一种低多聚体的人免疫球蛋白快速生产工艺的制作方法
【专利摘要】一种制备低多聚体的人免疫球蛋白的低温乙醇法快速生产工艺。该工艺的特点有：1）蛋白质分离工序少，两步完成蛋白质分离的操作，第一步分离组分I+Ⅱ+Ⅲ，第二步分离组分Ⅱ；2）整个生产工艺的温度控制，高温工序最高温度不高于35℃；3）最长工艺时间控制，通过控制三个高温工序的工艺时间，融浆投料、低pH病毒灭活及产品包装生产，控制了人免疫球蛋白的多聚体含量，不高于2%。采用本法生产的人免疫球蛋白产品的蛋白纯度高，可达到98%以上，生产工序时间短，蛋白质分离及超滤的时间可在70小时内完成。
【专利说明】一种低多聚体的人免疫球蛋白快速生产工艺
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种人免疫球蛋白的低温乙醇法的快速分离制备工艺，该工艺采用两步蛋白质分离技术，在整个生产工艺的温度控制，最高温度不高于35°c，通过控制三个高温工序的工艺时间，融浆投料、低PH病毒灭活及产品包装生产，控制了人免疫球蛋白的多聚体含量，不高于2%。
【背景技术】
[0002]人免疫球蛋白是从上千位健康献浆员的合格血浆中提取的一种由人体免疫系统受抗原刺激后产生的免疫物质所制成的生物制剂，含有广谱抗病毒、细菌或其他病原体的IgG抗体，能迅速提高受者血液中IgG水平，增强机体的抗感染能力和免疫调节功能。
[0003]人免疫球蛋白的主要成分为球蛋白(IgG)，IgG由2条轻链和2条重链通过二硫键结合组成。高温及蛋白酶类处理容易引起IgG聚合或降解，产生高分子聚合物和蛋白片断。蛋白片断不会引起严重不良反应。欧洲药典和中国药典等都未直接规定IgG片断的含量。但大量多聚合物会引起严重的不良反应，甚至死亡。
[0004]温度对人免疫球蛋白质量的影响是明显的，主要是通过形成多聚体而影响蛋白活性及产品质量的。液体的人免疫球蛋白(包括静注人免疫球蛋白、人免疫球蛋白、特种人免疫球蛋白在内)在4°C的稳定性已通过了注册验证，通常在3年内是稳定的。但当温度升高(25-35°C)，随着存放时间的延长，将会产生裂解片段，这些裂解片段通常不会引起严重副反应。37°C孵放7天或45°C以上温度孵放I天，免疫球蛋白将形成聚合体和裂解片断；60°C以上高温使免 疫球蛋白快速聚合，形成大量二聚体或多聚合体，使生物学活性及部分理化性质明显降低和改变，生物学活性受到严重影响，小鼠异常毒性试验出现严重不良反应；100°C水浴30min时，形成大量高分子聚合体，生物学活性丧失，小鼠异常毒性试验动物死亡。动物出现严重不良反应与多聚体的量直接相关。邱芳、吴泽良、李育琼等的研究也得出了多聚体的含量与温度相应的时间有关，当多聚体含量达到80%，可致家兔死亡。
[0005]目前，有大量的人免疫球蛋白分离制备的工艺研究，不乏是低温乙醇分离法或者是其与层析法结合的技术，或者强调了两步病毒去除/灭活的运用。这些研究都从不同层面增加了人免疫球蛋白的生产工序的复杂程度，延长了产品生产的工艺时间，产品的纯度、质量得不到保证，对产品的质量关注程度不够。为此，建立一种快速的、有质量保证的人免疫球蛋白分离制备工艺很为重要。
【发明内容】
[0006]发明人在广泛关注低温乙醇法蛋白质分离技术的产业化应用的同时，也关注了人免疫球蛋白产品生产过程中的质量控制技术，确保工艺温度和工艺时间的严格控制，确保产品的质量，主要表现是控制人免疫球蛋白多聚体的含量不超过2%，确保产品不会因为多聚体的含量偏高而出现不良反应或者副作用。[0007]结合人免疫球蛋白稳定性、不良反应、蛋白结构特性的研究，为了确保人免疫球蛋白的产品质量，本发明采用了三个方面的特征性的工艺控制手段:
1)采用两步蛋白质分离技术，蛋白质分离工序少，两步完成蛋白质分离的操作，第一步分离组分I+ II +III，第二步分离组分II ；
2)整个生产工艺的温度控制，高温工序的最高温度不高于35°C；
3)最长工艺时间控制，通过控制三个高温工序的工艺时间，融浆投料、低pH病毒灭活及产品包装生产，控制了人免疫球蛋白的多聚体含量，不高于2%。控制蛋白质分离及超滤配制的工艺时间为70小时左右。
[0008]在上述三个特征性步骤的基础上，本发明的人免疫球蛋白的生产过程包括:融浆投料、制备组分I+ II +II1、制备组分I+II1、制备组分I1、纯化组分I1、超滤与配制、低PH病毒灭活、二次超滤配制、灌装即得。
[0009]I)融浆投料，温度不高于35°C，持续时间不超过4小时。
[0010]2)制备组分I+ II + III的工艺参数为:pH为6.5至7.8、乙醇含量为15%至24%、温度控制为-6.(TC至-2.5°C，蛋白质浓度范围为:4.0%至7.8%。
[0011]3)制备组分I+ III，将上述组分I+ II + III用8-14倍体积的注射用水溶解，调节参数为:pH为5.0至5.6、乙醇含量为15%至24%、温度控制为-1.(TC至4.5°C，静置时间2至24小时。
[0012]4)制备组分II，以上述分离组分I+III的上清液为原料，按照每I升体积加入10-25mL lmol/L的氯化钠溶液调节离子强度，工艺参数为:pH为7.0至7.8、乙醇含量为25%至34%、温度控制为-10.(TC至-5.5°C，静置时间2至24小时。
[0013]5)纯化组分II，以上述制备分离的组分II为原料，用8-14倍的注射用水溶解，调节溶解所得的溶液PH为3.5至4.8。分离除去杂蛋白、硅藻土等，得人免疫球蛋白溶液。
[0014]6)超滤与配制，用分子截流量为50kD的超滤膜，超滤浓缩，以注射用水连续超滤6-10次。超滤完成后，用注射用水调配蛋白溶液，使其蛋白质含量为应为52±10g/L，并调节pH为3.5至4.8。
[0015]7)低pH病毒灭活，将经除菌过滤并密封好的人免疫球蛋白置于恒温为23_25°C条件下，静置21天。每7天取样I次，测定pH和蛋白质含量，应无明显变化。。
[0016]8) 二次超滤配制，低pH病毒灭活完成后，对蛋白质溶液进行二次超滤，调节蛋白质的体积。按照终体积的10%加入麦芽糖，确保蛋白质含量不低于50克/L，调节pH至适当范围。用无菌操作工艺灌装-轧盖即得。
[0017]本发明的人免疫球蛋白生产工艺适用于生产的产品品种包括有:人免疫球蛋白、乙型肝炎人免疫球蛋白、破伤风人免疫球蛋白、狂犬病人免疫球蛋白、巨细胞病毒人免疫球蛋白、带状疱疹人免疫球蛋白、Ro (D)人免疫球蛋白、静注人免疫球蛋白(pH4)。
[0018]技术收益
采用本发明的生产方法，可以获得如下的收益:
1)本发明有效的控制了工艺时间，生产工序时间短，蛋白质分离及超滤的时间可在70小时内完成；
2)通过温度控制、工 艺时间的控制，控制了人免疫球蛋白的多聚体含量，不高于2%；
3)采用本法生产的人免疫球蛋白产品的蛋白纯度高，可达到98%以上，满足中国药典的技术指标的要求。
[0019]实施实例
实施例1:以人血浆为原料的人免疫球蛋白的制备 O融浆投料，温度不高于35°c，持续时间为1-3小时；
2)制备组分I+II + III的工艺参数为:pH为7.2、乙醇含量为19%、温度控制为-3.(TC，蛋白质浓度范围为5.8%；
3)制备组分I+III，将2)步骤分离得到的组分I+II +III用12倍体积的注射用水溶解，调节参数为:pH为5.0、乙醇含量为23%、温度控制为2.5°C，静置时间2小时；
4)制备组分II，以3)步骤分离组分I+III后的上清液为原料，按照每I升体积加入22mL lmol/L的氯化钠溶液调节离子强度，工艺参数为:pH为7.6、乙醇含量为28%、温度控制为-9.5°C，静置时间2小时；
5)纯化组分II，以上述4)步骤制备分离的组分II为原料，用14倍的注射用水溶解，调节溶解所得的溶液pH为3.8。分离除去杂蛋白、硅藻土，得人免疫球蛋白溶液；
6)超滤与配制，用分子截流量为50kD的超滤膜，超滤浓缩，以注射用水连续超滤10次。超滤完成后，用注射用水调配蛋白溶液，使其蛋白质含量为应为52g/L,并调节pH为4.3 ；
7)低pH病毒灭活，将经除菌过滤并密封好的人免疫球蛋白置于恒温为23-25°C条件下，静置21天。每7天 取样I次，测定pH和蛋白质含量，应无明显变化；
8)二次超滤配制，低pH病毒灭活完成后，对蛋白质溶液进行二次超滤，调节蛋白质的体积。按照终体积的10%加入麦芽糖，确保蛋白质含量不低于50克/L，调节pH为7.2。用无菌操作工艺灌装-轧盖即得。
[0020]实施例2:以人血浆为原料的静注人免疫球蛋白(pH4)的制备 O融浆投料，温度不高于35°C，持续时间60-80分钟；
2)制备组分I+II +III的工艺参数为:pH为7.2、乙醇含量为18%、温度控制为-3.0°C°C,蛋白质浓度范围为5.8%；
3)制备组分I+III，将上述2)步骤分离得到的组分I+II +III用12倍体积的注射用水溶解，调节参数为PH为5.1、乙醇含量为20%、温度控制为-0.2°C，静置时间2小时；
4)制备组分II，以上述3)步骤分离组分I+III后的上清液为原料，按照每I升体积加入24mL lmol/L的氯化钠溶液调节离子强度，工艺参数为pH为7.2、乙醇含量为28%、温度控制为-9.(TC至-7.5°C，静置时间2小时；
5)纯化组分II，以上述4)步骤制备分离的组分II为原料，用12倍的注射用水溶解，调节溶解所得的溶液pH为4.0。分离除去杂蛋白、硅藻土等，得人免疫球蛋白溶液；
6)超滤与配制，用分子截流量为50kD的超滤膜，超滤浓缩，以注射用水连续超滤10次。超滤完成后，用注射用水调配蛋白溶液，使其蛋白质含量为应为52g/L,并调节pH为4.0 ;
7)低pH病毒灭活，将经除菌过滤并密封好的人免疫球蛋白置于恒温为23-25°C条件下，静置21天。每7天取样I次，测定pH和蛋白质含量，应无明显变化；
8)二次超滤配制，低pH病毒灭活完成后，对蛋白质溶液进行二次超滤，调节蛋白质的体积。按照终体积的10%加入麦芽糖，确保蛋白质含量不低于50克/L，调节pH为4.0。用无菌操作工艺灌装-轧盖即得。
[0021]实施例3:以组分I+ II + III为原料的人免疫球蛋白的制备1)制备组分I+III，将组分I+II +III用12倍体积的注射用水溶解，调节pH为5.1、乙醇含量为24%、温度控制为1.5°C，静置时间2小时；
2)制备组分II，以I)步骤分离组分I+III后的上清液为原料，按照每I升体积加入21mLlmol/L的氯化钠溶液调节离子强度，调节pH为7.4、乙醇含量为26%、温度控制为-9.5°C,静置时间2小时；
3)纯化组分II，以上述2)步骤制备分离的组分II为原料，用10倍的注射用水溶解，调节溶解所得的溶液pH为3.8。分离除去杂蛋白、硅藻土等，得人免疫球蛋白溶液；
4)超滤与配制，用分子截流量为50kD的超滤膜，超滤浓缩，以注射用水连续超滤10次。超滤完成后，用注射用水调配蛋白溶液，使其蛋白质含量为应为55g/L,并调节pH为3.8 ;
5)低pH病毒灭活，将经除菌过滤并密封好的人免疫球蛋白置于恒温为23-25°C条件下，静置21天。每7天取样I次，测定pH和蛋白质含量，应无明显变化；
6)二次超滤配制，低pH病毒灭活完成后，对蛋白质溶液进行二次超滤，调节蛋白质的体积。按照终体积的10%加入麦芽糖，确保蛋白质含量不低于50克/L，调节pH为7.2。用无菌操作工艺灌装-轧盖即得。 [0022]实施例4:以组分I+ II + III为原料的静注人免疫球蛋白(pH4)的制备
1)制备组分I+III，将组分I+II +III用12倍体积的注射用水溶解，调节参数为pH为5.1、乙醇含量为20%、温度控制为1.2°C，静置时间2小时；
2)制备组分II，以上述I)步骤分离组分I+III后的上清液为原料，按照每I升体积加入24mL lmol/L的氯化钠溶液调节离子强度，调节为pH为7.0、乙醇含量为28%、温度控制为-9.(TC至-7.5°C，静置时间2小时；
3)纯化组分II，以上述2)步骤制备分离的组分II为原料，用12倍的注射用水溶解，调节溶解所得的溶液PH为4.0。分离除去杂蛋白、硅藻土，得人免疫球蛋白溶液；
4)超滤与配制，用分子截流量为50kD的超滤膜，超滤浓缩，以注射用水连续超滤10次。超滤完成后，用注射用水调配蛋白溶液，使其蛋白质含量为应为56g/L,并调节pH为4.0 ；
5)低pH病毒灭活，将经除菌过滤并密封好的人免疫球蛋白置于恒温为23-25°C条件下，静置21天。每7天取样I次，测定pH和蛋白质含量，应无明显变化；
6)二次超滤配制，低pH病毒灭活完成后，对蛋白质溶液进行二次超滤，调节蛋白质的体积。按照终体积的10%加入麦芽糖，确保蛋白质含量不低于50克/L，调节pH为4.0。用无菌操作工艺灌装-轧盖即得。
【权利要求】
1.一种低多聚体的人免疫球蛋白快速生产工艺，其特征在于该工艺的特点有: 1)蛋白质分离工序少，两步完成蛋白质分离的操作，第一步分离组分I+II +III，第二步分离组分II ； 2)整个生产工艺的温度控制，高温工序最高温度不高于35°C； 3)最长工艺时间控制，通过控制三个高温工序的工艺时间，融浆投料、低pH病毒灭活及产品包装生产，控制了人免疫球蛋白的多聚体含量，不高于2%。
2.按权利要求1所述的一种低多聚体的人免疫球蛋白快速生产工艺，其特征在于人免疫球蛋白的制备步骤为:融浆投料、制备组分I+ II +II1、制备组分I+II1、制备组分I1、纯化组分I1、超滤与配制、低PH病毒灭活、二次超滤配制、灌装即得； O融浆投料，温度不高于35°C，持续时间不超过4小时； 2)制备组分I+II + III的工艺参数为:pH为6.5至7.8、乙醇含量为15%至24%、温度控制为-6.(TC至-2.5°C，蛋白质浓度范围为:4.0%至7.8% ； 3)制备组分I+III，将上述组分I+II +III用8-14倍体积的注射用水溶解，调节参数为:pH为5.0至5.6、乙醇含量为15%至24%、温度控制为-1.(TC至4.5°C，静置时间2至24小时； 4)制备组分II，以上述分离组分I+III的上清液为原料，按照每I升体积加入10-25mLlmol/L的氯化钠溶液调节离子强度，工艺参数为:pH为7.0至7.8、乙醇含量为25%至34%、温度控制为-10.(TC至-5.5°C，静置时间2至24小时； 5)纯化组分II，以上述制备分离的组分II为原料，用8-14倍的注射用水溶解，调节溶解所得的溶液pH为3.5至4.8 ;分离除去杂蛋白、硅藻土等，得人免疫球蛋白溶液； 6)超滤与配制，用分子截流量为50kD的超滤膜，超滤浓缩，以注射用水连续超滤6-10次；超滤完成后，用注射用水调配蛋白溶液，使其蛋白质含量为应为52± 10g/L，并调节pH为 3.5 至 4.8 ; 7)低pH病毒灭活，将经除菌过滤并密封好的人免疫球蛋白置于恒温为23-25°C条件下，静置21天；每7天取样I次，测定pH和蛋白质含量，应无明显变化； 8)二次超滤配制，低pH病毒灭活完成后，对蛋白质溶液进行二次超滤，调节蛋白质的体积；按照终体积的10%加入麦芽糖，确保蛋白质含量不低于50克/L，调节pH至适当范围；用无菌操作工艺灌装-轧盖即得。
3.按权利要求1，本工艺适用于生产的产品品种包括有:人免疫球蛋白、乙型肝炎人免疫球蛋白、破伤风人免疫球蛋白、狂犬病人免疫球蛋白、巨细胞病毒人免疫球蛋白、带状疱疹人免疫球蛋白、Ro (D)人免疫球蛋白、静注人免疫球蛋白(pH4)。
【文档编号】C07K1/30GK103980345SQ201410189936
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年5月7日 优先权日:2014年5月7日
【发明者】石正国, 张庭喜, 孔维权, 王连群, 吕绍玉, 朱瑞芳, 金三中 申请人:贵州中泰生物科技有限公司