一种动物双歧杆菌细菌素及其生产方法与专用生产菌株的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种动物双歧杆菌细菌素及其生产方法与专用生产菌株。本发明提供的双歧杆菌细菌素，是发酵动物双歧杆菌(Bifidobacterium?animals)BB04?CGMCC?№.7790，得到的细菌素。本发明提供了动物双歧杆菌(Bifidobacterium?animals)BB04?CGMCC?No.7790代谢产细菌素的最佳培养条件。本发明还提供了动物双歧杆菌细菌素的提取纯化方法，即通过pH值吸附解吸法粗提，阳离子交换树脂层析及凝胶过滤层析纯化得到细菌素纯品。本发明所提供的双歧杆菌细菌素分子量为1198.6832Da，是一种新型双歧杆菌细菌素，具有非常良好的食品加工特性，抑菌谱广，安全性高，可用于天然食品生物防腐剂的开发。
【专利说明】一种动物双歧杆菌细菌素及其生产方法与专用生产菌株
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种动物双歧杆菌细菌素及其生产方法与专用生产菌株，属于食品生 物【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 乳酸菌及其活性代谢产物与人类健康密切相关，常常自然存在于食品或被有意识 地引进食品产品中，从而使食品拥有人们渴望的风味、营养及安全性。乳酸菌活性代谢产物 主要涉及乳酸、细菌素、胞外多糖、共轭亚油酸等。乳酸菌细菌素是乳酸菌在代谢过程中通 过核糖体机制合成并分泌到环境中的一类具有抑菌活性的多肽或蛋白类物质，它在人体内 可被降解，具有高效、无抗药性、无毒、无残留等优点，已成为天然食品生物防腐剂研究与开 发的热点。
[0003] 几乎每个乳酸菌属菌株都可以产生细菌素，目前已报道的乳酸菌细菌素已有40 余种。双歧杆菌（Bifidobacterium spp.)是寄生在人和动物肠道内的典型有益乳酸菌， 它可以对宿主发挥生物屏障、营养、免疫、延缓衰老、抗肿瘤等生理作用。业已发现，极少 数双歧杆菌属菌株也可产生细菌素，如两歧双歧杆菌（B. bifidum)NCFB1454、嗜热双歧杆菌 (B. thermophilum)RBL67、婴儿双歧杆菌（B. infants) BCRC14602 等。
[0004] 双歧杆菌是人体肠道健康的重要指标，在食品工业中也占有重要地位，其所产细 菌素也越来越受到人们的重视，必将成为天然生物防腐剂的开发热点。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一株具有广谱抑菌效果的产细菌素双歧杆菌。
[0006] 本发明所提供的双歧杆菌，是动物双歧杆菌（Bifidobacterium animals)BB04,已 于2013年06月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC， 地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），保藏登记号为： CGMCC N〇 . 7790 〇
[0007] 本发明的第二个目的是提供一种双歧杆菌细菌素及其生产方法。
[0008] 本发明所提供的生产双歧杆菌细菌素的方法，是发酵动物双歧杆菌 (Bifidobacterium animals)BB04 CGMCC Ns · 7790 得到的细菌素。
[0009] 所述方法中，用于培养动物双歧杆菌（Bifidobacterium animals)BB04 CGMCC Ns . 7790的培养时间优选为40. 4h，培养基起始pH值优选为6. 94,培养温度优选为34. 5°C。 [0010] 所述方法中，得到的细菌素可按照以下步骤进行提取纯化：采用pH吸附解吸法从 发酵液中提取细菌素，吸附pH值为2. 0-3. 0,解吸pH值为5. 0-7. 0,得到细菌素粗品；进一 步通过阳离子交换树脂层析及凝胶过滤层析纯化，并经冷冻干燥得到细菌素纯品。
[0011] 其中，上述pH吸附解吸法的最佳吸附pH值为3. 0,最佳解吸pH值为6. 0。
[0012] 上述阳离子交换树脂层析以SP Sepharose Fast Flow为填料，用ρΗ5· 5,含0-1M NaCl的0. 02Μ醋酸缓冲液在130min内进行线性梯度洗脱，流速1. OmL/min，收集保留时间 为40-48min的蛋白峰为细菌素活性峰。
[0013] 上述凝胶过滤层析以Sephadex G-10为填料，用ρΗ6· 0,0· 02mol/L磷酸缓冲液进行 洗脱，流速0. 5mL/min，收集保留时间为34-48min的蛋白峰为细菌素活性峰。
[0014] 上述提取纯化所得细菌素分子量为1198. 6832Da。
[0015] 上述方法得到的双歧杆菌细菌素也属于本发明的保护范围。
[0016] 本发明的动物双歧杆菌（Bifidobacterium animals)BB04 CGMCC Ns · 7790 是一种产 细菌素的动物双歧杆菌，该细菌素是一种新型双歧杆菌细菌素，其具有非常良好的食品加 工特性，抑菌谱广，安全性高，可用于天然食品生物防腐剂或微生态制剂的开发。
【专利附图】
【附图说明】
[0017] 图1为不同pH值条件下细菌素对产生菌细胞的吸附率图。
[0018] 图2为细菌素的阳离子交换树脂层析洗脱曲线图。
[0019] 图3为细菌素的凝胶过滤层析洗脱曲线图。
[0020] 图4为细菌素的MALDI-TOF MS (基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱）分析图。
【具体实施方式】
[0021] 下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。应理解，这些实施仅 用于说明本发明而不仅限于本发明。
[0022] 实施例 1、动物双歧杆菌（Bifidobacterium animals)BB04 CGMCC Ns . 7790 的分离 和鉴定
[0023] 1、菌株的筛选
[0024] 无菌称取母乳婴儿粪便25g，迅速放入225mL生理盐水中，再将其10倍梯度稀释 至活菌数K^-K^cfu/mL，然后吸取0. 2mL进行亨盖特厌氧滚管，放于37°C恒温箱培养 48-72h，然后挑选菌落特征为光滑、凸圆、边缘整齐、乳白色或微带黄色、质地柔软的中小菌 落接种于改良MRS液体培养基，厌氧培养24-48h，进行革兰氏染色。挑选革兰氏染色观察有 双歧杆菌形态特征的、周围有透明圈、边缘光滑整齐、白色或微黄色的菌落接种于改良MRS 培养基，分别在有氧和厌氧环境下于37°C培养24h，同时进行Κ0Η、过氧化氢酶、吲哚、代谢 葡萄糖等试验。选取厌氧条件生长、有氧条件不生长、Κ0Η试验阴性、过氧化氢酶试验阴性、 吲哚试验阴性、能代谢葡萄糖但不产气的菌初步确定为筛选出的双歧杆菌。采用牛津杯琼 脂平板扩散法，以肠炎沙门氏菌（Salmonella enteritidis) 13076和单核细胞增生李斯特 菌（Listeria monocytogenes) 54002 (l/2a)为指示菌进行抑菌实验，筛选得到具有较强抑 菌活性的菌株为产细菌素的可疑菌株5株。
[0025] 由于双歧杆菌在发酵过程中会产生细菌素、乳酸、H202等多种具有抑菌活性的物 质，某些双歧杆菌菌体细胞对其他细菌也可能有拮抗作用，因此需要排除这些干扰后对产 细菌素的可疑菌株进行进一步鉴定。主要包括：（1)排除有机酸的干扰：在可疑菌株发酵上 清液中加入Imol/LNaOH，调其pH值为6. 5?7左右，进行抑菌实验，比较排酸前后的抑菌圈 直径。（2)排除H202的干扰：用过氧化氢酶于37°C处理发酵液2h，以未处理发酵液作对照 进行抑菌实验，比较抑菌圈直径差异。（3)排除菌体细胞的干扰：将发酵液于4°C，8000rpm 离心10min，取上清液过微孔滤膜（尺寸Φ 25,孔径0.22 μ m)的细菌过滤器过滤除去菌体 细胞对抑菌实验的影响。（4)用硫酸铵沉淀法粗提细菌素后透析除盐，加入蛋白酶K反应， 以确定细菌素为蛋白类物质。将5株可疑菌株的发酵液排除有机酸、H202及菌体细胞干扰 因素影响并经硫酸铵沉淀、透析处理后检测抑菌活性，发现仅有菌株BB04仍具有较高抑菌 活性。向透析液中加入蛋白酶K(20U/mL)，37°C作用lh后发现抑菌活性消失，具体结果见表 1。综合以上，选择菌株BB04作为目标菌株。
[0026] 表1不同处理对菌株BB04发酵液抑菌活性的影响
【权利要求】
1. 动物双歧杆菌（Bifidobacterium animals) BB04 CGMCC Mj · 7790。
2. -种生产双歧杆菌细菌素的方法，是发酵权利要求1所述的动物双歧杆菌 (Bifidobacterium animals)BB04 CGMCC Ns · 7790,得到的细菌素。
3. 根据权利要求2所述方法，其特征在于：所述培养时间优选为40. 4h，培养基起始pH 值优选为6. 94,培养温度优选为34. 5 °C。
4. 根据权利要求2所述方法，其特征在于：所述方法得到的细菌素按照以下步骤进 行纯化：采用pH吸附解吸法从发酵液中提取细菌素，吸附pH值为2. 0-3. 0,解吸pH值为 5. 0-7. 0,得到细菌素粗品；进一步通过阳离子交换树脂层析及凝胶过滤层析纯化，并经冷 冻干燥得到细菌素纯品。
5. 根据权利要求4所述方法，其特征在于：所述pH吸附解吸法的最佳吸附pH值为3.0， 最佳解吸pH值为6.0。
6. 根据权利要求4所述方法，其特征在于：所述阳离子交换树脂层析以SP S印harose Fast Flow为填料，用pH5. 5,含0-1M NaCl的0. 02M醋酸缓冲液在130min内进行线性梯度 洗脱，流速1. OmL/min，收集保留时间为40-48min的蛋白峰为细菌素活性峰。
7. 根据权利要求4所述方法，其特征在于：所述凝胶过滤层析以Sephadex G-10为填 料，用pH6. 0,0. 02mol/L磷酸缓冲液进行洗脱，流速0. 5mL/min，收集保留时间为34-48min 的蛋白峰为细菌素活性峰。
8. 根据权利要求4所述方法，其特征在于：提取纯化得到的细菌素分子量为 1198.6832Da〇
9. 由权利要求2或3或4中所述方法得到的双歧杆菌细菌素。
【文档编号】C07K1/18GK104046585SQ201410276113
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2014年6月19日 优先权日:2014年6月19日
【发明者】刘国荣, 任丽, 王成涛, 宋振芹, 苏航 申请人:北京工商大学