黄鳝雌激素受体α基因、编码蛋白及酶联免疫检测方法

黄鳝雌激素受体α基因、编码蛋白及酶联免疫检测方法
【专利摘要】本发明采用RT-PCR方法获得黄鳝性腺中ERα序列，选择其抗原性较强的氨基酸序列相对应的cDNA序列作为模板克隆到长约945bp的序列，并将其克隆到pMAL-c2x表达载体中，通过IPTG诱导，Amylose-sepharose柱的纯化，获得了较纯的具有免疫活性的重组蛋白，采用FactorXa蛋白酶切、进一步纯化后，获得了可作为免疫原的ERα表达蛋白。免疫小鼠后，获得较高滴度的抗血清，并初步进行了免疫组化研究，表明该抗血清能特异与黄鳝性腺中的ERα蛋白结合，在卵母细胞膜上呈阳性反应，为进一步研究黄鳝性别发展中雌激素及其ERα等作用打下了基础。本发明还以此抗体为基础制备了ELISA检测试剂盒。
【专利说明】黄鳝雌激素受体α基因、编码蛋白及酶联免疫检测方法
[0001]
【技术领域】
[0002]本发明涉及基因工程领域，具体是涉及黄鳝雌激素受体α基因、编码蛋白及酶联免疫检测方法。
[0003]
【背景技术】
[0004]黄鳝，又名鳝鱼,主要生活在亚洲地区，目前中国只有I种，具有较高的营养价值。自从七十年代开始人工养殖以来，野生黄鳝苗种便被大量捕捉，同时环境污染等造成黄鳝野生资源日渐减少，养殖苗种严重短缺。黄鳝发育周期中存在性逆转的现象，开始发育时黄鳝为雌性，性成熟产卵后，雄性生殖细胞开始发育，形成间性阶段，逐渐发育成雄性黄鳝。
[0005]黄鳝发育周期中性逆转的现象是刘健康等首先发现的(刘健康，顾国彦.鳝鱼性逆转时生殖腺组织的改变，水生生物学报，1951，2 (1-2):85-109)，而后肖亚梅(肖亚梅，刘筠.黄鳝由间性发育转变为雄性发育的细胞生物学研究.水产学报，1995，19(4):297-301 ;肖亚梅.黄鳝繁殖生物学研究:1.黄鳝的雌性发育.湖南师范大学自然科学学报.1995，18(4):45-52)等详细的研究了黄鳝性腺发生与分化的过程，从而表明黄鳝开始发育时为雌性，雌性性成熟产卵后，性腺内卵细胞逐步败育，卵巢结构退化，同时雄性生殖细胞开始发育，形成间性阶段，通过这一阶段黄鳝过渡到雄性发育，最后形成雄性的黄鳝。黄鳝性别决定基因或在基因水平上调控黄鳝性逆转一直以来都是研究者们关注的热点，而性别决定又是一个涉及多基因不同时空的复杂调控过程。
[0006]性类固醇激素(sex steroid hormone)是调节脊椎动物下丘脑-垂体-性腺轴的发育成熟及维持各项功能的重要激素。动物体内内源性类固醇激素主要有雄激素、雌激素和孕激素三种，它们的生理功能主要都是通过经典的雌激素核受体介导的。雌激素受体与雌激素特异性地结合后介导雌激素应答元件(estrogen respond elements,EREs)调节基因的转录。硬骨鱼类的ER种类和生理功能等似乎比高等脊椎动物更为复杂。首个鱼类ER α是由Pakdel等从虹鳟(Oncorhynchus mykiss)脑中分离得到的,迄今为止,有10余种鱼类的ERa已进行了研究报道。
[0007]激素的酶联免疫测定具有无放射性污染，标记物稳定，标记酶来源广泛、经济，灵敏度、特异性与放免测定相当等特点，使得激素的酶免测定方法有望替代放免测定技术。但酶联免疫测定需要较多的激素标准品，用常规的垂体抽提技术需要大量的垂体。
[0008]

【发明内容】

[0009]本发明提供了黄鳝雌激素受体α蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示。[0010]编码上述蛋白质的黄鳝雌激素受体α基因。
[0011]所述的黄鳝雌激素受体α基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。
[0012]本发明还提供了含有上述黄鳝雌激素受体α基因的载体。
[0013]上述的载体，是指在EcoR I和Hind III位点之间插入上述黄鳝雌激素受体α基因的 pMAL。
[0014]本发明还提供了用于黄鳝雌激素受体α基因的酶联免疫检测方法，包括如下步骤:
(1)抗原的制备:将黄鳝雌激素受体α基因插入载体中，并在大肠杆菌中表达，得到的ERa重组蛋白，经纯化后作为抗原；
(2)抗体的制备:将(I)中所得到的抗原免疫鼠制备得到抗黄鳝雌激素受体α抗体；
(3)抗体的纯化:对(2)中所得的抗体经离心、沉淀、脱盐，得纯化抗体；
(4)纯化抗体的标记:用酶标记(3)中所得的纯化抗体，得到酶标抗体；
(5)标准曲线的绘制:用不同浓度的抗原包被在固相载体上，通过与(4)中所获得的酶标抗体结合后，进行测定，绘制抗原浓度与OD值的标准曲线；
(6)样本测定:对待测样本进行测定，通过标准曲线得出待测样本中抗原的含量。
[0015]进一步地，步骤(1)中是通过将黄鳝雌激素受体α基因插入至pMAL_c2x的EcoR
1、Hind III的位点之间，转化大肠杆菌TBl，获得融合蛋白；再对融合蛋白的MBP蛋白酶切后，得到ER α重组蛋白。
[0016]进一步地，所述的步骤(4)中，所用的酶为辣根过氧化物酶。
[0017]本发明还提供了黄鳝雌激素受体α的酶联免疫检测试剂盒，包括有上述的黄鳝雌激素受体α蛋白质及其对应的抗体，所述的抗体是通过黄鳝雌激素受体α蛋白质在小鼠免疫反应制备得到。
[0018]本发明还提供了黄鳝雌激素受体α基因在黄鳝ERa受体检测中的应用。
[0019]有益效果
本试验采用RT-PCR方法获得黄鳝性腺中ERa序列，选择其抗原性较强的氨基酸序列相对应的cDNA序列作为模板克隆到长约945 bp的序列，并将其克隆到pMAL_c2x表达载体中，通过IPTG诱导，Amylose-sepharose柱的纯化,获得了较纯的具有免疫活性的重组蛋白，采用Factor Xa蛋白酶切、进一步纯化后，获得了可作为免疫原的ER α表达蛋白。免疫小鼠后，获得较高滴度的抗血清，并初步进行了免疫组化研究，表明该抗血清能特异与黄鳝性腺中的ERa蛋白结合，在卵母细胞膜上呈阳性反应，为进一步研究黄鳝性别发展中雌激素及其ERa等作用打下了基础。本发明还以此抗体为基础制备了 ELISA检测试剂盒。
[0020]
【专利附图】

【附图说明】
[0021 ] 图1是RT-PCR产物琼脂糖电泳图，M泳道是marker，I泳道是RT-PCR产物；
图2是重组质粒pMAL-ER α的限制性酶切分析中的电泳图，M泳道是marker，I泳道是PMD18-T-ER α 经 EcoRI 和 Hind III双酶切产物；
图3是鉴定大肠杆菌中ERa融合蛋白的SDS-PAGE分析的电泳图，I泳道是E.coliTBl; 2-3 泳道:TBl/pMAL 分别经(λ 3M、IM IPTG 诱导 4h ； 4 泳道:TBl/pMAL-ER α 经 0.3MIPTG 诱导 4h。
[0022]图4是蛋白免疫印迹试验中的电泳图，M泳道是marker ；1泳道是TBl/pMAL诱导表达的MBP蛋白2泳道是TBl/pMAL-ER α诱导表达的重组蛋白；3泳道诱导的TBl裂解物。
[0023]图5是小鼠免疫ER α和生理盐水后的抗体滴度分布
图6Α~图6D是鼠抗ERa多克隆抗体进行黄鳝性腺免疫组化分析，其中，图6Α:卵巢、图6Β:卵巢对照、图6C:精巢、图6D:精巢对照(图中，O:卵，GF:生殖褶，SP:精小囊)
图7Α是ERa在黄鳝性腺组织中的基因蛋白水平表达的western blot分析结果；横坐标:1卵巢.2.精巢；纵坐标:基因与对应β -actin的灰度比值
图7B是ERa在黄鳝性腺组织中的蛋白表达半定量分析结果；I卵巢.2.精巢；
图8是试剂盒线性验证的线性关系图。
[0024]
【具体实施方式】
[0025]下面通过【具体实施方式】结合附图对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例 仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0026]实施例1黄錯雌激素受:体Ct序列的克隆、蛋白的表达
1.材料
1.1实验材料:
实验鱼:黄鳝购自无锡中桥菜市场，组织为性腺。小鼠:购自浙江大学实验动物中心的ICR小鼠。
[0027]1.2试剂:T4 DNA连接酶、Taq DNA聚合酶、凝胶回收试剂盒、EcoR 1、Hind III等购自大连宝生物公司，聚丙烯酰胺、RNase抑制剂等购自上海申能博彩生物工程公司，Amylose-sepharose柱、Factor Xa、抗麦芽糖结合蛋白(MBP)单抗均购自纽英伦生物技术(北京)公司，其他生化试剂均为国产分析纯。弗氏完全、不完全佐剂，ELISA反应板等均购自上海生工生物工程有限公司。
[0028]1.3仪器:PCR仪购自BioRad公司，实验结果记录和蛋白分析使用的是柯达公司的凝胶成像系统，DNA序列分析使用DNAstar软件，全自动测序工作由上海博尚生物工程公司完成。酶标测定仪购自TECAN公司。
[0029]1.4质粒与菌株:pMD18_T载体购自大连宝生物公司，表达质粒pMAL_c2x、受体细菌TBl和JM109为本室保存。
[0030]2 方法
类固醇激素17-β雌二醇(estradiol，E2)是介导生殖、细胞增殖、分化、凋亡、炎症、代谢、内环境稳定等多种生理功能的重要调节因子。介导E2参与这些功能的就是雌激素受体。雌激素受体a (ERa )是1986年Green等从人乳腺癌细胞中纯化分享得到的，是最先被研究的一种雌激素受体。而在硬骨鱼中，首个鱼类ERa是hkM篤{Oncorhynchus mykiss)中分离得到的。至今为止已经在虹鳟{Oncorhynchus mykiss)、金MXGareissius auratus)>斑马鱼rerio)、金头鲷atfraiiAs)、日本獲鲡 C4^§ui77a j'a/7o/?ica )、欧鳎(.Solea solea)、舌鬼皆U)icentrarchus 7a^rar)和奥利亚罗非鱼等鱼中进行了 ERa基因的分离、克隆和组织表达等方面的研究和报道。目前黄鳝的ERa还没有文献报道，因此我们根据其他鱼类ER α基因的序列，设计了一对简并引物。
[0031]2.1引物设计与RT.PCR反应:采用Primer 5.0设计了一对引物:
上游引物:5，- gactacatgtgccctgctacaaaycartgyac _3，(SEQ ID N0.1)
下游引物:5，- catgctgtacaggtgctccatnccytt-3，(SEQ ID N0.2)
y是t或者c
反转录引物AP购自上海生工生物工程公司。
[0032]模板为提取自黄鳝性腺总RNA，进行反转录合成第一链cDNA，以反转录产物为模板及合成的上下游引物进行PCR扩增，反应条件为:94°C预变性3min，94 °C预变性30s，59°C退火 45s，72 °C延伸 1.5min，30 个循环，72°C延伸 7min。
[0033]2.2PCR产物的克隆与鉴定:
PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，回收符合预期目的的片段，将回收产物与PMD18-T载体4°C连接过夜，连接产物转化大肠杆菌JM109，随机挑取细菌提取质粒，经EcoR
1、Hind III双酶切鉴定后，将阳性克隆送交上海博尚生物公司进行DNA测序。测序结果用DNAstar、CLUSTAL X等软件进行分析。
[0034]RT-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳表明扩增到约945bp的目的片段，电泳图如图1所示，这与预期大小相符。将回收产物连接PMD18-T载体后，转化大肠杆菌JM109菌株，随机挑取10个克隆提取质粒并进行EcoRI和Hind III双酶切，酶切结果表明pMD18_T_ER α酶切后有一条约945bp的条带，表明ERa成功克隆入T载体中，将重组质粒pMD18_T- ERa送测序公司测序，测序结果如SEQ ID N0.3所示，测序结果同样表明RT-PCR扩增到的片段为ER α。
[0035]通过从黄鳝的卵巢中克隆到ERa基因的部分比较保守的序列，同源比对表明该序列与其他鱼类的ERa基因具有较高的同源性，因此可确认该基因就是黄鳝的ERa基因。
[0036]2.3原核表达载体的构建
将正向连接的pMD18-T-ERa克隆和原核表达质粒pMAL_c2x分别用EcoR 1、Hind III37°C双酶切，电泳回收ER片段和线性化pMAL-c2x质粒，按照T4 DNA连接酶的说明书设计连接反应，构建表达质粒pMAL- ER a，转化大肠杆菌JM109，随机挑取5个克隆进行酶切鉴定:提取质粒后再用上述酶进行双酶切，酶切结果如图2所示，可见有大小约为945bp的目的片段，表明成功的构建了表达载体pMAL-ER α。
[0037]2.4目的基因在大肠杆菌中的表达、鉴定
将表达质粒pMAL-ER α和空载体质粒pMAL_c2X分别转化大肠杆菌TBl，转化菌在含氨苄青霉素(lOOμg/ml)的2XYT培养基中37°C振荡培养过夜。第二天按1:100接种扩大培养，37°C振荡培养至0D 600值达到0.6左右，加入诱导剂IPTG至终浓度分别为0.3或Immol/L，继续37°C轻度振荡培养4小时，4°C离心(5000rpm，5min)收集菌体。采用IXPBS洗涤沉淀两次，最后加入适量的IXPBS将菌体重新悬浮。在菌体的悬浮物中加入等体积的
2X SDS凝胶加样缓冲液(IOOmM Tris-HCl pH6.8 ；200mM 二硫苏糖醇；4%SDS ；0.2%溴酚蓝；20%甘油)。将样品置于沸水中煮沸5分钟，破碎细胞，使蛋白质完全变性，再进行12%浓度的SDS-PAGE电泳，电泳后在考马斯亮蓝R-250中染色。电泳结果如图3所示。
[0038]由图3可知，加入IPTG诱导后，转入载体pMAL的细菌总蛋白提取物中表达了分子量约为42.5kD的蛋白条带(图3泳道2、3)，而转入重组质粒的细菌总蛋白提取物中出现了分子量约为78.1kD (图3泳道4)新的蛋白质。由于pMAL表达质粒本身编码的MBP分子量为42.5kD，而ERa分子量约为35.6kD，因此理论上融合蛋白的分子量应约为78.1kD0这与电泳结果相一致，表明重组表达载体经IPTG诱导后，目的蛋白得到表达，而大肠杆菌TBl中没有相应的蛋白表达。目的蛋白表达量经软件分析，约达到了细菌表达蛋白总量的42.3%。以抗MBP蛋白的抗血清进行的Western blot试验表明在大小为42.5和78.1KD处可见两条清楚的蛋白条带(见图4中泳道2、3)。SEQ ID N0.3推导出的氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示。
[0039]2.5融合蛋白的获得、纯化及裂解 将表达质粒pMAL-ER α和空载体质粒pMAL_c2X分别转化大肠杆菌TBl，转化菌在含氨苄青霉素(100μ g/ml)的2XYT培养基中37°C振荡培养过夜。再取过夜培养的IOml细菌扩大培养于IL LB (含葡萄糖)中，37°C摇振培养3h后，加入IPTG至终浓度为0.3mM，再继续培养2h，4000g离心20min收集菌体，重悬于50ml柱缓冲液中。加入终浓度为lmg/mL溶菌酶，冰浴30min。最后加入终浓度为5 μ g/mL DNA酶和RNA酶，4°C孵育lOmin。9000g离心30min，转移上清备用，上清中含有表达的重组蛋白。
[0040]将上清上样于平衡好的Amylose-sepharose亲和柱,平衡缓冲液为IX PBS (140mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4,1.8 mM KH2PO4, pH 7.3)，平衡至基线后，用洗脱缓冲液(50 mM Tris-HCl, 10 mM reduced glutathione, pH 8.0)洗脱，洗脱液中即为纯化后的融合蛋白，最后SDS-PAGE电泳检测，只有分子量为78.1kD左右的单一条带，比MBP蛋白的分子量明显偏大，表明纯化得到的融合蛋白效果较好。
[0041]取纯化好的重组蛋白中加入Factor Xa至终浓度为200 μ g / mL,室温作用4h，去除BMP蛋白，同上过Amylose-sepharose亲和柱,用平衡缓冲液洗脱，同样作SDS-PAGE电泳检测，呈单一的分子量为35.6kD条带。
[0042]相关研究表明大肠杆菌中外源基因表达的蛋白主要以包涵体形式存在，为了得到活性较强表达量高的可溶性蛋白，需要对包涵体进行一系列的变性和复性的过程才能获得有一定活性的目的蛋白，本研究采用的原核表达系统为商品化的pMAL-c2x载体，该载体带有利于纯化的MBP蛋白，该标签蛋白很容易被蛋白酶切割从而分离掉，同时其商品化的Amylose-sepharose纯化柱子纯化效率很高，因此我们得到了较纯的重组表达蛋白。
[0043]实施例2 ERa受体蛋白检测试剂盒的制备
2.1表达产物抗血清的制备
将回收的ERa重组蛋白与适量的I XPBS混合后，取0.2ml (约20 μ g的抗原)腹腔注射6只雌性BALB/c小鼠(4-5周龄)，在免疫小鼠之前，先采集部分血样，作为阴性血清。每两周免疫一次，第一次免疫后开始采血(小鼠在采血前数小时应予以禁食)。采集血样收集于经灭菌的、不含抗凝剂的离心管中放置于4°C冰箱中过夜，使之凝固，析出淡黄色抗血清。将抗血清转移至另一管中，血凝块以1500g离心10min，吸出上清液合并于收集到的抗血清管中。抗血清部分保持于_70°C冰箱中备用。[0044]2.2抗血清的测定
2.2.1 直接酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)
将ER α重组蛋白(抗原)稀释于包被缓冲液(0.1M Na2CO3，PH9.6)中，终浓度为5ng/口1，每孔加5(^1。并设立空白对照组(只加包被缓冲液)。4°C包被过夜后。用IXPBST(I XPBS+(0.1%) Tween 20)于室温下洗涤三次，每次5min。然后每孔加200 μ I封闭液(10%的小牛血清溶于IXPBS中)，4°C冰箱中封闭过夜。I X PBST洗涤三次后，加入一抗(血清样品按1:100或1:200倍比稀释于IXPBS中)，每孔100 μ 1，阴性孔加入100 μ I 1:200阴性血清，空白孔加入100μ I 1:100样品血清。37°C孵育2小时。采用I XPBST洗涤三次。加入酶标二抗，酶标二抗按说明书作1:1000稀释于IXPBS中，每孔50μ l，37°C，2h。显色，显色液(5mg OPD (邻苯二胺)；4μ I 30% H2O2 ; IOml 底物缓冲液(0.2Μ Na2HPO4,0.1M 柠檬酸钠))，每孔10(^1，371:，显色10分钟后，加入5(^1 2Μ H2SO4终止反应。酶标仪上判读结果。
[0045]对ICR小鼠免疫原性试验结果:初免I周后，在免疫组小鼠的血清中就可以检测到ERa蛋白诱导产生的特异抗体，在加强免疫后第7周抗体滴度上升到1.158±0.232(图5)，达到最高值，而空白对照组(注射生理盐水组)不能产生特异抗体，且免疫组与空白对照组抗体效价差异显著(Ρ〈0.05)。
[0046]以常规直接ELISA法检测制备的重组抗原与抗体的交叉反应。以本研究获得的重组表达蛋白以PH 9.5碳酸盐缓冲液稀释包被固相酶标板，充分洗涤后，以市售人、鼠、鳜鱼及上述纯化的抗体作为一抗,进行ELISA反应，37°C反应I小时后，以相应的酶标二抗进行反应，100 μ I/孔，37°C反应I小时后，自动洗板机洗板三次，5分钟/次，进行显色反应。结果表明人、鼠、鳜鱼雌激素受体抗体不能与制备的重组抗原反应，测定的ELISA值为0，制备的重组抗体能与重组 抗原反应，其结果与阴性对照差异显著。
[0047]2.2.2免疫组化分析
采用SuperPicTureTM法(DAB棕色反应法)进行免疫细胞化学反应，鼠抗黄鳝雌激素受体抗体为通过步骤2.1中制备得到，稀释度为1:100，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体(碧云天生物技术研究所)的稀释度为1:150。DAB显色试剂盒购自江苏碧云天生物试剂公司，对照实验片用正常鼠血清替代第一抗体进行孵育，并进行苏木素复染。
[0048]应用免疫组化SuperPicTure?法(DAB棕色反应法)染色的切片，背景无色或浅棕色。ERa免疫反应阳性物质呈深浅不等的棕色和棕黄色颗粒(图6A、C中所示)，主要定位于细胞膜上，细颗粒状，而在对照组中，细胞的细胞核被苏木素复染成淡蓝紫色(图6B),未出现棕色颗粒阳性信号，与预想结果一致.再次说明ERa抗体是特异性的。
[0049]采用制备的多克隆抗体进行的免疫组化定位初步研究，结果表明ERa在黄鳝卵巢精巢组织切片中均呈阳性反应，因此表明制备的多克隆抗血清可以与黄鳝ERa蛋白发生免疫反应，进一步观察可以发现卵巢中卵母细胞膜、卵母细胞核等各期中均呈免疫阳性反应。
[0050]2.2.3 Western blot 分析
分别提取黄鳝精巢、卵巢组织的总蛋白(精巢和卵巢各取6个样本)，按照Bradford法测定蛋白浓度，SDS-PAGE电泳时采用IOOyg的上样量。一抗按1: 500稀释，4°C杂交过夜，购自Sigma公司的β-actin —抗按1: 3000 4°C杂交过夜，购自SantaCruz公司的抗鼠的二抗按1: 1000在4V杂交lh。Western blot的具体方法见分子克隆。利用灰度分析软件UnScanIt gel 6.1对图7A进行半定量分析，通过计算得到泳道中特定基因与对应β-actin的灰度比值，并据此绘出基因表达的柱型图(图7B)，实验结果表明，ERa基因在黄鳝精巢和卵巢中均有表达，精巢中的表达比卵巢中强，精巢中的平均比值是0.507±0.03，卵巢中的平均比值是0.394±0.02，具有显著性差异(Ρ〈0.05)。
[0051]在本研究中使用带有该表达系统获得的重组蛋白免疫小鼠后可以得到效价较高的多克隆抗血清，经western blot检测该抗血清能够很好的识别ER α蛋白，表明其具有较好的免疫特异性。当然在原核表达系统中表达真核基因也存在一定的风险，如转录后不会进行糖基化、甲基化等修饰作用，从而造成很多真核生物的基因不表达或者表达后没有活性，如对虾白斑综合症病毒的结构蛋白VP28其野生型蛋白分子量为28kDa，原核表达的VP28蛋白的分子量为22kDa，造成差异的原因可能是野生型具有糖基化修饰等作用，而原核表达的VP28蛋白的翻译后修饰却是不完全的(Madhabananda S，Frank W.Differential expression of estrogen receptor-β and estrogen receptor-a in therat ovary [J].Endocrinology, 1999, 140 (2):963 971.)。其次是不同的表达系统有选择不同密码子的偏爱性，从而导致许多基因在原核系统中不能表达，难以获得实验结果。但在本试验的进行过程中却没有受到这些不利因素的影响，重组蛋白具有很好的抗原性，最终获得了抗血清。
[0052]2.3抗体的纯化
取4.2ml步骤2.1中得到的血清，加入等体积4.2 ml PBS (0.01M, pH7.8)，混匀。边搅边加入硫酸铵饱和溶液8.4 ml，使成50%饱和度，4°C放60分钟。4000 rpm离心20分钟，弃上清，用体积比是饱和硫酸铵:PBS= 4.2:4.2混合后的溶液清洗沉淀二次，去上清。将沉淀溶于4.2 ml PBS中，滴加 饱和硫酸铵溶液2.1 ml,使成30%饱和度，4°C放30分钟，离心去上清，重复该步一次。脱盐:沉淀溶于0.84 ml生理盐水，移入透析袋中，于生理盐水中透析至析出液中没有3042_，用1% BaCl2溶液滴定检测S042_。再换一次透析液，制得纯化抗体粗品1.5ml。
[0053]2.4纯化抗体的标记
将10 mg辣根过氧化物酶溶于0.2 ml 1.25%戊二醛-0.1 M PBS (pH 6.8)，室温作用18小时，透析去戊二醛。加生理盐水至I ml，加5 mg步骤2.3中制备得到的纯化抗体，加入0.1 ml IM碳酸盐缓冲液(pH 9.6)，4°C放24小时。加入0.1 ml 0.2M赖氨酸，室温作用2小时，于0.15 M PBS (pH7.2)中，充分透析。离心去沉淀，上清即为辣根过氧化物酶标记的抗体。
[0054]2.5试剂盒的制备
2.5.1包被:用pH 9.5碳酸盐缓冲液稀释前述纯化标记抗体(1:800),包被96孔板，100μ I/孔，4°C包被过夜，阴性对照孔设4个/板，用正常鼠血清包被。空白对照孔设4孔/板，加入包被液100 μ I。包被液:0.1 M Na2CO3缓冲溶液(pH 9.6)。
[0055]2.5.2洗板，用自动洗板机洗板三次，5分钟/次，洗涤液为TTBS (20 mMTris-0.8% NaCl-0.1% Tween 20，(pH 7.5 )。
[0056]2.5.3封闭:用1% BSA封闭酶标板上没有结合上抗体的位点。200 μ I/孔，室温作用I小时，洗板。[0057]2.5.4加入ER α重组蛋白或标准蛋白稀释液样品稀释液:1%BSA_TTBS，室温作用I小时。阴性对照孔分别加入100、11.Ul.235 ng/ml标准蛋白溶液。洗板；再在每孔中加入酶标抗体(1: 600 )，100 μ I/孔。
[0058]2.5.5加底物:底物中含:0.1 M-柠檬酸盐缓冲液-0.05%(wt/v邻苯二胺-0.025% (V/V) H2O2暗处反应20分钟，加入2 N H2SO4终止反应，50 μ I/孔，10分钟后读取0D490，
空白管调零。
[0059]利用不同的ERa重组蛋白浓度的样本测出0D490后，绘制抗原样本浓度与0D490值之间关系的标准曲线，再对待测样品进行同法测定，查标准曲线得到待测样本中抗原的浓度。
[0060]以制备的试剂盒检测不同鱼体的雌激素受体α蛋白。取5g罗非鱼、建鲤、鳜鱼、异育银鲫、黄鳝等性腺、肝、肾等加入5mL预冷的匀浆缓冲液(匀浆缓冲液:I mol/LTris-HCK pH = 7.6) IOmL,NaCl 2.925 g; EDTA: 0.05 g 和 100 mmol/L PMSF 0.5 mL,用蒸馏水定容至500 mL;)冰浴匀浆，在4°C下离心(离心力=12 OOOXg) 30 min后取上清液作为ELISA的检测液，检测结果表明试剂盒只能检测到黄鳝性腺、肝、肾组织的中的雌激素受体α，不能检测到罗非鱼、建鲤、鳜鱼、异育银鲫中的雌激素受体α，表明试剂盒特异性较强，不能与其他鱼类产生交叉反应，同时表明本实验建立的ELISA试剂盒具有较高的可靠性和稳定性。
[0061 ] 2.6试剂盒检测性能验证
2.6.1重复性
分别提取3份同一条黄鳝5g的性腺组织中ER α蛋白和实施例1中得到的纯化后的ERa重组蛋白分别按照步骤2.5的方法进行检测，OD值结果如表1，统计分析表明各组值的相对标准偏差都小于2%，表明制备的试剂盒具有较好的重复性。
[0062]表1试剂盒重复性试验结果
【权利要求】
1.黄鳝雌激素受体α蛋白质，其氨基酸序列如SEQID N0.4所示。
2.编码权利要求1所述的蛋白质的黄鳝雌激素受体α基因，其核苷酸序列如SEQIDN0.3所示。
3.含有权利要求2所述的黄鳝雌激素受体α基因的载体。
4.根据权利要求3所述的载体，是指在EcoRI和Hind III位点之间插入上述黄鳝雌激素受体α基因的pMAL。
5.用于黄鳝雌激素受体α基因的酶联免疫检测方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)抗原的制备:将黄鳝雌激素受体α基因插入载体中，并在大肠杆菌中表达，得到的ERa重组蛋白，经纯化后作为抗原； (2)抗体的制备:将(I)中所得到的抗原免疫鼠制备得到抗黄鳝雌激素受体a抗体； (3)抗体的纯化: 对(2)中所得的抗体经离心、沉淀、脱盐，得纯化抗体； (4)纯化抗体的标记:用酶标记(3)中所得的纯化抗体，得到酶标抗体； (5)标准曲线的绘制:用不同浓度的抗原包被在固相载体上，通过与(4)中所获得的酶标抗体结合后，进行测定，绘制抗原浓度与OD值的标准曲线； (6)样本测定:对待测样本进行测定，通过标准曲线得出待测样本中抗原的含量。
6.根据权利要求5所述的用于黄鳝雌激素受体a基因的酶联免疫检测方法，其特征在于:步骤⑴中是通过将黄鳝雌激素受体a基因插入至pMAL_c2x的EcoR 1、HindIII的位点之间，转化大肠杆菌TBl，获得融合蛋白；再对融合蛋白的MBP蛋白酶切后，得到ERa重组蛋白。
7.根据权利要求5所述的用于黄鳝雌激素受体a基因的酶联免疫检测方法，其特征在于:所述的步骤(4)中，所用的酶为辣根过氧化物酶。
8.权利要求2所述的黄鳝雌激素受体a基因在黄鳝ERa受体检测中的应用。
9.黄鳝雌激素受体a的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于:包括有权利要求1所述的黄鳝雌激素受体a蛋白质及其对应的抗体，所述的抗体是通过黄鳝雌激素受体a蛋白质在小鼠免疫反应制备得到。
【文档编号】C07K14/72GK103965348SQ201410180865
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2014年4月30日 优先权日:2014年4月30日
【发明者】丁炜东, 邴旭文, 曹丽萍, 曹哲明 申请人:中国水产科学研究院淡水渔业研究中心