具有抗菌抗病毒活性的小分子肽及其活性修饰物的制作方法
【专利摘要】本发明公开了具有抗菌抗病毒活性的小分子肽及其活性修饰物，小分子肽的氨基酸序列3～7个氨基酸组成，其氨基酸序列通式为X0-3(R/K/O/Dab)X0-1W1-2(R/K/O/Dab)0-1X0-1；其中X为氨基酸R，K，W，I中一种；X0-3为R，K，W，I中任意0～3个；X0-1为R，K，W，I中任意0～1个；W1-2表示1或2个W；(R/K/O/Dab)0-1表示0或1个氨基酸R或K或O或Dab，Dab为2,4-二氨基丁氨酸。实验证明本发明的小分子肽或其活性修饰物具有很好的抗菌抗病毒作用，在制备消除细菌、真菌或病毒药剂、消毒剂、清洁剂、防腐剂或包装材料中具有重要应用价值。
【专利说明】具有抗菌抗病毒活性的小分子肽及其活性修饰物
【技术领域】
[0001]本发明涉及新型抗菌肽及其衍生物，具体涉及具有抗菌抗病毒活性的小分子肽及其活性修饰物。
【背景技术】
[0002]传统抗生素细菌耐药性已成为一个全球问题，迫切需要开发出新的抗菌药物。为了解决这个问题，抗菌肽(AntimicrobiaL peptides AMPs)已成为有潜力的可治疗耐药病原体引起的传染病。抗菌肽是生物体在外界病原微生物入侵时产生的具有抗菌活性的多肽物质，通常由12-45个氨基酸组成，分子量约40kD，是生物体非特异性免疫的重要组成部分。抗菌肽一级结构具有典型的特征，即N端富含Lys和Arg等极性氨基酸，而C端富含Ala、Val和Gly等非极性氨基酸，中间部分富含Pro，因此抗菌肽主要以阳离子形式存在。这类分子具有较强的保守性，同时具有分子量低、稳定性好、副作用小、水溶性强、强碱性、广谱抗菌、无耐药性等优点，广泛分布于哺乳动物、无脊椎动物、植物和微生物中，能产生天然的适应性免疫防御入侵的病原体。抗菌肽的序列和二级结构不同，但总是折叠成一个两性分子的构象与生物膜相互作用，同时带有正电荷，使其能与带负电荷的细菌膜相互作用。因此，AMPs对细菌、真菌、病毒、寄生虫、肿瘤具有杀伤作用，尤其是多种抗生素耐药的微生物如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、耐药铜绿假单胞菌和不动杆菌等。
[0003]抗菌肽的出现为人们寻找理想的抗菌药物提供新的领域，因此抗菌肽具有巨大的应用潜力。自从Boman等人在1972年首先在果蚬中发现了抗菌肽,随后1981年Steiner等人又从美国天蚕中成功地分离到两种抗菌肽Cecropin-A和Cecropin-B后，截止2014年初，已发现的天然AMPs超过2000条。近年来，计算机辅助药物分子设计技术的发展，极大的促进了抗菌肽的研究和开发，已有超过十个根据天然阳离子抗菌肽合成的类似物进入临床或临床前的试验阶段，典型的代表是娃皮提取的Magainins是第一种进入药品开发程序的抗菌肽，美国马盖宁制药公司已经开发筛选出对细菌、病毒和肿瘤细胞均有明显的杀伤作用的两种新型抗菌肽=Pexiganan(MS1-78)和MAI1278现已进入临床III期试验，可以预测在不久的将来抗菌肽将会成为寻找新药的重要领域。TriPep公司正在研制的小肽GPG，已经在欧洲进行I/II期临床试验，治疗两周以上发现，病毒复制减慢，显示出一定的抗HIV应用前景；口服抗菌肽Ambicin和Isegangn已成功地完成I期安全性评价；加拿大MicroLogix生化技术公司的两种抗菌肽MB1-226和MB1-594进入II期或III期的严重粉刺感染的临床研究，其中MB1-226III期临床试验结果表明，在诱导期只有极小的刺激反应，与阴性组对照，蓄积刺激反应更小。最引人注目的Trimeris公司的抗HIV抗菌肽Enfuvritide (T20)已在数年前成功上市。
[0004]目前许多抗生素已产生抗药性，肽类抗菌物质具有独特的抗菌机制，对真核细胞几乎没有作用，仅仅作用于原核细胞和发生病变的真核细胞，且不易产生耐药性，因此在不久的将来，这些肽类抗菌物质可能成为新型抗菌药物的来源，具有极好的市场开发与应用前景。
[0005]随着微生物学的发展，与传统抗生素相比，AMPs独特的作用机制使其具有高效和低耐药性的优势。尽管AMPs具有一定的优势,然而到目前为止较少AMPs药物达到临床实用的要求。因为AMPs存在生物利用度、毒性、稳定性和生产成本等问题。为了改善AMPs的属性，使其能开发成药物，合理的设计是解决问题的方法。
【发明内容】
[0006]为了解决上述存在的问题，本发明合成了由3~7个氨基酸组成的超短抗菌肽及其活性修饰物，其不仅会大大地减少生产成本，进行结构优化后还显著降低可能引起的免疫原性反应。
[0007]本发明的目的在于提供抗菌抗病毒活性的小分子肽及其活性修饰物。
[0008]本发明所采取的技术方案是:
[0009]具有抗菌抗病毒活性的小分子肽及其活性修饰物，所述小分子肽的氨基酸序列3~7个氨基酸组成，其氨基酸序列通式为Xch3 (R/K/0/Dab) Xch1W^ (R/K/0/Dab) P1Xch1 ；
[0010]其中X选自氨基酸R，K，W，I中任一种；
[0011]XQ_3表示氨基酸R, K, W, I中任意O~3个；
[0012]Xch表示氨基酸R，K，W，I中任意O~I个；
[0013]W1^2表示I个或2个氨基酸W ；
[0014](R/K/0/DJ 表示O个或I个氨基酸R或K或O或Dab，其中Dab为2，4- 二氨基丁氨酸。
[0015]进一步的，上述小分子肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO:1~17所示的氨基酸序列。
[0016]进一步的，上述氨基酸为L-构型或D-构型的氨基酸。
[0017]进一步的，具有抗菌抗病毒活性的小分子肽及其活性修饰物，所述活性修饰物的修饰部分为脂化修饰、糖基化修饰、酰胺化修饰、羧酸化修饰、磷酸化修饰、酯化修饰、N-酰化修饰、通过二硫键环化修饰、转化成酸加成盐的修饰、二聚体、多聚体、缀合化修饰中至少一种。
[0018]进一步的，上述脂化修饰的基团选自脂肪酸，三萜类，留体类，磷脂，糖磷脂酰肌醇，磷脂酰丝氨酸，磷脂酰乙醇胺，鞘磷脂，磷脂酰胆碱，心磷脂，磷脂酰肌醇，磷脂酸，溶血磷酸甘油酯和胆固醇基团中的至少一种。
[0019]进一步的，上述脂肪酸为C2~C20脂肪酸。
[0020]进一步的，上述脂肪酸为CS~C20脂肪酸。
[0021]小分子肽及其活性修饰物在制备消除细菌、真菌或病毒药剂中的应用。
[0022]小分子肽及其活性修饰物在制备用于处理细菌、真菌或病毒感染或污染的抗生素、消毒剂或清洁剂、防腐剂或包装材料中的应用。
[0023]编码上述小分子肽的核酸。
[0024]本发明的有益效果是:
[0025]I)本发明的AMPs对革兰氏阳性和阴性细菌具有广泛的和有效的抗菌活性。一些多肽除了具有破坏膜稳定性的潜在机制还表现出多个模式的细菌杀死方式。
[0026]2)本发明的AMPs除了其强大的杀菌活性，，一些抗菌肽与传统抗生素联合用药产生了不可预见的协同作用，这种联合使用的协同作用一方面可以有效降低抗生素的使用剂量，另一方面可以实现更好的抗菌效果。
[0027]3)在所有的抗菌肽，本发明合成的这些AMPs是最短的，因此具有易合成和成本低的优势，同时有潜力可发展为各种感染性疾病的治疗药物。如本发明中有有些AMPs还具有抗流感病毒、HIV的活性。
[0028]4)本发明提供了具有抗革兰阳性菌、革兰阴性菌、抗病毒作用的新型短脂肽。
【专利附图】
【附图说明】
[0029]图1为抗菌抗病毒小分子肽C10-AMP3 (ClO-RKffffK)的HPLC图；
[0030]图2为抗菌抗病毒小分子肽C10-AMP3 (ClO-RKffffK)的MS图；
[0031]图3为抗菌抗病毒小分子肽C10-AMP14 (ClO-RIKffK)的HPLC图；
[0032]图4为抗菌抗病毒小分子肽C10-AMP14 (ClO-RIKffK)的MS图；
[0033]图5为ClO脂肪酸和C14脂肪酸修饰的小分子肽的溶血活性；
[0034]图6为MTT试验评估ClO-RKffffK和RKffffK细胞(TZM_bl)中的细胞毒性；
[0035]图7为流式细胞仪测定C10-AMP3 (ClO-RKffffK)对哺乳动物细胞的毒害速度；
[0036]图8为流式细胞仪测定C10-AMP14 (ClO-RIKffK)对哺乳动物细胞的毒害速度；
[0037]图9 为 C10-AMP3 和 C10-AMP14 对 S.aureus (C)的杀菌速度；
[0038]图10 为 C10-AMP4、C10-AMP3、C10-AMP7、RKffffK 与 Neomycin 的联合用药的协同效应。
【具体实施方式】
[0039]具有抗菌抗病毒活性的小分子肽及其活性修饰物，所述小分子肽的氨基酸序列3~7个氨基酸组成，其氨基酸序列通式为Xch3 (R/K/0/Dab) Xch1W^ (R/K/0/Dab) P1Xch1 ；
[0040]其中X选自氨基酸R，K，W，I中任一种；
[0041]XQ_3表示氨基酸R, K, W, I中任意O~3个；
[0042]Xch表示氨基酸R，K, W, I中任意O~I个；
[0043]W1^2表示I个或2个氨基酸W ；
[0044](R/K/0/DJ μ表示O个或I个氨基酸R或K或O或Dab，其中Dab为2，4_ 二氨基丁氨酸；因为精氨酸(R)、鸟氨酸(O)、2，4-二氨基丁氨酸(Dab)和赖氨酸(K)在生理条件下表现出具有极性和带正电荷的性质，精氨酸(R)、鸟氨酸(O)、2，4-二氨基丁氨酸(Dab)可以替换赖氨酸⑷。
[0045]优选的，上述小分子肽及其活性修饰物所带电荷至少为+2，序列控制在7个氨基酸以内，可以通过增加R，K，W，I等氨基酸来改变短肽的电荷、芳香性和疏水性，而调节赖氨酸(精氨酸)之间的距离也可以增强短肽的活性。
[0046]优选的，上述小分子肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO:1~17所示的氨基酸序列。
[0047]优选的，上述氨基酸为L-构型或D-构型的氨基酸。
[0048]优选的，具有抗菌抗病毒活性的小分子肽及其活性修饰物，所述活性修饰物的修饰部分为脂化修饰、糖基化修饰、酰胺化修饰、羧酸化修饰、磷酸化修饰、酯化修饰、N-酰化修饰、通过二硫键环化修饰、转化成酸加成盐的修饰、二聚体、多聚体、缀合化修饰中至少一种。
[0049]优选的，上述脂化修饰的基团选自脂肪酸，三萜类，留体类，磷脂，糖磷脂酰肌醇，磷脂酰丝氨酸，磷脂酰乙醇胺，鞘磷脂，磷脂酰胆碱，心磷脂，磷脂酰肌醇，磷脂酸，溶血磷酸甘油酯和胆固醇基团中的至少一种。
[0050]优选的，上述脂肪酸为C2~C20脂肪酸。
[0051]优选的，上述脂肪酸为CS~C20脂肪酸。
[0052]优选的，上述C8-C20脂肪酸选自月桂酸、棕榈酸、肉豆蘧酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、芥酸和花生酸。
[0053]上述脂肪酸分子可以附着在本发明抗菌肽任何适当的部分，如氨基端、羧基端、或氣基和竣基两端等。
[0054]小分子肽及其活性修饰物在制备消除细菌、真菌或病毒药剂中的应用。
[0055]小分子肽及其活性修饰物在制备用于处理细菌、真菌或病毒感染或污染的抗生素、消毒剂或清洁剂、防腐剂或包装材料中的应用。
[0056]本发明小分子肽及其活性修饰物的抗菌抗病毒活性的机制
[0057]在本发明中，合成的有效的AMPs结合了短脂肽和RW丰富的肽的优势。对这一系列抗菌肽的活性测试表明，其对病原微生物包括革兰氏阴性杆菌大肠杆菌，革兰氏阳性球菌金黄色葡萄球菌、白色念球菌、病毒等微生物具有抑制作用。溶血性实验表明其具有低毒性，而且部分AM/Ps具有抗病毒的作用。
[0058]含有R和W的多肽是现在主要的新型AMPs。然而，除了含有阳离子基团和疏水基团，含精氨酸和色氨酸的抗菌肽的重要性已经得到了充分的认识。有解释说，是因为形成了在带负电荷的电子云吲哚残基和各种阳离子氨基酸残基之间的阳离子η键，而精氨酸和赖氨酸就会导致细胞膜的破裂。基于以上发现，本发明合成了一系列含有R，K，W和I的超短脂肽。前期工作发现这些抗菌肽的活性可以通过疏水性，电荷和两性的改变进行调控。因此，增加电荷，改变极性/非极性氨基酸的位置，改变空间结构柔韧性，替换疏水/亲水残基等方法可以获得高活性的抗菌肽。为获得更多的疏水基团在抗菌肽中起的作用，进行了两个实验:(a)不同序列肽的疏水性通过反向高效液相分析；(b)同样序列的肽的疏水性可评估连接肽基头尾的各种脂肪酸(分别为ClO和C18脂肪酸)。在这些实验的基础上，得出一个结论，一个活性强的抗菌肽是一个平衡的系统，存在一个最优疏水性高抗菌范围，也就是说，高疏水性并不总是直接与高效抗菌抗病毒能力成正比关系。减少或增加疏水性超出这个范围将大大影响其抗菌活性.因此，大多数肽以C18脂肪酸取代后没有C14、ClO类似物的活性高。产生这种现象的原因是高疏水性的肽使其与细胞膜难以结合。
[0059]本发明抗菌肽具有共同的生物物理特性，如正电荷、疏水性和两性。这些理化性质都会影响对细胞膜的破坏和透化作用。本发明中，发现C10-RIKWK和ClO-RKffffK具有相似的活性，但是其杀菌的机制则不相同。。这是ClO-RKffffK能对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌有选择性的原因。然而，现在还不能清楚的知道肽进入细菌的具体机制，可能是溶解膜或者破坏膜的完整性，从而与细菌内的靶点相作用。而DNA-binding实验说明肽与DNA的相互作用可能涉及到干扰DNA的复制、重组、修复、翻译等。C10-KIKRWR有较好的抗HIV-1病毒活性，并且对细胞的毒性较小，有继续进行试验的潜力。C18-KKWK、C18-KWK、C20-KKWK、C20-KWK则有抗H5N1的活性，在低浓度时有促进病毒感染的作用。
[0060]由于在pH值、离子强度和亲脂性的不同，本发明合成的短肽与不同细胞膜有不同的作用，也有不同的选择性。色氨酸和赖氨酸独特的物理化学性质使它们适合作为抗菌肽的组成模块。本发明的多肽是用精氨酸(R)、赖氨酸(K)、色氨酸(W)、异亮氨酸(I)组成的抗微生物的抗菌肽，其中一个具有某种物理和/或化学特性的氨基酸被换为另一个具有相同化学或物理特性的氨基酸，例如，精氨酸(R)、鸟氨酸(O)、2，4-二氨基丁氨酸(Dab)和赖氨酸(K)在生理条件下表现出具有极性和带正电荷的性质，精氨酸(R)、鸟氨酸(O)、2，4_二氨基丁氨酸(Dab)可以替换赖氨酸(K)。
[0061]总而言之，本发明含有精氨酸、赖氨酸、色氨酸的脂肽具有广谱、高效的抗革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的活性。而除了有破坏生物膜的作用外，一些肽有多种的杀菌模式。本发明中，一些肽与传统的抗生素联用可以减少杀菌的剂量。而新合成的短脂肽是一类最短的抗菌肽。由于其具有易合成、低成本的优势，而可以开发成治疗抗感染的药物。
[0062]下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
[0063]实施例1:
[0064]一、小分子多肽及其活性修饰物
[0065](I)小分子多肽及其活性修饰物
[0066]本发明具有抗菌抗病毒小分子肽是以KffffK、KWK为基本基序、由3-7个氨基酸所组成的多肽。根据基本氨基酸序列KffffK、KffK得到的一系列抗微生物小分子肽的氨基酸序列通式为 XQ_3(R/K/0/Dab) Xch1W1^ (R/K/0/Dab) ^1Xch ;其中 X 选自氨基酸 R，K，W, I 中任一种;X0_3表不氨基酸R，K, W, I中任意O~3个！Xch1表不氨基酸R，K, W, I中任意O~I个表不I个或2个氨基酸W ； (R/K/0/Dab) 表示O个或I个氨基酸R或K或O或Dab，其中Dab为2，
4-二氨基丁氨酸。其中抗菌抗病毒效果较佳的17条序列如表1所示。
[0067]表1抗微生物小分子肽的氨基酸序列表
【权利要求】
1.具有抗菌抗病毒活性的小分子肽及其活性修饰物，其特征在于:所述小分子肽的氨基酸序列3~7个氨基酸组成，其氨基酸序列通式为Xch3 (R/K/0/Dab) X O^1W (R/K/0/Dab)0-1 ? 其中X选自氨基酸R，K，W，I中任一种； X0-S表示氨基酸R，K, W, I中任意O~3个； X 0-1表示氨基酸R，K, W，I中任意O~I个； W 表示I个或2个氨基酸W ； (R/K/O/DJo^表示O个或I个氨基酸R或K或O或Dab，其中Dab为2，4- 二氨基丁氨酸。
2.根据权利要求1所述的具有抗菌抗病毒活性的小分子肽及其活性修饰物，其特征在于:所述小分子肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO:1~17所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的具有抗菌抗病毒活性的小分子肽及其活性修饰物，其特征在于:所述的氨基酸为L-构型或D-构型的氨基酸。
4.根据权利要求1或2所述的具有抗菌抗病毒活性的小分子肽及其活性修饰物，其特征在于:所述活性修饰物的修饰部分为脂化修饰、糖基化修饰、酰胺化修饰、羧酸化修饰、磷酸化修饰、酯化修饰、N-酰化修饰、通过二硫键环化修饰、转化成酸加成盐的修饰、二聚体、多聚体、缀合化修饰中至少一种。
5.根据权利要求4所述的具有抗菌抗病毒活性的小分子肽及其活性修饰物，其特征在于:所述脂化修饰的基团选自脂肪酸，三萜类，留体类，磷脂，糖磷脂酰肌醇，磷脂酰丝氨酸，磷脂酰乙醇胺，鞘磷脂，磷脂酰胆碱，心磷脂，磷脂酰肌醇，磷脂酸，溶血磷酸甘油酯和胆固醇基团中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的具有抗菌抗病毒活性的小分子肽衍生物，其特征在于:所述的脂肪酸为C2~C20脂肪酸。
7.权利要求1-6中任一所述的小分子肽及其活性修饰物在制备消除细菌、真菌或病毒药剂中的应用。
8.权利要求1-6中任一项所述的小分子肽及其活性修饰物在制备用于处理细菌、真菌或病毒感染或污染的抗生素、消毒剂或清洁剂、防腐剂或包装材料中的应用。
9.编码权利要求1中所述小分子肽的核酸。
【文档编号】C07K5/09GK104072579SQ201410259060
【公开日】2014年10月1日 申请日期:2014年6月11日 优先权日:2014年6月11日
【发明者】何坚, 刘叔文, 林冬果, 方堉欣, 王静瑜 申请人:南方医科大学