酸敏感连接单元的合成及其在dna测序中的用途
【专利摘要】本发明公开了一种酸敏感连接单元的合成及其在DNA测序中的用途。该酸敏感连接单元，结构式为：其中R为NH2或N3，m为0～44中任一整数，n为0～44中任一整数；R1，R2均为脂肪族烷基，或R1，R2均为芳香族衍生物，或R1为苯基、萘基、苯基的衍生物、或萘基的衍生物，R2为脂肪族烷基或氢；或R2为苯基、萘基、苯基的衍生物、或萘基的衍生物，R1为脂肪族烷基或氢，或R1、R2构成环己基、环戊基或环丁基。该酸敏感连接单元与核苷酸及荧光素连接得到的可逆终端可用于DNA合成测序。该类可逆终端可用于DNA测序；同时，其合成所需原料简单易得，合成过程均为常规化学反应，可用于大规模推广使用。
【专利说明】酸敏感连接单元的合成及其在DNA测序中的用途
【技术领域】
[0001] 本发明属于化学合成和生物化学领域，涉及可用于DNA测序的化合物，具体涉及 一类酸敏感连接单元的合成及其在DNA测序中的用途。
【背景技术】
[0002] DNA测序技术是现代生物学研究中重要的手段之一。人类基因组计划完成后，DNA 测序技术得到了迅速发展。DNA测序（DNAsequencing)是指分析特定DNA片段的碱基序 列，也就是腺嘌呤（A)、胸腺嘧啶（T)、胞嘧啶（C)与鸟嘌呤（G)的排列方式。发展精确、高 通量、低成本的DNA测序方法对于生物、医药科学等具有非常重要的意义。
[0003] 合成法测序（SequencingBySynthesis,SBS)是新一代DNA测序技术之一。合成 法测序方法通过把大量被测的模板DNA片段进行固定，并在固定化的DNA测序模板上杂交 结合通用的DNA引物，分别控制4种核苷酸在DNA引物上的延伸。通过检测延伸反应过程 或延伸核苷酸，实现高通量并行的DNA序列信息的检测。
[0004] 在合成法测序中，首先要合成DNA链延长的四种核苷酸原料，又叫"可逆终 端"(reversibleterminator)。这类核苷酸除了要求3 轻基阻断外，为了不影响下一个 指示核苷酸的并入和识别，还要求通过一个可裂解的连接单元把核苷酸和指示分子，例如 荧光素，连接起来。然后，在下一个指示核苷酸并入之前，在温和的条件下使这个连接单元 断裂，继续DNA链的延长，从而读出DNA碱基的序列。该连接单元对合成法测序的读长和效 率有重要的影响，因此，人们也一直致力于发展新的可裂解连接单元，来提高DNA测序的效 率。目前已报道的连接单元有还原剂敏感（二硫键，偶氮化合物）；光裂解（邻硝基苄基 衍生物，苯甲酰甲基酯衍生物及其光可裂解连接单元）；亲电子试剂/酸敏感（酸裂解；叠 氮化合物）；金属作用下的裂解；氧化剂敏感等。然而酸敏感连接单元却从来没有用于DNA 测序（Bioorganic&MedicinalChemistry2012, 20, 571-582)。
[0005] 可裂解连接单元对DNA测序的读长和效率有重要的影响，而现有的连接单元存在 裂解条件不够温和、裂解效率不高，用于测序时读长太短等缺点，因此，设计、合成新的可裂 解连接单元，并探索合适的裂解条件对于提高测序的效率、发展新的测序方法有非常重要 的意义。发明人在前期工作中，发展了一种酸敏感可裂解连接单元，该类连接单元包含四 氢吡喃醚和四氢呋喃醚两种结构（申请号=201110331659. 1 ;201210132695)，这类基于缩 醛的连接单元可用于DNA合成测序，但是在DNA测序体系中基于该类连接单元的可逆终端 即使在pH= 1. 6的情况下完全断裂所需要的时间也需要25min，这时候DNA链已经损伤很 严重，如果将pH值提高到1. 8,该可逆终端在DNA测序体系中即使延长时间、提高温度均不 能使之完全断裂，所以该体系实际上很难用于测序。然而从理论上讲一个测序循环的完成 是可行的。所以设计、合成对酸更为敏感的连接单元并用于DNA测序，具有非常重要的意 义。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种酸敏感连接单元的合成及其在DNA测序中的用途。本 发明设计合成的一类新的酸敏感连接单元及其可逆终端，该类化合物合成原料简单易得， 合成过程均为常规化学反应，易于实现大量合成；该类化合物可与核苷酸和荧光素实现高 效率地连接。通过研究该类化合物的裂解性能，发现该类化合物在温和的条件下可以实 现高效率的裂解，具有应用于DNA测序的价值。与前期工作（申请号：201110331659. 1 ; 201210132695)相比，本发明所陈述的缩酮及缩醛结构的酸敏感可裂解连接单元，在温和 的条件下，具有非常快的断裂速度，应用于DNA测序时，具有更高的效率.并且前期工作 (申请号：201110331659. 1 ;201210132695)中最好的一个连接单元，在DNA测序系统中，需 要在pH为1. 6时，25min才能将连接单元断裂，此时DNA链已经受到了非常明显损伤，所以 这种连接单元是不能真正地用于DNA测序的（具体见实施例29)。而本发明的连接单元， 在室温下，实施例14的可逆终端pH= 2. 88, 3min断裂完全；而实施例24的可逆终端pH= 2. 88, 2min断裂完全；实施例15的可逆终端pH= 2. 88, 5min断裂完全；实施例16的可逆 终端pH= 2. 88,lOmin断裂完全；实施例14的可逆终端pH= 3. 45,lOmin断裂完全；实施 例24的可逆终端，pH= 3. 45,9min断裂完全；实施例15的可逆终端pH= 3. 45,14min断 裂完全；实施例16的可逆终端pH= 3. 45,18min断裂完全；在这两种pH条件下，DNA模板 均无损伤。实施例11、17、18、19、20、21、22的可逆终端，室温下411 = 2.95,3111111断裂完全； pH= 3. 31，lOmin断裂完全。在这两种pH条件下，DNA模板均无任何损伤。
[0007] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
[0008] 第一方面，本发明涉及一种酸敏感连接单元，其结构式如式（I)所示：
[0009]
【权利要求】
1. 一种酸敏感连接单元，其特征在于，其结构式如式（I )所示：
其中R为NH2或N3, m为0?44中任一整数，η为0?44中任一整数； Rp R2均为脂肪族烧基； 或札，R2均为芳香族衍生物； 或札为苯基、萘基、苯基的衍生物、或萘基的衍生物，R2为脂肪族烷基或氢； 或r2为苯基、萘基、苯基的衍生物、或萘基的衍生物，&为脂肪族烷基或氢； 或札、R2构成环己基、环戊基或环丁基。
2. 如权利要求1所述的酸敏感连接单元，其特征在于，所述& = R2 =甲基，m为0? 44中任一整数。
3. 如权利要求1所述的酸敏感连接单元，其特征在于，所述Ri、R2构成环己基，m为-- 44中任一整数。
4. 如权利要求1所述的酸敏感连接单元，其特征在于，所述Ri、R2构成环戊基，m为-- 44中任一整数。
5. 如权利要求1所述的酸敏感连接单元，其特征在于，所述& =苯基，& =甲基，m为 0?44中任一整数。
6. 如权利要求1所述的酸敏感连接单元，其特征在于，所述& =对甲氧基苯基，札= H，R为NH2或N3, m为0?44中任一整数。
7. 如权利要求1所述的酸敏感连接单元，其特征在于，所述凡=4-甲氧基-1-萘基， 札=H，R为NH2或N 3, m为0?44中任一整数。
8. 如权利要求1所述的酸敏感缩酮连接单元，其特征在于，所述& =乙基，& =甲基， R为NH2或N3, m, η为0?44中任一整数。
9. 如权利要求1所述的酸敏感连接单元，其特征在于，所述& = R2 =甲基，R为ΝΗ2或 N3, m = 1，η = 0〇
10. 如权利要求1所述的酸敏感连接单元，其特征在于，所述Ri = 2, 4, 6-三甲氧基苯 基，札=H，R为NH2或N3, m为0?44中任一整数。
11. 一种如权利要求1?10任一项所述的酸敏感连接单元的合成方法，其特征在于，所 述方法包括如下步骤： A、在水和甲醇存在的条件下，碳酸钾和化合物C 反应，得到 R2 R- 化合物D 所述碳酸钾和化合物C的摩尔比为（2. 5?3. 5)： ? 1 ； Β、在三乙胺存在的条件下，化合物TsCl和化合物D反应，得到化合物 R- E H〇^°V^〇X〇^t°^lpTS 所述TsCl和化合物D的摩尔比为1 : (2. 0?4. 0)； C、 在80°C下，NaN3和化合物E反应，得到化合物F I 所述
f NaN3和化合物E的摩尔比为（1. 5?3. 5) : 1 ; D、 在甲醇存在的条件下，Pd/C、氢气和化合物F反应，得到化合物
12. 如权利要求11所述的酸敏感连接单元的合成方法，其特征在于，所述化合物C可通 过包括如下步骤的方法制备而得： A、在浓硫酸存在的条件下，摩尔比为1. 0 : (2. 5?3. 5)的乙酸与化合物Α ηο4^°Ιτ^οη 或化合物A1 反应，得到化合物B
〖化合物B1
;其 中，m为0?44中任一整数，η为0?44中任一整数； Β、在PPTS、5A分子筛存在条件下，化合物Β、Β1和Rl"fRi反应，得到化合物 ΟΜβ
所述--β :PPTS:化合物Β:化合物Β1的摩尔比为 ? 1: (0. 1?0. 5) : (1. 0?1. 5) : (1. 0?1. 5)，且化合物B、B1为等摩尔，所述Rp R2均为脂肪 族烧基。
13. 如权利要求11所述的酸敏感连接单元的合成方法，其特征在于，所述化合物C可通 过包括如下步骤的方法制备而得： 〇 步骤一，在pTSA存在条件下，原甲酸三甲酯与化合物Α 反应生成化合物B，其 K1 R2 中，m为0?44中任一整数，η为0?44中任一整数， 步骤二，在PPTS、5A分子筛存在条件下，化合物Β
Π 乙二醇单乙酸酯反应，得化
合物 < 其中，札=苯基、R2 =甲基，或R2 =苯基、Ri =乙 9 基，或Ri、R2构成环己基、环戊基或环丁基。
14. 如权利要求11所述的酸敏感连接单元的合成方法，其特征在于，所述化合物C可通 过包括如下步骤的方法制备而得： 〇 步骤一，在pTSA、4A分子筛存在条件下，4-甲氧基-1-萘甲醛与化合物A 反应 KI
生成化合物C 其中，m为0?44中任一整数，η为0?44 f 中任一整数；& =对甲氧基苯基、R2 =札或馬=Η、％ = 4-甲氧基-1-萘基。
15. -种如权利要求1所述的酸敏感连接单元在DNA测序中的用途，其特征在于，所述 酸敏感缩酮连接单元与核苷酸及荧光素连接得到可逆终端，所述可逆终端可用于DNA合成 测序。
16. -种可逆终端，其特征在于，所述可逆终端由如权利要求1所述的酸敏感连接单元 与核苷酸及荧光素连接而得。
17. 如权利要求16所述的可逆终端，其特征在于，R为NH2时，所述酸敏感连接单元与 核苷酸及荧光素的连接具体包括如下步骤： A、 所述酸敏感连接单元与TAMRA(5/6)
FITC 荧光素 C:
或荧光素 Cy3. 5
以无水DMF为溶剂，在
HO^ TEA存在的条件下反应，得化合物Η改为化合物TAMRA-0H， 化合物F I T C - 0 F
化合物
Cy5-0H 或化合物Cy3.5-0I
所 述TAMRA(5/6)、FITC、Cy5或Cy3. 5与酸敏感连接单元和TEA的摩尔比为1 : (1?3) : (3? 10); B、 在TEA存在的条件下，化合物TAMRA-0H、化合物FITC-0H、化合物 Cy5-0H或化合物Cy3. 5-0H和DSC反应，得到反应中间体，所述中间体直接与
b dUTP (AP3) dCTP (AP3) dATP (APi
或dGTP (AP3
反应，得到化 合物 dUTP-acid labile linker-TAMRA、dCTP-acid labile linker-FITC、化合物 dATP-acid labile linker_Cy5 或化合物 dGTP-acid labile linker_Cy3. 5 ;所述化合物 TAMRA-OH、 FITC-0H、Cy5-0H 或 Cy3. 5-OH 与 DSC、TEA 和 dUTP (AP3)、dCTP (AP3)、dATP (AP3)或 dGTP (AP3) 的摩尔比为1 : (5?12) : (6?15) : (2?4)。
18. 如权利要求16所述的可逆终端，其特征在于，R为NH2时，所述酸敏感连接单元与 核苷酸及荧光素的连接具体包括如下步骤： A、 所述酸敏感连接单元与TAMRA (5/6)
丨无水DMF为溶剂，在TEA存在 的条件下反应，得化合物Η ;所述TAMRA (5/6)、酸敏感连接单元和TEA的摩尔比为1 : (1? 3) :(3 ?10); B、 在TEA存在的条件下，化合物Η和DSC反应，得到反应中间体，该中间体直接 与dUTP(AP3)
反应，得到化合物K ;所述化合物H、DSC、TEA和 dUTP (AP3)的摩尔比为 1 : (5 ?12) : (6 ?15) : (2 ?4)。
19. 如权利要求16所述的可逆终端，其特征在于，R为N3时，所述酸敏感连接单元与核 苷酸及荧光素的连接具体包括如下步骤： A、所述酸敏感连接单元Y011 在碱性条件下与DSC反应，得 〇 DSC-Y011 化合物，不经分离纯化继续在碱性条件下与dUTP-NH2 反应得YO13化合物
* Β、荧光素 FITC 与丙炔胺反应得化合物 Y01
C、Y013化合物与Y014化合物发生点击化学反应得最终产物可逆终端；
〇
20.如权利要求16所述的可逆终端，其特征在于，R为NH2时，所述酸敏感连接单元与 核苷酸及荧光素的连接具体包括如下步骤： A、 所述酸敏感连接单元与FITC
U无水DMF为溶剂，在TEA存在的条件 下反应，得化合物FITC-Ο?
所述FITC、酸敏感连接 ? 单元和TEA的摩尔比为1 : (1?3) : (3?10); B、 在TEA存在的条件下，化合物FITC-0H和DSC反应，得到反应中间体，该中间体直接 与dCTP(AP3)
反应，得最终产物即可逆终端dCTP-acid labile linker-FITC ;所述化合物 FITC-OH、DSC、TEA 和 dCTP(AP3)的摩尔比为 1 : (5 ?12) : (6 ? 15) : (2 ?4)。
21. 如权利要求16所述的可逆终端，其特征在于，R为NH2时，所述酸敏感连接单元与 核苷酸及荧光素的连接具体包括如下步骤： A、 所述酸敏感连接单元H(
彳荧光素 Cy5
发生亲核取代反 应得到反应产物Cy5-0E
该产物需要用制备HPLC纯化； B、 将上述反应产物Cy5-0H与DSC反应后，不经分离纯化直接与之前合成的 dATP (AP3)
反应得到最终产物即可逆终端dATP-acidlabile Iinker-Cy5,该产物需要用HPLC纯化。
22. 如权利要求16所述的可逆终端，其特征在于，R为NH2时，所述酸敏感连接单元与 核苷酸及荧光素的连接具体包括如下步骤： A、所述酸敏感连接单元
与荧光素 Cy3.5
g生亲核取 代反应得到反应产物Cy3. 5-0H
该产物需要用制备HPLC f 纯化； B、将上述反应产物Cy3.5-0H与DSC反应后，不经分离纯化直接与之前合成的 dGTP (AP3)
反应得到最终产物即可逆终端dGTP-acidlabile Iinker-Cy3. 5,该产物需要用HPLC纯化。
【文档编号】C07C217/12GK104292117SQ201410186697
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年5月5日 优先权日:2013年7月15日
【发明者】沈玉梅, 龚兵, 邵志峰, 赵小东, 刘亚智, 李小卫, 伍新燕, 魏晓飞, 汤道年 申请人:上海交通大学