一种烟草镉转运基因NtHMA2及其克隆方法与应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了烟草镉转运基因NtHMA2及其克隆方法与应用，烟草镉转运基因NtHMA2核苷酸序列如SEQID：No.1所示，编码的氨基酸序列如SEQID：No.2所示。本发明还公开了烟草镉转运基因NtHMA2的克隆方法，具体步骤包括：A、确定NtHMA2基因序列；B、提取烟草RNA，反转录得到第一链cDNA；C、根据NtHMA2基因序列设计合成特异性引物，以cDNA作为模板，进行PCR扩增；D、回收和纯化PCR产物；E、纯化产物与载体连接，转化感受态细胞；F、筛选阳性克隆，对阳性克隆PCR扩增、测序。通过调控烟草镉转运基因NtHMA2的表达，可降低镉从烟草根部转运到叶片的转运率，从而降低烟叶的铬含量，为生产绿色优质烟叶提供了基因资源。
【专利说明】一种烟草镉转运基因NtHMA2及其克隆方法与应用
【技术领域】
[0001]本发明属于遗传工程【技术领域】，具体涉及烟草镉转运基因NtHMA2及其克隆方法与应用。
【背景技术】
[0002]烟草0Vicoiia/?a iaAacw?)是重要的经济作物,是爺科一年生草本植物。烟草属大约有60多种。重金属镉是烟草生长的非必须元素，但容易被吸收，并且通过食物链对人体产生危害。镉随水灌溉和污泥进入土壤中，被土壤吸附的镉一般在(Tl5cm的表层土壤中积累。土壤中过量的镉，不仅能在烟草体内残留，而且也会对烟草的生长发育起明显的危害作用，破坏叶绿体结构，降低叶绿素含量，叶片发黄，光合过程的减弱，生长缓慢，植株矮小，根系受到抑制，生长受阻，产量下降。镉污染对烟草种子出苗、烟草光合特性、烟草体内矿质元素含量、烟草组织结构、烟草酶活性、烟草生长量和烟叶品质均有较大影响。
[0003]Cd2+的吸收主要是通过一些对Cd2+具有低亲和性的多底物金属离子转运蛋白或通道蛋白进入植物细胞内。例如，小麦的LCTI蛋白在酿酒酵母中表达能够介导Cd2+流入细胞内，并使酵母细胞对Cd2+高度敏感，这种Cd2+高度敏感性可能是由于LCTI蛋白对Cd2+吸收所造成的。另外，金属转运蛋白的Nramp家族也具有能够将Cd2+转运至植物细胞内的功能。酿酒酵母Nramp家族成员SMFl和SMF2蛋白不但能够转运Mn2+而且能够转运Cu2+、Co2+和Cd2+。目前研究表明 ，镉元素从地下部向地上部的转运是借助于膜转运蛋白进行的，例如Pib型ATPase亚家族成员HMA。HMA蛋白家族可以根据转运功能分为两类，即Cu/Ag转运泵和Zn/Cd/Co/Pb转运泵。拟南芥AtHMA2蛋白属于Zn/Cd/Co/Pb转运泵。
[0004]国际上一些知名烟草公司和研究机构正采用生物技术和基因工程技术对烟草品种进行改良，以提高烟草对镉的抗性，减少烟草对土壤镉的吸收和转运。目前，我国也提出了无公害优质烟的开发计划，为烟草重金属危害的研究提供了新的契机。随着烟草镉污染研究的深入，必将使我国烟草镉污染控制迈上了新的台阶，为我国烟叶的健康和可持续发展奠定基础。因此，开发一种利用生物技术手段降低烟草镉转运率(叶片镉含量/根镉含量)的候选基因，通过基因操作减少烟叶镉含量是非常必要的。
【发明内容】
[0005]本发明的第一目的在于提供一种烟草镉转运基因NtHMA2 ;本发明的第二目的在于提供所述烟草镉转运基因NtHMA2的克隆方法；本发明的第三目的在于提供所述烟草镉转运基因NtHMA2的应用。
[0006]本发明的第一目的是这样实现的，所述的烟草镉转运基因NtHMA2核苷酸序列为SEQ ID:N0.1 所示。
[0007]本发明的第二目的是这样实现的，所述烟草镉转运基因NtHMA2的克隆方法包括以下步骤:
A、确定NtHMA2基因序列；B、提取烟草RNA，反转录得到第一链cDNA；
C、根据NtHMA2基因序列设计合成特异性引物，以cDNA作为模板，进行PCR扩增；
D、回收和纯化PCR产物；
E、纯化产物与载体连接，转化感受态细胞；
F、筛选阳性克隆，对阳性克隆PCR扩增、测序。
[0008]本发明的第三目的是这样实现的，所述的烟草镉转运基因NtHMA2用于降低镉从烟草根部转运到烟叶的转运率。
[0009]本发明利用RACE技术从烟草中得到一个烟草镉转运基因NtHMA2，具体步骤为:利用同源基因拟南芥At HMA2序列搜索NCBI烟草EST数据库，得到烟草NtHMA2的EST序列(NCBI号:FG135138.1);利用此序列比对烟草基因组数据库(行业内部数据库)，获得一个基因序列(Nsyl0129220)，根据此序列设计RACE引物，RACE利用试剂盒Clontech SmartRACE cDNA Amplification Kit进行，反应参考试剂盒说明书；3’端扩增到600bp左右的片段，5’端扩增到500bp左右的片段；目标片段回收后进行测序，并与核心序列拼接获得NtHMA2全长cDNA序列，设计基因特异引物进行PCR反应，得到目的产物；对目的产物测序，得到NtHMA2基因序列；利用农杆菌介导的遗传转化方法获得NtHMA2基因的过表达和RNAi植株，对NtHMA2进行功能验证，结果表明NtHMA2基因具有将镉从烟草根部转运到叶片的功能。NtHMA2基因的发现 ，为通过调控基因的表达，控制烟叶重金属镉含量，为生产绿色优质烟叶提供了基因资源。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1为利用引物对NtHMA2F/NtHMA2R扩增财.之基因结果，扩增产物4242bp ；
图2为pBI121-NtHMA2载体PCR鉴定，所用引物对为NtHMA2F/NtHMA2R，扩增产物为
4242bp ；
图3为pBI121-NtHMA2载体酶切鉴定，利用BamHI和SacI双酶切，可以获得4000bp左右的目的条带；
图4为基因RNAi载体片段PCR扩增结果，所用引物对为HMARNAiF/HMARNAiR，扩增产物为369bp ；
图5为RNAi载体pBI121-pQL1-NtHMA2的酶切验证，XbalI和SacI双酶切后可以将1500bp左右的反向重复单元切下；
图6为NtHMA2 RNAi烟草植株镉转移率，Vector Control为转空载体对照，其余为转基因植株；
图7为过表达烟草植株镉转移率，Vector Control为转空载体对照，其余为转基因植株。
【具体实施方式】
[0011]下面结合附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
[0012]本发明所述的烟草镉转运基因NtHMA2核苷酸序列为SEQ ID:N0.1所示，编码的氨基酸序列为SEQ ID:N0.2所不。[0013]所述的烟草镉转运基因NtHMA2来源于林烟草。
[0014]本发明所述所述的烟草镉转运基因NtHMA2的克隆方法，包括以下步骤:
A、确定NtHMA2基因序列；
B、提取烟草RNA，反转录得到第一链cDNA；
C、根据NtHMA2基因序列设计合成特异性引物，以cDNA作为模板，进行PCR扩增；
D、回收和纯化PCR产物；
E、纯化产物与载体连接，转化感受态细胞；
F、筛选阳性克隆，对阳性克隆PCR扩增、测序。
[0015]所述的步骤A包括如下步骤:(1)利用同源基因拟南芥At HMA2序列搜索NCBI烟草EST数据库，得到烟草NtHMA2的EST序列(NCBI号:FG135138.1) ; (2)利用此序列比对烟草基因组数据库(行业内部数据库)，获得一个基因序列(Nsyl0129220)，根据此序列设计RACE 引物;(3)RACE 利用试剂盒 Clontech Smart RACE cDNA Amplification Kit 进行，反应参考试剂盒说明书；3'端扩增到50(T700bp左右的片段，5'端扩增到40(T600bp左右的片段；(4)目标片段回收后进行测序，并与核心序列拼接获得NtHMA2全长cDNA序列，设计基因特异引物进行PCR反应，得到目的产物；对目的产物测序，得到NtHMA2基因序列；其中，步骤(2)所述的RACE基因特异引物为:
3' RACE 基因特异引物:5' -AGAAACTGCTCATTGTGACAGCACA-3'；
5' RACE 基因特异引物:5' -CAACTGCAACAGCTGCAAGTGCTA-3'
所述步骤C的特异性引物为:
正向引物 NtHMA2F: 5' -TCTTCTCCTCCTCCTTAGAGAAG-3'；
反向引物 NtHMA2R: 5' -CTACTCTATGACAATTTCTGATA-3'。
[0016]所述烟草镉转运基因NtHMA2的应用，主要通过调控该基因的表达，降低镉从烟草根部转运到烟叶的转运率，从而降低烟叶中重金属镉的含量。
[0017]所述的降低镉从烟草根部转运到烟叶的转运率的方法包括如下步骤:
A、构建RNAi载体；
B、农杆菌转化；
C、RNAi载体导入烟草；
D、培养转基因植株。
[0018]本发明的工作原理为利用RACE技术从烟草中得到一个烟草镉转运基因NtHMA2序列，具体步骤为:利用同源基因拟南芥At HMA2序列搜索NCBI烟草EST数据库，得到烟草NtHMA2的EST序列(NCBI号:FG135138.1);利用此序列比对烟草基因组数据库(行业内部数据库)，获得一个基因序列(Nsyl0129220)，根据此序列设计RACE引物，RACE利用试剂盒Clontech Smart RACE cDNA Amplification Kit进行，反应参考试剂盒说明书；3'端扩增至Ijeoobp左右的片段，5'端扩增到500bp左右的片段；目标片段回收后进行测序，并与核心序列拼接获得NtHMA2全长CDNA序列，设计基因特异引物进行PCR反应，得到目的产物；对目的产物测序，得到NtHMA2基因序列，再对基因NtHMA2进行克隆，构建重组载体，利用农杆菌介导的遗传转化方法获得NtHMA2基因的过表达和RNAi植株，对NtHMA2进行功能验证，结果表明NtHMA2基因具有将镉从烟草根部转运到叶片的功能。理论上，可通过调控NtHMA2基因的表达，控制烟叶重金属镉含量，为生产绿色优质烟叶提供了基因资源。[0019]与现有技术相比，本发明具有以下优点和效果:
1、基因的克隆，为降低烟叶镉含量分子育种提供新的基因资源，该基因资源的开发利用有利于生产低镉含量烟草和实现绿色优质烟叶的开发。
[0020]2、通过农杆菌介导的遗传转化方法获得该基因过表达和抑制表达的转基因植株，经生物学功能验证，表明本发明克隆的基因具有将镉从烟草根部转运到叶片的功倉泛。
[0021]实施例1——基因的分离克隆
利用同源基因拟南芥At HMA2序列搜索NCBI烟草EST数据库，得到烟草NtHMA2的EST序列，具体步骤为:利用同源基因拟南芥At HMA2序列搜索NCBI烟草EST数据库，得到烟草NtHMA2的EST序列(NCBI号:FG135138.1);利用此序列比对烟草基因组数据库(行业内部数据库)，获得一个基因序列(Nsyl0129220)，根据此序列设计RACE引物，RACE利用试剂盒Clontech Smart RACE cDNA Amplification Kit进行，反应参考试剂盒说明书；3'端扩增至Ijeoobp左右的片段，5'端扩增到500bp左右的片段；目标片段回收后进行测序，并与核心序列拼接获得NtHMA2全长CDNA序列，设计基因特异引物进行PCR反应，得到目的产物；对目的产物测序，得到NtHMA2基因序列；其中，RACE特异性引物为:
3' RACE 基因特异引物:5' -AGAAACTGCTCATTGTGACAGCACA-3'；
5' RACE 基因特异引物:5' -CAACTGCAACAGCTGCAAGTGCTA-3' 测序得到新基因NtHMA2，其核苷酸序列为SEQ ID N0.1所示，其中131~4342 bp为该基因的编码区，包含4212bp的开放阅读框；编码1404个氨基酸，如序列表SEQIDN0.2所示。
[0022]提取林烟草根部RNA,抽提使用Trizol试剂盒(Invitrogen,按该试剂盒提供的说明书操作)。
[0023]取2 yg RNA进行反转录，利用 PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser(TAKARA)试剂盒进行基因组DNA去除并反转录(按试剂盒操作手册操作)。
[0024]将反转录得到的第一链cDNA作为模板，用于PCR扩增NtHMA2基因全长，并设计特性行引物如下:
正向引物:NtHMA2F:5' -TCTTCTCCTCCTCCTTAGAGAAG-3'；
反向引物:NtHMA2R: 5' -CTACTCTATGACAATTTCTGATA-3'。
[0025]PCR 反应体系为 50μ L，包括:200ng cDNA，I XPhusion HF 反应缓冲液，IOmMdNTP, 2U 的 Phusion? High-Fidelity DNA Polymerase,上述引物各 I μ M。PCR 反应在MastercycIer? pro (Eppendorf,德国)扩增仪上进行，反应程序为:98°C, 30 秒；98°C, 10秒，60°C，20秒，72°C，2分钟，40个循环;72°C延伸7分钟。
[0026]产物经1% (g/mL)的琼脂糖凝胶电泳分离，扩增结果产生一条单一 PCR条带，见图1。用QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN,德国)回收扩增条带,提取步骤参照试剂盒使用说明。回收纯化的DNA与Τ0Ρ0载体(Invitrogen ZERO Blunt T0P0 RCR Cloning kit)连接，按说明书操作。连接产物利用热激法转化大肠杆菌DH5，在含有50mg/L卡那霉素的LB固体平板中筛选阳性克隆，挑取5个克隆测序(大连宝生物工程有限公司)。
[0027]测序结果表明NtHMA2基因的全长为4489bp，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示，通过测序、比对确定是本发明需要的目的基因， 申请人:将该基因命名为NtHMA2。NtHMA2基因包括4212bp的开放阅读框；编码1404个氨基酸。推导的NtHMA2基因的氨基酸序列与拟南芥AtHMA2具有73%的相似性。
[0028]实施例2——植物转化载体构建
(I)过表达载体构建
根据pBI121载体序列酶切位点，利用Primer Premier5.0软件设计出构建NtHMA2基因过表达的引物对，其序列如下所示:
Forward primer:5/ -GGGTGGATCCTCTTCTCCTCCTCCTTAGAGAAG-3;
Reverse primer:5/ -TAATGAGCTCCTACTCTATGACAATTTCTGATA-3;
下划线所示为酶切位点。
[0029]以基因阳性克隆DNA为模板进行PCR扩增。PCR扩增体系激扩增程序同实例I。双酶切体系:反应总体积为40 μ L，含PCR纯化后的产物10 μ L，10ΧΝΕΒ Bufferl.14 μ L7BamHI和SacI各2 μ L，灭菌双蒸水22 μ L。37°C酶切过夜后纯化。pBI121载体的双酶切体系:反应总体积为40μ L，含纯化的pBI121质粒DNA IOyL, 10ΧΝΕΒ Bufferl.1 4μ L,BamHI和SacI各2 μ L，灭菌双蒸水22 μ L。37°C酶切过夜后纯化。
[0030]连接反应体系中NtHMA2基因与pBI121载体的摩尔比为5:1，反应总体积为
10μ L，其中:10Χ连接Buffer I μ L, T4 DNA连接酶I μ L，NtHMA2基因双酶切片段6 μ L，pBI 121载体双酶切片 段2 μ L。16°C连接过夜，连接产物转化大肠杆菌菌种DH5a。
[0031]在含有卡那霉素(50mg/L)的LB固体培养基上筛选阳性克隆，抽提质粒后进行PCR(图2)及酶切鉴定(图3)。构建的载体命名为pBI121-NtHMA2。
[0032](2)抑制表达(RNAi)载体构建
以PQLi载体为中间载体，PBI121为表达载体构建LJ?基因的RNAi载体，构建引物
为:
HMARNAiF:CATTCTAGAGAGCTCGGATCC GAATCAAGCAAGATTAGAAGCA
HMARNAiR: TCAACTAGTGATATCCTCGAGAGTGATGACATAGCAGCAGT
HMARNAiF中下划线分别为Xbal，SacI, BamHI酶切位点；HMARNAiR中下划线分别为SpeI，EcoRV酶切位点。
[0033]以基因阳性克隆DNA为模板进行PCR扩增(结果见图4)。PCR扩增体系激扩增程序同实例I。NtHMA2基因RNAi正向片段与pQLi载体连接:利用BamHI和EcoRV分别双酶切纯化的PCR产物和pQLi载体，反应体系同过表达载体的构建。酶切后回进行回收纯化并进行连接。连接反应体系中RNAi正向片段和pQLi的摩尔比为5:1，反应程序同过表达载体构建部分。连接产物转化大肠杆菌菌种DH5 α后提取质粒进行酶切鉴定。NtHMA2基因RNAi反向片段与连接有正向片段的pQLi载体连接=SacI和SpeI分别双酶切RNAi反向片段与连接有正向片段的PQLi载体，酶切后回收纯化并进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5a细胞，转化子抽提后进行酶切验证。构建的中间载体命名为pQL1-HMA2。
[0034]利用XbaI和SacI分别双酶切pBI121和pQLi_HMA2载体，回收pBI121大片段和pQL1-HMA2载体酶切后1000bp左右的片段，进行连接。连接后转化大肠杆菌DH5 α，抽提质粒进行酶切验证(图5)，程序同上。构建的载体命名为pBI121-pQL1-NtHMA2。
[0035]实施例3——烟草的遗传转化
(I)表达载体转化农杆菌
利用冻融法(参照萨姆布鲁克，拉塞尔著，黄培堂等译，《分子克隆实验指南》第三版，科学出版社,2002年)将重组载体pBI121-NtHMA2和pBI121-pQLi_NtHMA2转入农杆菌军中GV3101。
[0036]从-80°C冰箱中取出3管农杆菌感受态细胞，冰上溶解，分别加入重组表达载体pBI121-NtHMA2、pBI121_pQLi_NtHMA2 和 pBI121 空载体。
[0037] 将以上混合物放入液氮速冻I分钟，转入37°C水浴5分钟。
[0038]相混合物中加入ImL LB培养基，28°C，220rpm培养3~4小时。
[0039]培养物涂布于含有卡那霉素(50mg/L)和利福平(25mg/L)的LB固体培养基上，28°C倒置培养2~3天。可见含有目的载体的克隆。
[0040](2)烟草转化
挑取含有目标载体的农杆菌在含有卡那霉素和利福平的LB平板上划线，28 °C培养2~3天。
[0041]刮取划线菌斑接菌于含有卡那霉素和利福平的MS培养基中，28°C，220rpm震荡培养，菌液浓度达到OD=0.5~0.8时进行侵染。
[0042]将菌体收集到离心管中，6，OOOrpm离心分钟富集菌体，弃上清，再用约20ml液体
MS培养基重悬菌体。
[0043]将叶片置于500mL广口瓶中，加入适量70%乙醇，漂洗lmin。；倒掉乙醇，加入
0.1% HgCl2溶液(称取升汞0.1克，用少许酒精溶解，再加水至100毫升)，置摇床上室温振荡15~30分钟；倒掉溶液，用无菌水冲洗6遍；将叶片取出，用灭菌吸水纸洗去表面液体，取无菌叶片用剪刀切成IcmX Icm的小片，将切成小片的植物叶片放入无菌MS液体培养基悬浮的菌液中，静置15~20min。
[0044]取出材料，用无菌滤纸吸去多余菌液，于共培养培养基中(MS+6-BA 1.0mg/L +NAA 0.lmg/L )，25°C暗培养两天。
[0045]把材料转入分化培养基中(MS+6-BA1.0mg/L+NAA 0.lmg/L+Kan 200mg/L + Carb(羧苄青霉素钠)500mg/L),切口接触培养基，于温室中分化培养，每2-3周将其转移到新的培养基中。切口处逐渐长出愈伤组织，最后分化出芽。
[0046]将长至3~5cm的芽切下，转入生根培养基(MS)诱导生根。
[0047]生根后的转基因植株由生根培养基中取出，用自来水净培养基，移植于灭菌的营养土中。
[0048]转基因植株经NPTII基因特异引物PCR验证扩增，鉴定转基因阳性植株。
[0049]实施例4——转基因植株镉吸收试验
转基因植株移栽到一次性花盆后，置于育苗池中，育苗池内IOcm左右含的水(含4ppm氯化镉)。
[0050]生长30天后，取转基因植株叶片和根，60°C烘干，测定镉含量，计算转基因植株镉转移率(叶片镉含量/根镉含量)，结果见图6、图7。RNAi植株NtHMA RNAi_6、NtHMARNA1-4KNtHMA RNA1-43镉转移率比空载体对照Vector Control降低50%以上。NtHMA2过表达植株 NtHMA20E-5、NtHMA20E_6、NtHMA20E-19 镉转移率比空载体对照 Vector Control提高2倍以上，尤其NtHMA20E-19比对照提高5倍以上。上述结果表明，NtHMA2基因负责烟草镉从根部向叶片的运输。通过对该基因的遗传操作，可以降低烟草叶片镉含量。
【权利要求】
1.一种烟草镉转运基因NtHMA2，其特征在于所述的烟草镉转运基因NtHMA2核苷酸序列如SEQ ID:N0.1所示。
2.根据权利要求1所述的烟草镉转运基因NtHMA2，其特征在于所述基因编码的氨基酸序列如SEQ ID:N0.2所示。
3.一种权利要求1所述的烟草镉转运基因NtHMA2的克隆方法，其特征在于包括以下步骤: A、确定NtHMA2基因序列； B、提取烟草RNA，反转录得到第一链cDNA； C、根据NtHMA2基因序列设计合成特异性引物，以cDNA作为模板，进行PCR扩增； D、回收和纯化PCR产物； E、纯化产物与载体连接，转化感受态细胞； F、筛选阳性克隆，对阳性克隆PCR扩增、测序。
4.根据权利要求3所述的烟草镉转运基因NtHMA2的克隆方法，其特征在于所述的步骤A包括如下步骤: (1)利用同源基因拟南芥AtHMA2序列搜索NCBI烟草EST数据库，得到烟草NtHMA2的EST序列；利用此序列比对烟草基因组数据库，获得一个基因序列(Nsyl0129220)，根据此序列设计 RACE 引物,RACE 利用试剂盒 Clontech Smart RACE cDNA Amplification Kit 进行，反应参考试剂盒说明书，3'端扩增到50(T700bp的片段，5'端扩增到40(T600bp的片段； (2)目标片段回收后进行测序，并与核心序列拼接获得NtHMA2全长cDNA序列，设计基因特异引物进行PCR反应，得到目的产物； (3)对目的产物测序，得到NtHMA2基因序列。
5.根据权利要求4所述的烟草镉转运基因NtHMA2的克隆方法，其特征在于步骤(1)所述的特异性引物为: 3' RACE 基因特异引物:5' -AGAAACTGCTCATTGTGACAGCACA-3'； 5' RACE 基因特异引物:5' -CAACTGCAACAGCTGCAAGTGCTA-3'。
6.根据权利要求3所述的烟草镉转运基因NtHMA2的克隆方法，其特征在于步骤C所述的特异性引物为: 正向引物 NtHMA2F: 5' -TCTTCTCCTCCTCCTTAGAGAAG-3'； 反向引物 NtHMA2R: 5' -CTACTCTATGACAATTTCTGATA-3'。
7.—种权利要求1所述的烟草镉转运基因NtHMA2的应用，其特征在于用于降低镉从烟草根部转运到烟叶的转运率。
8.根据权利要求7所述的烟草镉转运基因NtHMA2的应用，其特征在于所述的降低镉从烟草根部转运到烟叶的转运率的方法包括如下步骤: A、构建RNAi载体； B、农杆菌转化； C、RNAi载体导入烟草； D、培养转基因植株。
9.根据权利要求8所述的烟草镉转运基因NtHMA2的应用，其特征在于步骤A中所述的^0VMWN-11?-SIad Ss ?ν§
【文档编号】C07K14/415GK103981194SQ201410254594
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年6月10日 优先权日:2014年6月10日
【发明者】李文正, 王丙武, 高玉龙, 宋中邦, 曾建敏, 张家瑞, 孔光辉, 李永平 申请人:云南省烟草农业科学研究院