一种合成利拉鲁肽的方法
【专利摘要】本发明涉及医药合成领域，公开了一种合成利拉鲁肽的方法。本发明所述方法按照利拉鲁肽主链N端至C端的氨基酸顺序，先合成第1至第4氨基酸、第15至第16氨基酸以及第17至第31氨基酸的3个多肽片段，然后按C端至N端顺序偶联3个多肽片段以及其余氨基酸合成利拉鲁肽。本发明所述方法能够同时进行3个片段的合成，并避免过多的和载体树脂的偶联和酸解，树脂载体用量大为减少，缩短了合成周期，在保证较高的总收率和纯度的前提下，简化合成工艺的复杂程度。
【专利说明】一种合成利拉鲁肽的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及医药合成领域，具体涉及一种合成利拉鲁肽的方法。
【背景技术】
[0002]利拉鲁肽，英文名为Liraglutide，是丹麦诺和诺德公司研制出的一种治疗II型糖尿病的药物。利拉鲁肽是一种人胰高糖素样肽-1 (GLP-1)类似物，其作为GLP-1受体激动剂能起到良好的降低血糖作用，肽序如下:
[0003]NH2-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-GIn-Ala-Ala-Lys(Na-PAL-y-Glu)-Glu-Phe-1le-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-COOH
[0004]利拉鲁肽与天然GLP-1分子结构相比有一个氨基酸差异，并增加了一个16碳棕榈酰脂肪酸侧链，与天然人GLP-1有97%同源性。与天然GLP-1不同的是，利拉鲁肽在人体中的药代动力学和药效动力学特点均适合每天一次的给药方案。皮下注射给药后，其作用时间延长的机理包括:使吸收减慢的自联作用、与白蛋白结合、对二肽基肽酶IV(DPP-1V)和中性内肽酶(NEP)具有更高的酶稳定性，从而具有较长的血浆半衰期。
[0005]在利拉鲁肽的现有合成方法中，诺和诺德公司主要是通过基因重组技术，利用酵母生产利拉鲁肽，但是国内无法得到酵母菌种进行生产。专利US6268343B1、US6458924B2以及文献 “Journal of Medicinal Chemistry43,1664-1669, 2000” 均公开了利用中间体GLP-1 (7-37) -OH和N° -alkanoyl_Glu (ONSu) -OtBu来制备利拉鲁肽的方法，但是这三种现有技术中，中间体GLP-1 (7-37) -OH均需要反相HPLC纯化，再在液相条件下与Na-alkanoyl-Glu (ONSu) -OtBu反应，并且由于GLP-1 (7-37) -OH N端未保护以及侧链保护基全部脱除，会导致产生许多杂质，难以纯化，操作繁琐，周期长，废液多，不利于环保，并且两步纯化,需花费大量乙腈,成本高昂，不利于大规模生产等。
[0006]中国专利CN102286092A公开了一种全合成方法，采用2-CTC树脂或王树脂，按照利拉鲁肽肽序逐个偶联氨基酸，最后经过反向纯化得到利拉鲁肽，其不需要两步纯化而且杂质较少，优于上述几种现有制备方法。但是，这种方法需要逐个偶联氨基酸，合成周期长，总收率较低，仅为15%左右(参见CN102286092A实施例12-14)，仍需要进一步提高。
[0007]为了解决上述问题，申请号为201210369966.3的中国专利公开了一种合成利拉鲁肽的方法，其按照利拉鲁肽主链N端至C端的氨基酸顺序，先合成第I至第4氨基酸、第5至第10氨基酸、第11至第16氨基酸、第17至第24氨基酸以及第25至第31氨基酸的5个多肽片段，然后偶联5个多肽片段合成利拉鲁肽，缩短合成周期，提高利拉鲁肽的纯化后总收率超过30%，纯度超过99%。但是，该方法需要分别和树脂载体合成5个片段，然后再进行偶联，其中涉及到多次的连接和裂解树脂载体，在操作程度上并不简便，而且偶联和裂解树脂载体均需要花费不少时间，且耗费过多的树脂载体。此外，该专利在杂质含量检测方面并未公开对利拉鲁肽品质影响较大的最大单一杂质的含量。
[0008] 在多肽合成领域，不同的合成策略对最终产品的纯度、最大单一杂质含量和收率有很大影响，如何在保证纯度和收率的前提下，尽可能的降低合成工艺的复杂程度、最大单一杂质以及缩短合成周期，是当下技术人员的研究重点。
【发明内容】
[0009]有鉴于此，本发明的目的在于提供一种合成利拉鲁肽的方法，使得本发明所述方法在保证其总收率和纯度的前提下，降低合成方法的复杂程度和最大单一杂质，缩短合成周期。
[0010]为实现上述目的，本发明提供如下技术方案:
[0011]一种合成利拉鲁肽的方法，包括以下步骤:
[0012]步骤1、合成在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列N端、His侧链上以及Glu侧链上偶联有保护基的多肽片段I ;
[0013]合成在SEQ ID N0:2所示氨基酸序列N端、Glu侧链上偶联有保护基的多肽片段2 ;
[0014]合成在SEQ ID N0:3所示氨基酸序列C端偶联有树脂载体、在Gln侧链上、Glu侧链上、Trp侧链上、Arg侧链上偶联有保护基以及在Lys侧链上偶联有Na-PAL- Y -Glu (a -OtBu)的多肽片段 3 ； [0015]步骤2、将多肽片段3的N端和多肽片段2的C端偶联，偶联后脱除多肽片段2的N端保护基，得到多肽树脂I ;
[0016]步骤3、按照SEQ ID N0:4所示氨基酸序列C端到N端的顺序，先将N端偶联有保护基的亮氨酸的C段与多肽树脂I的N端偶联，然后依次逐个将其他对应的保护氨基酸进行延伸偶联，偶联后脱除N端保护基，得到多肽树脂II ；
[0017]步骤4、将多肽片段I的C端和多肽树脂II的N端偶联，偶联后脱除多肽片段I的N端保护基，得到利拉鲁肽树脂；
[0018]步骤5、利拉鲁肽树脂酸解脱除C端树脂和所有保护基得到利拉鲁肽粗品，粗品纯化，获得利拉鲁肽。
[0019]利拉鲁肽主链氨基酸有31个，采用片段方法进行合成存在很多种形式，但只有合适的片段方法才能保证较高的利拉鲁肽的总收率纯度，同时又能降低合成工艺的复杂程度。为此， 申请人:根据长期的试验研究以及氨基酸消旋情况，提出了本发明所述方法来制备利拉鲁肽，在保证其总收率和纯度的前提下，降低合成方法的复杂程度。。
[0020]在本发明所述方法中，首先按照利拉鲁肽主链肽序分成4个部分，即分成3个片段的合成以及其他氨基酸的逐个偶联，以利拉鲁肽主链N端到C端的氨基酸顺序编号，如下式:
[0021]NH2-Hisl-Ala2-Glu3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Val10-Ser11-Ser12-Tyr13-L eu14-Glu15-Gly16-Gln17-Ala18-Ala19-Lys20(Na-PAL-y-Glu) -Glu21-Phe22-1le23-Ala24-Trp25-Leu26-Val27-Arg28-Gly29-Arg30-Gly31-COOH
[0022]SEQ ID NO:1所示氨基酸序列即为上式中编号1_4的多肽序列，SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列即为上式中编号15-16的多肽序列，SEQ ID NO: 3所示氨基酸序列即为上式中编号17-31的多肽序列，SEQ ID N0:4所示氨基酸序列即为上式中编号5_14的多肽序列。
[0023]本发明在步骤I中合成的多肽片段I是在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列基础上，在其N端、His侧链上以及Glu侧链上分别偶联保护基；合成的多肽片段2是在SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列基础上，在其N端、Glu侧链上分别偶联保护基；合成的多肽片段3是在SEQID NO: 3所示氨基酸序列基础上，在其C端偶联有树脂载体、在Gln侧链上、Glu侧链上、Trp侧链上、Arg侧链上偶联有保护基以及在Lys侧链上偶联有N°_PAL_ y -Glu ( a -OtBu)。而剩余的其他氨基酸，则是在多肽片段3与多肽片段2偶联形成多肽树脂I后，按照SEQ IDNO:4所示氨基酸序列C端到N端的顺序，先将N端偶联有保护基的亮氨酸的C段与多肽树脂I的N端偶联，然后依次逐个将其他对应的保护氨基酸进行延伸偶联，偶联后脱除N端保护基，得到多肽树脂II。然后多肽树脂II和多肽片段I再进行最后的偶联完成整个利拉鲁肽的肽链合成。
[0024]本发明所述保护基是在氨基酸合成领域常用的保护氨基酸主链以及侧链上氨基、羧基等干扰合成的基团的保护基团，防止氨基、羧基等在制备目标产物过程中发生反应，生成杂质，对于本发明中需要保护侧链的氨基酸来说，本领域技术人员公知其侧链结构以及知晓采用常用保护基来保护氨基酸侧链上的氨基、羧基等基团，作为优选，本发明通过Trt保护基保护组氨酸、谷氨酰胺的侧链；通过OtBu保护基保护谷氨酸、天冬氨酸的侧链；通过tBu保护基保护苏氨酸、丝氨酸、酪氨酸的侧链；通过Boc保护基保护色氨酸的侧链；通过Pdf保护基保护精氨酸的侧链。此外，在本发明所述方法涉及的氨基酸中，氨基酸N端均优选通过Fmoc保护基进行保护，而组氨酸也可通过Boc保护基进行保护。而被保护基保护的氨基酸称为保护氨基酸。
[0025]作为优选方案，步骤I所述合成多肽片段I具体为:
[0026]在偶联试剂存在下，将N端偶联有Fmoc保护基的甘氨酸(Fmoc-Gly-OH)与树脂载体偶联后脱Fmoc保护基得到H-Gly-树脂载体，然后采用活化试剂和缩合试剂，按照SEQID NO:1所示氨基酸序列C端到N端的顺序，依次逐个将N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有OtBu保护基的谷氨酸(Fmoc-Glu(OtBu)-OH)、N端偶联有Fmoc保护基的丙氨酸(Fmoc-Ala-OH)、N端偶联有Boc保护基或Fmoc保护基以及侧链偶联有Trt保护基的组氨酸(Fmoc/Boc-His (Trt)-OH)进行延伸偶联，偶联后裂解液裂解，脱除树脂载体得到多肽片段 I(Fmoc/Boc-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-ΟΗ)。
[0027]作为优选方案，步骤I所述合成多肽片段2具体为:
[0028]在偶联试剂存在下，将N端偶联有Fmoc保护基的甘氨酸(Fmoc-Gly-OH)与树脂载体偶联后脱Fmoc保护基得到H-Gly-树脂载体，然后采用活化试剂和缩合试剂，按照SEQ IDNO: 2所示氨基酸序列C端到N端的顺序，将N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有OtBu保护基的谷氨酸(Fm0c-Glu(OtBu)-OH)进行延伸偶联，偶联后裂解液裂解，脱除树脂载体得到多肽片段 2 (Fmoc-Glu (OtBu) -Gly-ΟΗ)。
[0029]作为优选方案，步骤I所述合成多肽片段3具体为:
[0030]在偶联试剂存在下，将N端偶联有Fmoc保护基的甘氨酸(Fmoc-Gly-OH)与树脂载体偶联后脱Fmoc保护基得到H-Gly-树脂载体，然后采用活化试剂和缩合试剂，按照SEQ ID NO: 3所示氨基酸序列C端到N端的顺序，依次逐个将N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有Pdf保护基的精氨酸(Fmoc-Arg(Pdf)-OH)、N端偶联有Fmoc保护基的甘氨酸(Fmoc-Gly-OH)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有Pdf保护基的精氨酸(Fmoc-Arg (Pdf) -OH)、N端偶联有Fmoc保护基的纟颜氨酸(Fmoc-Val-OH)、1^端偶联有Fmoc保护基的亮氨酸(Fmoc-Leu-OH)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有Boc保护基的色氨酸(Fmoc-Trp (Boc) -OH)、N端偶联有Fmoc保护基的丙氨酸(Fmoc-Ala-OH) N端偶联有Fmoc保护基的异亮氨酸(Fmoc-1le-OH)、N端偶联有Fmoc保护基的苯丙氨酸(Fmoc-Phe-OH)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有OtBu保护基的谷氨酸(Fmoc-Glu (OtBu) -OH)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有N°-PAL- y -Glu ( a -OtBu)的赖氨酸(Fmoc-Lys (Na-PAL-Y -Glu ( a -OtBu)) -OH)、两个N端偶联有Fmoc保护基的丙氨酸(Fmoc-Ala-OH)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有Trt保护基的谷氨酰胺(Fmoc-Gln(Trt)-OH)进行延伸偶联，脱除N段带有的Fmoc保护基得到多肽片段3 (Gin (Trt) -Ala-Ala-Lys (N- ε - (Na-PAL- y -GIu ( a -OtBu)) -Glu (OtBu) -Phe-1le-Ala-Tr p (Boc) -Leu-Val-Arg (Pbf) -Gly-Arg (Pbf) -Gly-树脂载体)。
[0031]其中，所述Na-PAL-Y-Glu (a-OtBu)中，OtBu为谷氨酸上α羧基(即主链上的羧基)的保护基，是为了使谷氨酸侧链上的羧基和赖氨酸侧链上的氨基缩合偶联形成谷酰基，最终完成利拉鲁肽赖氨酸侧链的合成。
[0032]作为优选方案，步骤3具体为:
[0033]采用活化试剂和缩合试剂，按照SEQ ID Ν0:4所示氨基酸序列C端到N端的顺序，先将N端偶联有Fmoc保护基的亮氨酸(Fmoc-Leu-OH)的C端与多肽树脂I的N端偶联后脱Fmoc保护基得到H-Leu-多肽树脂I，然后依次逐个将N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有tBu保护基的酪氨酸(Fmoc-Tyr (tBu)-OH)、两个N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有tBu 保护基的丝氨酸(Fmoc-Ser (tBu)-OH)、N端偶联有Fmoc保护基的甘氨酸(Fmoc-Val-OH)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有OtBu保护基的天冬氨酸(Fmoc-Asp(OtBu)-OH)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有tBu保护基的丝氨酸(Fmoc-Ser (tBu)-OH)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有tBu保护基的苏氨酸(Fmoc-Thr (tBu) -OH)、N端偶联有Fmoc保护基的苯丙氨酸(Fmoc-Phe-OH)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有tBu保护基的苏氨酸(FmOC-Thr(tBU)-OH)进行延伸偶联，偶联后脱除N端带有的 Fmoc 保护基,得到多肽树脂 II (Thr (tBu) -Phe-Thr (tBu) -Ser (tBu) -Asp (OtBu)-Val-Ser (tBu) -Ser (tBu) -Tyr (tBu) -Leu-多妝树脂 I )。
[0034]在上述合成多肽片段1-3的优选方案中，第一个保护氨基酸与树脂载体偶联所形成的多肽树脂取代值优选为0.2~1.0mmol/g多肽树脂，更优选的取代值为0.3~0.5mmol/g多肽树脂。
[0035]本发明所述延伸偶联是指在第一个氨基酸与树脂载体偶联后，剩余氨基酸按照各自序列的顺序逐个和前一个偶联的氨基酸发生缩合反应(主链氨基和羧基的缩合反应)进行偶联。本发明偶联时，每个保护氨基酸或多肽片段用量优选为多肽树脂摩尔数的1-6倍，更优选为2.5-3.5倍；所述偶联反应时间优选为60~300分钟，更优选为100~140分钟。
[0036]在延伸偶联中，由于每个氨基酸N端都有保护基，因此需要先脱除N端保护基再偶联，这对本领域技术人员来说是公知常识。本发明优选用PIP/DMF(哌啶/N，N- 二甲基甲酰胺)混合溶液脱除N端保护基，混合溶液中含哌啶为10~30 % (V)，其余为DMF。去N端保护基试剂的用量为每克多肽树脂5~15mL，更优选的为每克多肽树脂8~12mL ;去N端保护基时间为10~60分钟，优选的为15~25分钟。
[0037]需要说明的是，本发明所述多肽树脂指任意个数保护氨基酸按照利拉鲁肽氨基酸顺序和树脂载体相连接形成的多肽树脂，这其中也包括独立权利要求中的多肽树脂1、多肽树脂I1、利拉鲁肽树脂、多肽片段3。
[0038]在上述合成多肽片段1-3的优选方案中，所述多肽片段合成中采用的树脂载体为Trityl-Cl (三苯甲基氯)类树脂或羟基类树脂。更优选地，所述Trityl-Cl类树脂为Trityl-Cl树脂、4-Methyltrityl_Cl (4-甲基三苯甲基氯)树月旨、4-Methoxytrityl-Cl (4-甲氧基三苯甲基氯)树脂或2-C1 Trity-Cl (2-氯三苯甲基氯)树脂；所述羧基类树脂为Wang(王)树脂或HMP(对羟甲基苯氧甲基聚苯乙烯)树脂。
[0039]其中，进一步优选地，当树脂载体为Trityl-Cl类树脂时，保护氨基酸与载体树脂的偶联方法为:保护氨基酸的羧基与树脂中的Cl-代烷基在碱的作用下发生酯化反应而接入保护氨基酸；
[0040]在上述合成多肽片段1-3的优选方案中，所述裂解液进一步优选体积百分比25%的三氟乙醇的二氯甲烷溶液。
[0041]作为优选，所述缩合试剂优选为N，N- 二异丙基碳二亚胺(DIC)、N, N- 二环己基碳二亚胺(DCC)，六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷/有机碱(PyBOP/有机碱)、2- (7-氮杂-1H-苯并三氮唑-1-基)-1, I, 3，3-四甲基脲六氟磷酸酯/有机碱(HATU/有机碱)、苯并三氮唑-N，N, N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸盐/有机碱(HBTU/有机碱)、O-苯并三氮唑-N，N，N’，N’ -四甲基脲四氟硼酸酯/有机碱(TBTU/有机碱)中的一种。所述缩合试剂的摩尔用量优选为多肽树脂中氨基总摩尔数的I~6倍，更优选为2.5~3.5倍。
[0042]需要说明的是，所述PyBOP/有机碱、HATU/有机碱、HBTU/有机碱、TBTU/有机碱，在本发明中属于四种双体系的缩合试剂，即PyB0P、HATU、HBTU在使用时需要分别和有机碱组合在一起成为一种缩合试剂使用，其中所述有机碱和PyBOP、HATU、HBTU、TBTU的摩尔比优选为为1.3-3.0:1，更优选为1.3-1.5:1。
[0043]作为优选，所述缩合试剂中的有机碱优选为N，N- 二异丙基乙胺(DIPEA)、三乙胺(TEA)或N-甲基吗啡啉(NMM)，更优选为DIPEA。
[0044]作为优选，所述活化试剂为1-羟基苯并三唑(HOBt)或N-羟基_7_氮杂苯并三氮唑(HOAt)。所述活化试剂的用量优选为多肽树脂中氨基总摩尔数的1.2~6倍，更优选为
2.5 ~3.5 倍。
[0045]作为优选，本发明所述偶联试剂为N，N- 二异丙基乙胺(DIPEA)、N, N- 二异丙基碳二亚胺/4-二甲氨基吡啶(DIC/DMAP)两种之一。
[0046]同时，本发明合成方法的步骤2和步骤4优选采用上述缩合试剂和活化试剂进行偶联。
[0047]在本发明合成过程中，优选采用DMF溶剂来溶解。
[0048]除上述列举的合成方法，本发明也可以采用液相合成法按照本发明片段合成策略进行合成。
[0049]在本发明所述方法步骤5中，作为优选方案，步骤5所述酸解采用由体积百分比为80-95%的TFA、体积百分比为1-10%的EDT、余量为水组成的混合酸解液酸解。更优选地，用由体积百分比为90%的TFA、体积百分比为5%的EDT、余量为水组成的混合酸解液酸解。所述混合酸解液用量优选为每克利拉鲁肽树脂需要4~15mL，更优选为9~llmL。所述酸解的时间优选为室温条件下I~6小时，更优选为3~4小时。
[0050]作为优选，所述纯化具体为:[0051]利拉鲁肽粗品，加水搅拌，用氨水调pH8.5至完全溶解，溶液用0.45 μ m微孔滤膜过滤，纯化备用；
[0052]采用高效液相色谱法进行纯化,纯化用色谱填料为10 μ m的反相C18,流动相系统为0.1% TFA/水溶液-0.1 % TFA/乙腈溶液，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度系统洗脱，循环进样纯化，取粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸去乙腈后，得利拉鲁肽纯化中间体浓缩液；
[0053]取利拉鲁肽纯化中间体浓缩液，用0.45 μ m滤膜滤过备用；
[0054]采用高效液相色谱法进行换盐,流动相系统为I %醋酸/水溶液-乙腈，纯化用色谱填料为10 μ m的反相C18, 77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min,采用梯度洗脱,循环上样方法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，观测吸收度的变化，收集换盐主峰并用分析液相检测纯度，合并换盐主峰溶液，减压浓缩，得到利拉鲁肽醋酸水溶液，冷冻干燥，得利拉鲁肽纯品。
[0055]由本发明所述方法合成的利拉鲁肽经HPLC检测，纯度为99%以上，总收率为30%以上，而且本发明所述方法中3个片段可以同时进行合成，与现有逐个合成氨基酸的技术方案相比，缩短了合成周期，提高效率。
[0056]与申请号为201210369966.3的中国专利相比，由5个片段减少到3个片段，树脂载体用量大为减少，降低了工艺的复杂程度和成本，避免过多的和载体树脂的偶联和酸解，缩短合成周期。
[0057]由以上技术方案可知，本发明所述方法能够同时进行3个片段的合成，并避免过多的和载体树脂的偶联和酸解，树脂载体用量大为减少，缩短了合成周期，在保证较高的总收率和纯度的前提下,简化合成工艺的复杂程度。
【具体实施方式】
[0058]本发明公开了一种合成利拉鲁肽的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文所述的的化合物和制备方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0059]在本发明【具体实施方式】中，所有偶联由保护基的氨基酸均可通过市售获得，本发明中的保护氨基酸购自于成都晖蓉生物科技有限公司，所用树脂购自于上虞普尔树脂有限公司，其中本发明所述多肽片段1、多肽片段2也可以通过市售获得，申请文件中所用英文缩写对应的中文含义见表1。
[0060]表1英文缩写释义
[0061]
【权利要求】
1.一种合成利拉鲁肽的方法，其特征在于，包括以下步骤: 步骤1、合成在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列N端、HiS侧链上以及Glu侧链上偶联有保护基的多肽片段I ; 合成在SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列N端、Glu侧链上偶联有保护基的多肽片段2 ； 合成在SEQ ID NO: 3所示氨基酸序列C端偶联有树脂载体、在Gln侧链上、Glu侧链上、Trp侧链上、Arg侧链上偶联有保护基以及在Lys侧链上偶联有N°_PAL_ y -Glu ( a -OtBu)的多肽片段3 ； 步骤2、将多肽片段3的N端和多肽片段2的C端偶联，偶联后脱除多肽片段2的N端保护基，得到多肽树脂I ; 步骤3、按照SEQ ID NO: 4所示氨基酸序列C端到N端的顺序，先将N端偶联有保护基的亮氨酸的C段与多肽树脂I的N端偶联，然后依次逐个将其他对应的保护氨基酸进行延伸偶联，偶联后脱除N端保护基，得到多肽树脂II ； 步骤4、将多肽片段I的C端和多肽树脂II的N端偶联，偶联后脱除多肽片段I的N端保护基，得到利拉鲁肽树脂； 步骤5、利拉鲁肽树脂酸解脱除C端树脂和所有保护基得到利拉鲁肽粗品，粗品纯化，获得利拉鲁肽。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤I所述合成多肽片段I具体为: 在偶联试剂存在下，将N端偶联有Fmoc保护基的甘氨酸(Fmoc-Gly-OH)与树脂载体偶联后脱Fmoc保护基得到H-Gly-树脂载体，然后采用活化试剂和缩合试剂，按照SEQID NO:1所示氨基酸序列C端到N端的顺序，依次逐个将N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有OtBu保护基的谷氨酸(Fmoc-Glu(OtBu)-OH)、N端偶联有Fmoc保护基的丙氨酸(Fmoc-Ala-OH)、N端偶联有Boc保护基或Fmoc保护基以及侧链偶联有Trt保护基的组氨酸(Fmoc/Boc-His (Trt)-0Η)进行延伸偶联，偶联后裂解液裂解，脱除树脂载体得到多肽片段 I(Fmoc/Boc-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-OH)。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤I所述合成多肽片段2具体为: 在偶联试剂存在下，将N端偶联有Fmoc保护基的甘氨酸(Fmoc-Gly-OH)与树脂载体偶联后脱Fmoc保护基得到H-Gly-树脂载体，然后采用活化试剂和缩合试剂，按照SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列C端到N端的顺序，将N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有OtBu保护基的谷氨酸(Fm0c-Glu(OtBu)-OH)进行延伸偶联，偶联后裂解液裂解，脱除树脂载体得到多肽片段 2 (Fmoc-Glu (OtBu) -Gly-ΟΗ)。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤I所述合成多肽片段3具体为: 在偶联试剂存在下，将N端偶联有Fmoc保护基的甘氨酸(Fmoc-Gly-OH)与树脂载体偶联后脱Fmoc保护基得到H-Gly-树脂载体，然后采用活化试剂和缩合试剂，按照SEQ ID NO: 3所示氨基酸序列C端到N端的顺序，依次逐个将N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有Pdf保护基的精氨酸(Fmoc-Arg(Pdf)-OH)、N端偶联有Fmoc保护基的甘氨酸(Fmoc-Gly-OH)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有Pdf保护基的精氨酸(Fmoc-Arg(Pdf)-OH)、N端偶联有Fmoc保护基的缴氨酸(Fmoc-Val-OH)、1^端偶联有Fmoc保护基的亮氨酸(Fmoc-Leu-OH)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有Boc保护基的色氨酸(Fmoc-Trp (Boc) -OH)、N端偶联有Fmoc保护基的丙氨酸(Fmoc-Ala-OH) N端偶联有Fmoc保护基的异亮氨酸(Fmoc-1le-OH)、N端偶联有Fmoc保护基的苯丙氨酸(Fmoc-Phe-OH)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有OtBu保护基的谷氨酸(Fmoc-Glu (OtBu) -OH)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有 N° -PAL- Y -Glu ( a -OtBu)的赖氨酸(Fmoc-Lys (Na-PAL- y -Glu ( a -OtBu))-OH)、两个N端偶联有Fmoc保护基的丙氨酸(Fmoc-Ala-OH)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有Trt保护基的谷氨酰胺(Fmoc-Gln (Trt) -OH)进行延伸偶联,脱除N段带有的Fmoc保护基得到多肽片段 3 (Gin (Trt) -Ala-Ala-Lys (N- ε - (Na-PAL- y -Glu ( a -OtBu)) -Glu (OtBu) -Phe-1le-Ala-Trp (Boc) -Leu-Val-Arg (Pbf) -Gly-Arg (Pbf) -Gly-树脂载体)。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤3具体为: 采用活化试剂和缩合试剂，按照SEQ ID N0:4所示氨基酸序列C端到N端的顺序，先将N端偶联有Fmoc保护基的亮氨酸(Fmoc-Leu-OH)的C端与多肽树脂I的N端偶联后脱Fmoc保护基得到H-Leu-多肽树脂I，然后依次逐个将N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有tBu保护基的酪氨酸(Fmoc-Tyr (tBu)-OH)、两个N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有tBu保护基的丝氨酸(Fmoc-Ser (tBu)-OH)、N端偶联有Fmoc保护基的甘氨酸(Fmoc-Val-OH)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有OtBu保护基的天冬氨酸(Fmoc-Asp (OtBu) -OH)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有tBu保护基的丝氨酸(Fmoc-Ser (tBu)-OH)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有tBu保护基的苏氨酸(Fmoc-Thr (tBu) -OH)、N端偶联有Fmoc保护基的苯丙氨酸(Fmoc-Phe-OH)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有tBu保护基的苏氨酸(FmOC-Thr(tBU)-OH)进行延伸偶联，偶联后脱除N端带有的 Fmoc 保护基,得到多肽树脂 II (Thr (tBu) -Phe-Thr (tBu) -Ser (tBu) -Asp (OtBu)-Val-Ser (tBu) -Ser (tBu) -Tyr (tBu) -Leu-多妝树脂 I )。
6.根据权利要求1-4任意一项所述方法，其特征在于，所述树脂载体为Trityl-Cl类树脂或羟基类树脂。
7.根据权利要求2-4任意一项所述方法，其特征在于，所述裂解液为体积百分比25%的三氟乙醇的二氯甲烷溶液。
8.根据权利要求1-5任意一项所述方法，其特征在于，所述缩合试剂优选为N，N-二异丙基碳二亚胺、N, N- 二环己基碳二亚胺，六氟憐酸苯并二唑-1-基_氧基二吡咯烷基憐/N, N- 二异丙基乙胺、2-(7-氮杂-1H-苯并三氮唑-1-基)-1, I, 3，3-四甲基脲六氟磷酸酯/N，N- 二异丙基乙胺、苯并三氮唑-N，N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸盐/N，N- 二异丙基乙胺、O-苯并三氮唑-N，N，N’，N’ -四甲基脲四氟硼酸酯/N，N- 二异丙基乙胺中的一种。
9.根据权利要求1-5任意一项所述方法，其特征在于，所述活化试剂为1-羟基苯并三唑或N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑。
10.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤5所述酸解采用由体积百分比为80-95%的TFA、体积百分比为1-10%的EDT、余量为水组成的混合酸解液酸解。
【文档编号】C07K1/16GK104004083SQ201410265582
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年6月13日 优先权日:2014年6月13日
【发明者】李向群, 董华建, 郭德文, 文永均 申请人:成都圣诺生物科技股份有限公司