例中所涉及的试剂、方法，若无特别说明，均为本领域的常规试剂、常规方法。
[0038] 实施例一构建表达人血清白蛋白的慢病毒载体（构建原理示意图如图1所示）
[0039] (一）鸡基因组DNA提取
[0040] 1、取第10期鸡胚200mg剪碎，加 SENT (包含有蛋白酶K50 μ g/ml和10 % SDS)0. 5ml，转移到匀浆器中匀浆。
[0041] 2、将匀浆液转移到I. 5ml离心管中。
[0042] 3、60C 水浴 3 小时。
[0043] 4、加等体积饱和酚至上述样品处理液中，温和、充分混匀3min。
[0044] 5、离心5000gl0min，取上层水相到另一 I. 5ml离心管中。
[0045] 6、加等体积饱和酚，混匀，离心5000gl0min，取上层水相到另一管中。
[0046] 7、加等体积酚/氯仿，轻轻混匀，离心5000gl0min，取上层水相到另一管中。如水 相仍不澄清，可重复此步骤数次。
[0047] 8、加等体积氯仿，轻轻混匀，离心5000gl0min，取上层水相到另一管中。
[0048] 9、加1/10体积的3M醋酸钠（pH5. 2)和2. 5倍体积的无水乙醇，轻轻倒置混匀。
[0049] 10、待絮状物出现后，离心5000g5min，弃上清液。
[0050] 11、沉淀用75%乙醇洗涤，离心5000g3min，弃上清液。
[0051] 12、室温下挥发乙醇，待沉淀将近透明后加50灭菌纯水溶解。
[0052] (二）人血液中RNA提取
[0053] 1、严格无菌操作，采新鲜血液2ml于3. 8%柠檬酸钠抗凝管。
[0054] 2、1，500rpm 离心 5min。
[0055] 3、在超净台内小心将上层血浆吸出，同时用等量的Hank' s液补足2ml全血体积， 轻柔混匀。
[0056] 4、取4ml淋巴细胞分离液于15ml灭菌透明塑料离心管中，将2ml补足体积的抗凝 血小心地加于淋巴细胞分离液液面上，3, OOOrpm室温离心lOmin。
[0057] 5、小心收集界面上的细胞，加入到含4mlHank' s液的离心管中轻柔混匀，漂洗细 胞。
[0058] 6、1，500rpm离心5min，重复漂洗一次，沉淀即为所需的淋巴细胞。
[0059] 7、处理好的淋巴细胞，加入Trizol，lml，充分颠倒混匀直至完全溶解，室温放置 5min。
[0060] 8、加入氯仿200μ 1，充分颠倒混勻lmin，成均一的乳糜状，离心5min。
[0061] 9、将上清液小心转移到RNase-free的I. 5mleppendorf里（离心分层后，可以吸 取上层无色液体约为350 μ 1，注意不要吸取任何中间层物质）。
[0062] 10、将上清层转移到一干净的离心管中，加入等体积冰浴的异丙醇，颠倒振荡混 匀，将混合的样品在-20°c条件下孵育20分钟以上，4°C，12, 000 X g离心10分钟。RNA沉淀 通常形成片状沉淀附着于管壁或管底。
[0063] 11、弃去上清，用Iml冰浴的75%的乙醇洗涤RNA沉淀一次，颠倒洗涤离心管管壁， 并旋涡振荡样品，尽可能让沉淀悬浮，4°C，12, OOOXg离心5分钟，再次去除上清，晾干沉 淀。
[0064] 12、加入20ul高压的DEPC水进行溶解。
[0065] (三）人源cDNA的合成
[0066] 1.将提取的人mRNA热变性，65°C，5min.后，立即置于冰上。
[0067] 2.反应液配置：如下所示：
[0068] 试剂及使用量：
[0069] RNA 溶液：2 μ g ;5 X RTBuffer :4 μ I ;dNTPMixture (各 IOmM) :2 μ 1 ; primer(mix) : 1 μ I ;ReverTraAce : 1 μ I ;RnasefreeH20 :upto20μ I〇
[0070] 3.反应条件：
[0071] 65 °C 5min ；
[0072] 37 °C 15min ；
[0073] 98 °C 5min ；
[0074] 冰上 5min ;
[0075] (四）PCR对鸡卵清蛋白的启动子区序列和人血清白蛋白基因进行扩增PCR反应体 系如表1所示：
[0076] 表 1
【权利要求】
1. 一种表达人血清白蛋白的慢病毒载体，其特征在于：包含有人血清白蛋白基因，以 及进行人血清白蛋白表达调控的鸡源的鸡卵清蛋白的启动子区序列，如SEQIDNO. 3所示， 人血清白蛋白基因的5'端连接有kozak序列；同时，上游还包含有进打药物筛选的neo基 因，下游包含有报告基因 ZsGreen。
2. 权利要求1所述的表达人血清白蛋白的慢病毒载体的构建方法，其特征在于：设 计特异性引物，进行鸡卵清蛋白的启动子区序列和人血清白蛋白基因的扩增；然后，用 pBlueSCriptIISK(+)载体构建鸡卵清蛋白的启动子区序列与人血清白蛋白基因融合，然后 将融合基因经过PCR扩增后连接到修饰的pLVX-Neo-IRES-ZsGreen慢病毒载体上，即得表 达人血清白蛋白的慢病毒载体； 所述修饰的pLVX-Neo-IRES-ZsGreen慢病毒载体是通过以下方法得到的：通过限制性 核酸内切酶Nsi 1和BamHI对载体进行酶切，酶切后的载体经过T4DNA连接酶补平末端后连 接成环状，即得。
3. 根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于：所述用pBluescriptIISK(+)载 体构建鸡卵清蛋白的启动子区序列与人血清白蛋白基因融合的具体方式为：鸡卵清蛋 白的启动子区序列重组到pBl UeSCriptIISK(+)载体上，再将人血清白蛋白基因重组到 pBlueSCriptIISK(+)载体上，利用特异性引物将鸡卵清蛋白的启动子区序列与人血清白蛋 白基因的融合基因克隆下来。
4. 根据权利要求2或3所述的构建方法，其特征在于：所述特异性引物如下： 用于扩增鸡卵清蛋白的启动子区序列的引物为F1、F2: Fl :5' -CCGCGGCCGCTCTATGGCGTCAAAGGTCA-3' ；如 SEQIDNO. 4 所示； F2 :5' -CCCCCCGGGGAAAATGTAAGGATGG-3' ；如 SEQIDNO. 5 所示； 用于扩增人血清白蛋白基因的引物为F3、F4 : F3 :5' -CCCGGGGCCGAAATGAAGTGGGTAACCTTTAT-3' ；如 SEQIDNO. 6 所示； F4 :5' -CCATCGATTTATAAGCCTAAGGCAGCTTGAC-3' ；如 SEQIDNO. 7 所示； 引物F5, F6用于将连接到pBlueSCriptIISK(+)载体上的鸡卵清蛋白的启动子区序列 +人血清白蛋白基因克隆并重组到pLVX-Neo-IRES-ZsGreen : F5 :5' -CCGCTCGAGGCTCTATGGCGTCAAAGGTC-3' ；如 SEQIDNO. 8 所示； F6 :5' -CCGGCGGCCGCTTATAAGCCTAAGGCAGCTT-3' ；如 SEQIDNO. 9 所示。
5. 权利要求1所述的表达人血清白蛋白的慢病毒载体在制备转基因鸡中的应用。
6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于：具体应用时，将权利要求1的表达人血清 白蛋白的慢病毒载体转化293T细胞制备慢病毒，经过鉴定能够表达人血清白蛋白之后，扩 大培养，收集纯化慢病毒，利用显微注射技术，将慢病毒注射入鸡胚胎中，培育出转基因鸡。
7. -种获得表达人血清白蛋白的转基因鸡的方法，其特征在于：利用慢病毒感染的方 法将权利要求1的表达人血清白蛋白的慢病毒载体转化293T细胞制备慢病毒，收集并纯化 能够表达人血清白蛋白的慢病毒，然后将慢病毒注射入鸡胚胎中，培育出转基因鸡。
8. -种制备生物反应器的方法，其特征在于：所述生物反应器由转基因鸡输卵管组 成，方法包括用权利要求1所述的表达人血清白蛋白的慢病毒载体制备转基因鸡。
9. 一种从转基因鸡输卵管产生人血清白蛋白的方法，其特征在于：利用慢病毒感染的 方法将权利要求1的表达人血清白蛋白的慢病毒载体转化293T细胞制备慢病毒，收集并纯 化能够表达人血清白蛋白的慢病毒，然后将慢病毒注射入鸡胚胎中，培育出转基因鸡，培育 转基因鸡雌雄性个体至性成熟并传代，然后从转基因鸡雌性个体所产的鸡蛋中分离纯化人 血清白蛋白。
10.根据权利要求9所述的从转基因鸡输卵管产生人血清白蛋白的方法，其特征在于： 培育转基因鸡雌雄性个体至性成熟后，分析或Fl代雌性转基因鸡个体所产的鸡蛋蛋清 组分中人血清白蛋白的含量，选择高产个体作为生物反应器的宿主动物或作为生物反应器 种鸡。
【文档编号】C07K14/765GK104212837SQ201410173937
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年4月28日 优先权日:2014年4月28日
【发明者】王向东, 高鹏, 魏光伟, 李相芝 申请人:山东大学