水稻胞质型ppdk蛋白抗原表位、其抗体及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种水稻碳氮代谢相关蛋白——水稻胞质型PPDK蛋白的抗原表位、抗水稻胞质型PPDK蛋白的多克隆抗体及其制备方法与应用。水稻胞质型PPDK蛋白特异性抗原表位的氨基酸序列如SEQ?ID?NO:1所示，经过多肽合成，多肽与载体蛋白偶联，免疫动物制得抗血清，并经过亲和层析纯化得到水稻胞质型PPDK蛋白多克隆抗体。本发明制备的多克隆抗体效价高、亲和力强、特异性好，可与水稻胞质型PPDK蛋白发生特异性结合反应，且制备成本低，得率高，为胞质型PPDK蛋白的基础研究，如对PPDK表达的特异性、表达谱和含量的分析，及其相关生理功能的研究提供了一个重要的工具。
【专利说明】水稻胞质型PPDK蛋白抗原表位、其抗体及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学和免疫学领域。具体涉及一种水稻碳氮代谢相关的胞质型PPDK蛋白抗原表位、其抗体及应用。
【背景技术】
[0002]丙酮酸憐酸双激酶(pyruvateorthophosphate dikinase 或 pyruvatephosphate dikinase, PPDK ；E.C.2.7.9.1)是 C4 途径和景天科酸代谢(crassulaceanacid metabolism, CAM)途径的限速酶，催化三憐酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)、丙酮酸和无机磷酸盐(inorganic phosphate, Pi)经三步反应生成磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate, PEP),此反应具有可逆性。PPDK广泛存在于高等植物中，玉米、水稻、拟南芥、高粱、甘蔗、家稗和Flaveria属等植物的PPDK基因有很高的同源性。已有研究表明PPDK基因具有两个不同的转录起始位点，分别受两个启动子控制。其中，长转录物翻译为包含转运肽的C4型PPDK蛋白，具有组织特异性及光诱导性，而短转录物翻译为不含有转运肽的胞质型PPDK蛋白。胞质型PPDK的表达量较低，可能对pH维持和柠檬酸循环中间产物补偿等非光合方面有重要作用。目前，对PPDK在C3植物中的作用及非光合作用功能研究受到重视。
[0003]水稻至少有两个PPDK编码位点(PH)Kl和PPDK2)，PPDKl基因定位在水稻第5染色体上，全长llkb，包含21个外显子和20个内含子；由两个功能独立的启动子，分别产生一个类C4型PPDK-PH)KB (含有947个氨基酸残基，分子量为102.8kDa)以及一个胞质型PPDK-CPDKI (含有882个氨基酸残基，分子量为96.2kDa)。PTOK2基因定位在水稻第3染色体上，包含18个外显子，仅编码一个由887氨基酸残基组成、分子量为96.6kDa的胞质型PPDK——CPDK2。胞质型PPDK大量存在于发育的水稻籽粒中，其功能可能与籽粒发育早期的代谢相关，如自由氨基酸合成、脂肪酸从头合成以及脂类代谢等(Imaizumi等1997)。
[0004]迄今为止，关于水稻胞质型PPDK的研究还有待深入。蛋白质印记技术(WesternBlot)利用抗原和抗体特异性结合来定性定量检测复杂样品中某目的蛋白，具有灵敏度高、特异性好、操作简便和结果直观等优点。传统多克隆抗体制备过程多采用重组蛋白作为抗原，但重组蛋白的表达和纯化复杂且繁琐，在纯化过程中不可避免的会掺入一些杂蛋白，即便是高纯度的重组蛋白，由于多个抗原决定簇的存在，所制备的抗体仍有可能存在交叉反应，从而影响抗体的特异性。为解决抗体特异性问题，多采用合成抗原表位的方法来制备抗体，即根据预测的抗原表位合成一段多肽作为抗原，多肽合成技术成熟，具有易操作、准确性高和成本低廉的优点。
【发明内容】
[0005]本发明通过对水稻胞质型PPDK蛋白的抗原表位进行预测并合成相应多肽作为抗原，制备了胞质型PPDK蛋白多克隆抗体，该抗体具有很高的灵敏性和特异性。具体地，本发明包括以下几方面:[0006]本发明的第一个目的是提供一种水稻胞质型PPDK蛋白的抗原表位。通过分析水稻胞质型PPDK蛋白的特性(亲水性、表露性和柔韧性等)及二级结构，得到多个抗原表位序列，综合考虑多妝的长度等因素，确定了一条最有效的抗原表位，其多妝的氣基酸序列为EACQQYQAAGKT (SEQ ID NO:1 所示)。
[0007]本发明的第二个目的是提供所述抗原表位的用途。该抗原表位用于制备人工合成多肽抗原以及水稻胞质型PPDK蛋白多克隆抗体。
[0008]本发明的第三个目的提供是一种水稻胞质型PPDK蛋白多克隆抗体的制备方法:首先对所述多肽的氨基酸序列进行末端修饰，然后将修饰后的多肽经过固相合成并与载体蛋白偶联，得到抗原，用抗原免疫动物后，取动物的多抗血清并从中分离纯化多克隆抗体。
[0009]所述末端修饰为在氨基酸序列的C端增加一个半胱氨酸残基，修饰后的多肽的氨基酸序列为 EACQQYQAAGKTC((SEQ ID N0:2 所示)。[0010]为增强动物的免疫反应，将多肽与载体蛋白偶联，所述载体蛋白为钥孔戚血兰蛋白(keyhole limpet hemacyanin, KLH),偶联剂为琥拍酰亚胺_4_环已烧-1-碳酸酯(suecinimidyl4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate,SMCC)。
[0011]将多肽采用9-芴甲氧羰基(FMOC)保护α-氨基进行固相合成。
[0012]本发明的第四个目的是提供一种水稻胞质型PPDK蛋白多克隆抗体。本发明所提供的胞质型PPDK蛋白抗体，是用上述抗原免疫动物，再从所免疫的动物中分离、纯化血清得到特异性好、敏感性强的多克隆抗体。免疫动物可以选择兔、小鼠、大鼠、山羊等常用的免疫动物，纯化方法为亲和层析纯化。
[0013]本发明的第五个目的是提供所述多克隆抗体在检测水稻胞质型PPDK蛋白中的应用。所述的多克隆抗体能应用于基于抗原抗体反应原理来检测目的蛋白的生物技术中，包括免疫印迹、免疫共沉淀和免疫组化等应用技术。
[0014]本发明的第六个目的是提供一种检测水稻胞质型PPDK蛋白的方法，该方法包括使用所述的多克隆抗体的步骤。
[0015]本发明的第七个目的是提供一种检测水稻胞质型PPDK蛋白的试剂，该试剂含有所述的多克隆抗体。
[0016]本发明制备的多克隆抗体效价高、亲和力强、特异性好，可与水稻胞质型PPDK蛋白发生特异性结合反应，且制备成本低，得率高，具有工业化生产的可行性。该抗体可对水稻籽粒在不同发育时期、不同生长条件下的表达情况进行分析研究，可以在水稻一切与胞质型PPDK蛋白作用相关的代谢机理研究中得到应用，为胞质型PPDK蛋白的功能和作用机理的研究提供了检测与验证技术支持。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1.本发明合成的胞质型PPDK蛋白多克隆抗体对水稻籽粒不同发育时期的免疫印迹检测结果。
【具体实施方式】
[0018]下面将结合实例对本发明的技术方案进行详细描述。下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为对本发明进行限制。实施例中未注明的具体技术或者条件，均按照本领域内的文献所记载或本领域常规技术手段进行操作。
[0019]实施例1:候选抗原表位的预测
[0020]水稻胞质型PPDK蛋白对应的基因在GenBank中的基因ID是:D87745.1，编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO: 3所示。
[0021]所编码的氨基酸全长序列如SEQ ID NO:4所示(其中第I~97位肽段为转运肽，从第98位开始为胞质型PPDK ;第121-132位为抗原表位)。
[0022]然后根据SEQ ID NO:4分析氨基酸序列的亲水性、表露性和柔韧性等，在该蛋白的N端选出了一段序列EACQQYQAAGKT(如SEQ ID NO:1所示，该序列位于SEQ ID N0:4中的第121-132位)。经BL AST比对水稻蛋白质数据库，确定该段多肽能唯一识别胞质型PPDK蛋白。
[0023]实施例2:合成一种用于制备胞质型PPDK抗体的专用抗原
[0024]为将该序列与载体蛋白偶联，在该序列的C端增加一个半胱氨酸残基，因此合成的氨基酸序列为EACQQYQAAGKTC(如SEQ ID NO:2所示)，由百意欣生物技术有限公司进行固相合成，并经由偶联剂SMCC与载体蛋白KLH偶联，形成胞质型PPDK蛋白抗体的专用抗原。
[0025]实施例3:多克隆抗体血清的制备
[0026]免疫动物选择年龄在三个月左右、体重2kg以上的健康新西兰大白兔，以实施例2中制备的抗原免疫动物。具体步骤如下:
[0027]首先对每只兔子进行免疫前诱导，通过四肢、腋下及背部皮下注射0.5mL弗氏完全佐剂，刺激局部免疫反应，一周后进行首次免疫。首次免疫前，经耳静脉取血作为阴性对照。将抗原用 PBS(137mM NaCl, 2.7mM KCl, IOmM Na2HPO4, 2mM KH2PO4, ρΗ7.4)稀释至Img ?ml/1 (以载体蛋白计算),分装后储存于_20°C。取500 μ L的Img ?ml/1抗原(即0.5mg)加入300yL PBS再次稀释，然后加入等体积的弗氏完全佐剂(首次免疫)或弗氏不完全佐剂(第二次至第四次免疫)，并在涡旋仪上混匀和乳化。对兔子进行四肢、腋下及背部皮下多点注射，首次免疫两周后进行第二次免疫，以后每间隔两周加强一次(共进行4次免疫)。第三次免疫12天后，经耳静脉取血测定抗体效价。达到要求者于第四次免疫11天后颈动脉放血，收集血样。将血样静置于4°C过夜或者37°C温育3h，在4°C条件下，5000rpm离心lOmin，收集血清，分装后-80°C保存。
[0028]实施例4:胞质型PPDK蛋白多克隆抗体的制备
[0029]通过对实施例3中制备的血清进行亲和层析纯化，制得胞质型PPDK蛋白多克隆抗体。具体步骤如下:
[0030](I)胞质型PPDK蛋白合成多肽亲和层析柱的制备:称取Ig CNBr活化的Sepharose4B (Pharmacia)干粉,用ImM HCl充分溶胀、浸洗凝胶后,再用连接缓冲液冲洗2次，迅速与溶解有5mg合成多肽EACQQYQAAGKTC (SEQ ID NO: 2)的连接缓冲液(0.1M NaHCO3,0.5M NaCl, pH8.3)混合，室温下旋转混合I小时后，用5倍凝胶体积的连接缓冲液冲洗凝胶，洗去未结合的多肽，然后将凝胶转移至0.1M Tris-HCl，pH8.0缓冲液中装柱，以封闭凝胶上的活化基团，静置2小时后，用5倍凝胶体积的高pH溶液(0.1M CH3COONa,pH4.0,0.5MNaCl)和低pH溶液(0.1M Tris-HCl, ρΗ8.0，0.5Μ NaCl)交替洗凝胶三次，再用10倍凝胶体积的TBS缓冲液(50mM Tris - HCl, pH7.5，150mM NaCl)平衡柱子。至此，亲和层析柱准备完毕。
[0031](2)亲和层析纯化抗多肽抗体:将20mL血清用TBS缓冲液稀释5倍，并用孔径为0.45 μ m的混合纤维素膜过滤，以除去血细胞等杂质。将过滤后的血清溶液以0.5mL ^mirT1的速度加入层析柱内，为保证抗血清与填料的结合，需连续上柱两次。用TBS清洗层析柱至洗脱液的A28tol < 0.008后，用洗脱缓冲液(50mM甘氨酸，pH2.7)以相同的速度洗脱，用事先加入中和缓冲液(1M Tris-HCl, pH8.0, 1.5M NaCl, ImM EDTA)的离心管收集洗脱液，混匀后用PH试纸检查溶液的pH，如果pH低于7.4，可用中和缓冲液调至约pH7.4，以防止抗体变性，同时检测抗体的浓度，最后加入等体积的甘油，保存在_20°C条件下，既得纯化好的多克隆抗体。
[0032]经检测纯化抗体的最高浓度为1.55mg.πι?Λ 20mL血清共纯化出4.88mg抗体，得
率较高。
[0033]实施例5:多克隆抗体对胞质型PPDK蛋白的特异性检验
[0034]在水稻93-11灌浆期，从花后第五天开始取水稻籽粒，间隔5天取一次，直至水稻成熟期(花后第40天)，所有样品基本覆盖水稻整个灌浆期，具有代表性。将籽粒外的颍壳去除后液氮速冻，-80°C保存。
[0035]适量水稻籽粒用液氮充分研磨，称取磨好的样品0.3g左右，按照1:2的比例加入冰上预冷的蛋白提取缓冲液(50mM Tris - HCl，pH8.0,2mM EDTA, ImM PMSF, 1% [v/v] Sigmaprotease inhibito r cocktail),迅速混匀并置于冰上,孵育30min,每IOmin润旋混匀一次。4°C 12000rpm离心20min,取上清即为水稻籽粒总蛋白。用Bradford法对蛋白进行定量后，将上清与等体积SDS-PAGE上样缓冲液混合，-80°C保存。
[0036]将提取的水稻蛋白质进行SDS-PAGE电泳分离，上样量为30 μ g。将分离好的蛋白质经槽式转印系统快速转印(高电场强度)至硝酸纤维素膜上，转印结束后用封闭液(含5%脱脂奶粉的TBS[20mM Tris-HCl, pH7.5,500mM NaCl])在室温下封闭硝酸纤维素膜l_2h。使用实施例4中制备的多抗，用含有0.05% Tween-20的封闭液以1:1000的比例稀释后，与封闭好的膜在 37°C 下孵育 lh，TTBS (20mM Tris-HCl, pH7.5,500mM NaCl,0.05%Tween-20)洗膜3次，每次lOmin，用含有0.05 % Tween-20的封闭液以1:5000的比例稀释AP标记的山羊抗兔二抗(北京康为世纪，CW0111)，与洗好的膜在37°C下孵育lh，TTBS洗膜3次，每次IOmin0将膜浸泡在AP底物缓冲液(0.1M Tris - HCl，ρΗ9.5，0.5mMMgCl2,
0.33 μ g.ml^NBT, 0.165 μ g.ml^BCIP)中显色，直至条带清晰(约5-lOmin)。结果如图1所示，抗体在经1:1000稀释后，仍能检测到胞质型PPDK说明制备的抗体效价较高、亲和力强，且只有一条主带，分子量约为96kD，与理论结果一致，能在水稻籽粒发育的所有时期检测到胞质型PPDK蛋白，具有很高的特异性。
[0037]尽管本发明的【具体实施方式】已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解，根据已经公开的所有教导，可以对一些细节进行替换和修改，这些改变均在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种水稻胞质型PPDK蛋白的抗原表位，其多肽的氨基酸序列为SEQ IDNO:1所示。
2.权利要求1所述的抗原表位在制备水稻胞质型PPDK蛋白多克隆抗体中的应用。
3.—种水稻胞质型PPDK蛋白多克隆抗体的制备方法，其特征在于:首先对权利要求1中所述的多肽的氨基酸序列进行末端修饰，然后将修饰后的多肽经过固相合成并与载体蛋白偶联，得到抗原，用抗原免疫动物后，取动物的多抗血清并从中分离纯化多克隆抗体。
4.根据权利要求3所述的多克隆抗体制备方法，其特征在于:所述末端修饰为在权利要求I中所述的氨基酸序列的C端增加一个半胱氨酸残基，修饰后的多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:2 所示。
5.根据权利要求3所述的多克隆抗体制备方法，其特征在于所述载体蛋白为钥孔戚血兰蛋白，偶联剂为琥珀酰亚胺-4-环已烷-1-碳酸酯。
6.根据权利要求3-5任何一项所述的制备方法得到的多克隆抗体。
7.权利要求6所述的多克隆抗体在检测水稻胞质型PPDK蛋白中的应用。
8.—种检测水稻胞质型PPDK蛋白的方法，其特征在于包括使用权利要求6所述的多克隆抗体的步骤。
9.一种检测水稻胞质型 PPDK蛋白的试剂，该试剂含有权利要求6所述的多克隆抗体。
【文档编号】C07K16/40GK103952383SQ201410178912
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年4月30日 优先权日:2014年4月30日
【发明者】王真梅, 曾汉来, 何莹, 李海霞, 刘雄锋 申请人:华中农业大学