从天花粉中综合提取多种生物活性成分的方法

从天花粉中综合提取多种生物活性成分的方法
【专利摘要】本发明公开了一种天花粉中综合提取多种生物活性成分的方法。首先天花粉中加入乙醇超声波震荡，加热提取，提取液抽滤，滤液浓缩、干燥，得到醇溶物；所剩滤渣提取，提取液离心，上清液处理后进行蒸发浓缩、干燥，得到水溶性粗多糖；所剩沉淀物加入氢氧化钠溶液进行加热提取，提取液离心，得到上清液处理后得到沉淀碱溶性多糖，洗涤干燥后得到碱溶性粗多糖；所剩沉淀物接着提取天花粉蛋白，提取后所剩沉淀物进一步提取天花粉凝集素；最后所剩的沉淀物洗涤、烘干，得到天花粉淀粉。利用本发明可以从天花粉中综合提取醇溶物、水溶性多糖、碱溶性多糖、蛋白、凝集素和淀粉多种有效生物活性成分，更大程度地利用了天花粉资源，符合目前经济可持续发展。
【专利说明】从天花粉中综合提取多种生物活性成分的方法

【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种从天花粉中提取有效成分的方法，特别是涉及一种从天花粉中综 合提取多种生物活性成分的方法。

【背景技术】
[0002] 天花粉中含有多种生物活性成分，如天花粉蛋白、多糖、皂苷、凝集素等。由于天花 粉蛋白具有引产、抗肿瘤、抗病毒和抗HIV等作用；天花粉多糖具有降血糖、提高免疫力等 活性。因而，目前对二者的研究较多，开发利用也比较深入，而对天花粉中其它生物活性成 分的研究则较少。现有天花粉生物活性物质的提取方法主要以某种单一成分为主，如天花 粉蛋白、天花粉多糖和天花粉凝集素。例如栝楼的块根(天花粉）中天花粉蛋白的含量较低 使得天花粉蛋白的纯品价格非常昂贵。而在提取制备天花粉蛋白、多糖等单一成分时，天 花粉中的其他生物活性成分则被白白丢失，这种提取方式不仅导致提取成本较高，且浪费 了天花粉资源，迄今未见对天花粉中多种生物活性成分综合提取的相关报道。此外，目前提 取的天花粉多糖主要集中在水溶性多糖方面，尚未检索到碱性多糖的提取及功能方面的研 究。超声波辅助提取可以有效提高提取效率，缩短提取时间，节约成本，甚至还可以提高产 品的质量和产量。所以广泛应用于油脂、蛋白、多糖、皂甙类、生物碱、蒽醌类、有机酸等的提 取。因此，为了充分利用资源，研究开发一种从天花粉中综合提取多种生物活性成分的一套 有效而廉价的分离技术非常必要。这将加速天花粉的工业化生产及利用，具有良好的社会 价值及经济效益。


【发明内容】

[0003] 本发明要解决的技术问题是提供一种从天花粉中综合提取多种生物活性成分的 方法。利用本发明技术方案，可以从天花粉中综合提取醇溶物、水溶性多糖、碱溶性多糖、蛋 白、凝集素和淀粉多种有效生物活性成分，更大程度地利用了天花粉资源，符合目前经济可 持续发展。
[0004] 为了解决上述问题，本发明采用的技术方案是： 本发明提供一种从天花粉中综合提取多种生物活性成分的方法，所述提取方法包括以 下步骤： a、 醇溶物的提取： 首先在天花粉中加入5?10倍天花粉重量的乙醇，然后在20?25°C条件下超声波震 荡5?10分钟，超声波处理后加热至80?90°C回流提取2?4小时，移出提取液；将移出 的提取液进行抽滤，所得滤渣按照上面同样方法再提取一次，提取后移出提取液，提取液移 出后再次进行抽滤，所得滤渣用于步骤b进一步提取；合并两次抽滤所得的滤液，将所得滤 液进行减压浓缩，回收乙醇；当滤液浓缩至膏状后再次进行真空干燥，干燥至粉末状，得到 粉状醇溶物； b、 天花粉水溶性多糖的提取： 将步骤a所得滤渣中加入滤渣质量3?6倍的蒸馏水，加热至50?70°C条件下搅拌 提取2?3小时，移出提取液进行离心，离心后移出上清液；在移出上清液后所剩的沉淀物 中加入沉淀物质量3?6倍的蒸馏水，加热至50?70°C条件下搅拌再次提取2?3小时， 移出提取液，进行离心，离心后移出上清液；合并两次离心后得到的上清液，两次提取后所 剩沉淀物用于步骤c进一步提取；将合并后上清液中加入无水乙醇至体积百分浓度为40? 60%，静置收集沉淀物用于步骤c进一步提取，所得上清液进行旋转蒸发，浓缩至原上清液 体积的1/6?1/8,所得浓缩液中加入质量百分浓度为20%的三氯乙酸，当三氯乙酸终浓度 为8%时停止加入，然后搅拌30?60分钟，搅拌后在4°C条件下静置10?16小时，静置后 离心，离心后所得沉淀物用于步骤c进一步提取，所得上清液中加入无水乙醇至体积百分 浓度为70?80%，静置沉淀出的多糖用体积百分浓度为95%的乙醇进行洗涤，洗涤后进行真 空干燥，干燥至粉末状，得到粉状天花粉水溶性粗多糖； c、 天花粉碱溶性多糖的提取： 收集步骤b得到的沉淀物，在收集的沉淀物中加入质量浓度为4%的氢氧化钠水溶液， 所述沉淀物与氢氧化钠溶液二者之间的质量比为1 :3?7,加热至55?65°C条件下提取 30?50分钟，提取后移出提取液，进行离心，离心后移出上清液；移出上清液后的沉淀物按 照同样的方法进行第二次提取，提取后移出提取液、离心分离，移出第二次上清液，同时得 到所剩的沉淀物，该沉淀物用于步骤d进一步提取；合并两次所得上清液，在上清液中加入 浓度为12mol/L浓盐酸中和至pH值为7. 0,接着进行离心，移出上清液，得到沉淀碱溶性多 糖，用水洗涤所得碱溶性多糖3?5次，洗涤后进行真空干燥，干燥至粉末状，得到粉状碱溶 性粗多糖； d、 天花粉蛋白的提取： 在步骤c所剩沉淀物中加入pH值为10的氢氧化钠水溶液，所述沉淀物与氢氧化钠水 溶液二者之间的比例为lg :5?10mL，在4?20°C条件下搅拌提取30?50分钟，提取后移 出提取液进行离心分离，离心分离后移出上清液，得到的沉淀物用于步骤e进一步提取；所 得上清液减压浓缩至原体积的1/5?1/6,所得浓缩液中加入5倍体积的无水乙醇，所述无 水乙醇预先冷却至4?10°C，无水乙醇边加入边搅拌，充分搅拌后于4°C条件下静置18? 22h ;静置后离心，离心后得到沉淀的蛋白；所得蛋白用体积百分浓度为95%乙醇洗涤2?3 次，洗涤后真空干燥至粉末状，得天花粉蛋白； e、 天花粉凝集素的提取： 在步骤d得到的沉淀物中加入pH值5. 5的盐酸水溶液，所述沉淀物与盐酸水溶液二则 之间加入量的比例为lg :5?10mL，然后在4?20°C下搅拌提取12?24小时，提取后移出 提取液，移出提取液后所剩的沉淀物用于步骤f进一步提取；所得提取液中加入饱和硫酸 铵溶液，所述提取液与饱和硫酸铵溶液之间的体积比1 :〇. 1?2,静置收集所得沉淀、透析 过夜后真空干燥至粉末状，干燥后得到天花粉凝集素； f、 天花粉淀粉的提取： 步骤e中所剩的沉淀物首先用蒸馏水洗涤3?5次，以除去沉淀物中残留的盐酸，然后 在100?110°C烘干4?6小时，烘干后得到天花粉淀粉。
[0005] 根据上述的从天花粉中综合提取多种生物活性成分的方法，步骤a中所述在天花 粉中加入5?10倍天花粉重量的乙醇，其乙醇的体积百分浓度为80?95% ;所述超声波震 荡时功率为250W、频率为50KHz。
[0006] 根据上述的从天花粉中综合提取多种生物活性成分的方法，步骤a中所述将所得 滤液进行减压浓缩，减压浓缩时真空度为〇. 07?0. 09MPa、温度为40?80°C ;所述当滤液 浓缩至膏状后再次进行真空干燥，其真空度为〇. 01?〇. 〇7MPa、温度为40?80°C。
[0007] 根据上述的从天花粉中综合提取多种生物活性成分的方法，步骤b中所述所得上 清液进行旋转蒸发，旋转蒸发时压力为〇. 01?IMPa、干燥温度为40?80°C，旋转蒸发仪的 旋转速度为1?120rmp ;所述洗涤后进行真空干燥，其真空度为0. 01?0. 07MPa、温度为 40 ?80°C。
[0008] 根据上述的从天花粉中综合提取多种生物活性成分的方法，步骤c中所述洗涤后 进行真空干燥，其真空度为0. 01?0. 〇7MPa，干燥温度为40?80°C。
[0009] 根据上述的从天花粉中综合提取多种生物活性成分的方法，步骤d中所述所得上 清液减压浓缩至原体积的1/5?1/6,所述减压浓缩采用旋转蒸发仪进行，其压力为0. 01? IMPa，干燥温度为40?80°C，旋转蒸发仪的旋转速度为1?120rmp。
[0010] 根据上述的从天花粉中综合提取多种生物活性成分的方法，步骤d中所述洗涤后 真空干燥至粉末状，真空干燥时真空度为0. 01?0. 〇7MPa、温度为40?80°C。
[0011] 根据上述的从天花粉中综合提取多种生物活性成分的方法，步骤e中所述透析过 夜后真空干燥至粉末状，真空干燥时真空度为0. 01?0. 〇7MPa、温度为40?80°C。
[0012] 本发明的积极有益效果： 1、利用本发明技术方案，可以从天花粉中综合提取醇溶物、水溶性多糖、碱溶性多糖、 蛋白、凝集素和淀粉多种有效生物活性成分，从而更大程度地利用了天花粉资源，符合目前 经济可持续发展。
[0013] 2、提取前采用超声波处理可以破坏细胞壁，有利于细胞内含物的释放，提高后续 的提取效率。
[0014] 3、现有的文献资料在提取天花粉多糖时，只涉及到水溶性多糖的提取及活性鉴 定，本发明在提取水溶性多糖的同时，进一步提取了碱溶性多糖，充分利用了天花粉资源。
[0015] 4、本发明制备方法工艺简单，易于实施，具有快速高效、重复性好，稳定可控，适用 于工业化大规模生产等特点，所得的组分可用于后续研发制备相关药物、保健食品和生物 饲料等相关领域，可以满足不同制剂载体形式对有效成分含量的需求。
[0016] 5、现有的天花粉成分提取仅涉及某一种有效成分，容易造成原料的浪费，且形成 大量残渣，污染环境，而综合同时提取多种有效成分可克服以上缺点，变废为宝，具有明显 的环境效益。
[0017] 6、本发明采用一种连续的方法从天花粉中浸提多种生物活性物质，大大降低了产 品的生产成本，提高了天花粉的利用率，可实现连续化作业，从而提高了生产效率及利用 率，实现天花粉高附加值综合利用，具有明显的经济效益。
[0018]

【专利附图】

【附图说明】： 图1本发明实施例1步骤a所得醇溶物薄层层析结果示意图； 图2本发明实施例1鉴定中熊果酸标准曲线； 图3本发明实施例1鉴定中葡萄糖标准曲线； 图4本发明实施例1鉴定中蛋白质标准曲线。
[0019] 具体实施例方式： 以下结合实施例进一步阐述本发明，但并不限制本发明的内容。
[0020] 实施例1 : 本发明从天花粉中综合提取多种生物活性成分的方法，其详细步骤为： a、 醇溶物的提取： 首先称取l〇〇〇g新鲜天花粉粉碎，粉碎后加入10倍天花粉重量的乙醇（乙醇的体积百 分浓度为95%)，然后在25°C条件下超声波震荡10分钟，超声波处理后加热至90°C回流提 取4小时，移出提取液；将移出的提取液进行抽滤，所得滤渣按照上面同样方法再提取一 次，提取后移出提取液，提取液移出后再次进行抽滤，所得滤渣用于步骤b进一步提取；合 并两次抽滤所得的滤液，将所得滤液进行减压浓缩(减压浓缩过程中真空度为〇. 〇9MPa、温 度为40°C)，回收乙醇；当滤液浓缩至膏状后再次进行真空干燥(其真空度为0. 07MPa、温度 为40°C )，干燥至粉末状，得到粉状醇溶物205. 6g ; b、 天花粉水溶性多糖的提取： 将步骤a抽滤后多次收集的滤渣1000g中加入6kg的蒸馏水，加热至70°C条件下搅拌 提取2小时，移出提取液进行离心，离心后移出上清液；在移出上清液后所剩的沉淀物中加 入蒸馏水，所述沉淀物与蒸馏水二者之间的质量比为1 :6,加热至70°C条件下搅拌再次提 取3小时，移出提取液，进行离心，离心后移出上清液；合并两次离心后得到的上清液，两次 提取后所剩沉淀物用于步骤c进一步提取；将合并后上清液中加入无水乙醇至体积百分浓 度为60%，静置收集沉淀物用于步骤c进一步提取，所得上清液进行旋转蒸发(旋转蒸发时 压力为0. 08MPa、干燥温度为80°C，旋转蒸发仪的旋转速度为lOOrrnp)，浓缩至原上清液体 积的1/6,所得浓缩液中加入质量百分浓度为20%的三氯乙酸，当三氯乙酸终浓度为8%时停 止加入，然后搅拌50分钟，搅拌后在4°C条件下静置14小时，静置后离心，离心后所得沉淀 物用于步骤c进一步提取，所得上清液中加入无水乙醇至体积百分浓度为80%，静置沉淀出 的多糖用体积百分浓度为95%的乙醇进行洗涤，洗涤后进行真空干燥(真空度为0. 07MPa、 温度为40°C)，干燥至粉末状，得到粉状天花粉水溶性粗多糖280g ; c、 天花粉碱溶性多糖的提取： 将步骤b多次收集的沉淀物1000g中加入7kg质量浓度为4%的氢氧化钠水溶液，加热 至65°C提取50分钟，提取后移出提取液，进行离心，离心后移出上清液；移出上清液后的沉 淀物按照同样的方法进行第二次提取，提取后移出提取液、离心分离，移出第二次上清液， 同时得到所剩的沉淀物，该沉淀物用于步骤d进一步提取；合并两次所得上清液，在上清液 中加入浓度为12mol/L浓盐酸中和至pH值为7. 0,接着进行离心，移出上清液，得到沉淀碱 溶性多糖，用水洗涤所得碱溶性多糖3次，洗涤后进行真空干燥(真空度为0. 07MPa，干燥温 度为40°C )，干燥至粉末状，得到粉状碱溶性粗多糖30. 8g ; d、 天花粉蛋白的提取： 称取步骤c多次提取后所剩沉淀物1000g，然后加入pH值为10的氢氧化钠水溶液10L， 在4°C条件下搅拌提取50分钟，提取后移出提取液进行离心分离，离心分离后移出上清液， 得到的沉淀物用于步骤e进一步提取；所得上清液减压浓缩至原体积的1/5(减压浓缩采用 旋转蒸发仪进行，其压力为〇. 〇8MPa，干燥温度为40°C，旋转蒸发仪的旋转速度为lOOrrnp)， 所得浓缩液中加入5倍体积的无水乙醇，所述无水乙醇预先冷却至4°C，无水乙醇边加入边 搅拌，充分搅拌后于4°C条件下静置22小时；静置后离心，离心后得到沉淀的蛋白；所得蛋 白用体积百分浓度为95%乙醇洗涤3次，洗涤后真空干燥至粉末状(真空干燥时真空度为 0. 07MPa、温度为40°C)，得天花粉蛋白10g ; e、天花粉凝集素的提取： 称取步骤d多次提取后得到的沉淀物1000g，然后加入pH值5. 5的盐酸水溶液10L， 然后在4°C下搅拌提取20小时，提取后移出提取液，移出提取液后所剩的沉淀物用于步 骤f进一步提取；所得提取液中加入饱和硫酸铵溶液，所述提取液与饱和硫酸铵溶液之间 的体积比1 :〇. 8,静置收集所得沉淀、透析过夜后真空干燥至粉末状(真空干燥时真空度为 0. 07MPa、温度为40°C)，干燥后得到天花粉凝集素5g ; g、天花粉淀粉的提取： 称取步骤e中多次提取后所剩的沉淀物l〇〇〇g，首先用蒸馏水洗涤3次，以除去沉淀物 中残留的盐酸，然后在l〇〇°C烘干6小时，烘干后得到天花粉淀粉354g。
[0021] 实施例1中各种提取物的鉴定方法如下： (一）步骤a中所得醇溶物的鉴定方法为： 薄层层析法鉴定醇溶物： 首先制备薄层板：取硅胶G 5g加入羧甲基纤维素钠15mL放入研钵，羧甲基纤维素钠 与硅胶G的体积比为3 :1，研磨30分钟至糊状；将研磨好的混合物，均匀的涂在洗干净的载 玻片上，使混合物均匀的在载玻片呈现同一厚度（〇. 25mm) ;100°C烘干lh后备用。称取步 骤a所得提取物0. 087mg/mL上样，将展层剂(三氯甲烷：甲醇：水=9. 8 :4 :0. 2)倒入层析 缸里，盖上层析刚盖子几分钟，待缸内被展层剂蒸汽饱和后，然后将点好样的薄层板底边向 下轻轻斜置缸内溶剂中，密封好层析缸。溶剂前沿距薄板上端约2cm处时，取出板并晾干。 将5%硫酸溶液均匀喷到展层板上，常温下晾干后显色。发现醇溶物中含有大量皂苷(步骤 a所得醇溶物薄层层析结果详见附图1)。
[0022] 皂苷含量测定： 1)标准品溶液的制备： 精密称取熊果酸标准品5mg，用无水乙醇定容于40mL容量瓶中，即得0. 08 mg/mL熊果 酸标准品溶液。
[0023] 2 )标准曲线的制备： 精确量取定容好的熊果酸标准品溶液〇. l、〇. 2、0. 3、0. 4和0. 5 mL，置于带塞的试管中， 在60 °C水浴中挥去无水乙醇溶剂，加入5%香草醛冰醋酸溶液0. 3 mL、高氯酸0. 8mL，混匀 后，密置于60°C水浴中加热15min，取出冰浴冷却后，加入冰醋酸5mL，相应无水乙醇试剂为 空白，在550nm测得吸光值，绘制标准曲线。吸光值（X)对熊果酸标准品浓度（y)做回归处 理，得熊果酸标准曲线（详见附图2):y=0. 097x+0. 023 (R2=0. 995)，熊果酸在8?40 μ g范 围内，与吸收度呈良好的线性关系(详见附图2)。 3)醇溶物含量测定：采用香草醛-高氯酸比色法测定醇溶物中皂苷的含量，将提取的 醇溶物用无水乙醇定容至200mL，取0. 2mL于60°C水浴蒸干，加入5 %香草醒冰醋酸溶液 0. 3mL、高氯酸0. 8mL，混匀后，密置于60°C水浴中加热15 min，取出用冰水浴冷却后，加入冰 醋酸5mL，相应无水乙醇试剂为空白，在550nm测得吸光值。
[0024] (二）步骤b中所得水溶性多糖的鉴定方法为： 1)葡萄糖标准液的配制：精密称取干燥至恒重的葡萄糖200. OOmg，加蒸馏水lOOmL配 制成2mg/mL的葡萄糖标准液备用。蒽酮试剂的配制：100mg蒽酮用76%稀硫酸（76mL浓硫 酸加入30mL水中）定容到100mL，临配新用。
[0025] 2)葡萄糖标准曲线的绘制：精密吸取葡萄糖标准液10、20、30、40和50 μ L于试管 中，分别加蒸馏水至终体积lmL后再分别加入5mL蒽酮试液，立即放入冰水浴中摇匀后，置 沸水浴中煮10分钟，取出自来水冲洗两分钟冷却，静置10分钟后于最大吸收波长624 nm处 开始测定吸光值，重复三次。以蒸馏水1. 〇mL同上法作空白对照。
[0026] 3)葡萄糖标准曲线的建立：以葡萄糖浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，做回归处 理，得回归方程：y = 〇. l〇7x + 0. 013 (R2=0. 998)，葡萄糖在20?100μ g范围内，与吸收度 呈良好的线性关系；得到葡萄糖标准曲线(详见附图3)。
[0027] 4)天花粉水溶性多糖的含量测定：按上述方法进行多糖含量测定。
[0028] (三）步骤c中碱溶性多糖的鉴定方法为： 碱溶性天花粉多糖的鉴定：按上述水溶性天花粉多糖测定方法鉴定。
[0029] (四）步骤d中天花粉蛋白的鉴定方法为： 天花粉蛋白的测定方法：用Bradford方法鉴定天花粉蛋白 1)考马斯亮蓝G-250的配置：取20mg考马斯亮蓝G-250溶于10mL、95%乙醇中，加入 20mL、85%磷酸，用蒸馏水定容至200mL。
[0030] 2)标准蛋白溶液：牛血清蛋白用蒸馏水配成lmg/mL蛋白溶液。精密吸取标准蛋 白溶液10、20、30、40和50 μ L于试管中，用蒸馏水补足至终体积100 μ L，然后再加入考马斯 亮蓝G-250 2. 5 mL，混匀分光光度计在595 nm处测定吸光值，以蒸馏水100 μ L同上法作空 白对照。
[0031] 3)蛋白质标准曲线的建立：以蛋白浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，做回归处理， 得回归方程y=〇. 〇97χ+0. 001 (R2=0. 997)，蛋白质在10?50 yg范围内，与吸收度呈良好 的线性关系；得到蛋白质标准曲线(详见附图4)。
[0032] 4)蛋白质的鉴定：按标准曲线方法测定样品中蛋白含量。
[0033] (五）步骤e中天花粉凝集素的鉴定方法为： 天花粉凝集素样品的制备：采用BCA法测定蛋白含量(参照碧云天试剂盒说明书)，加 生理盐水配制成蛋白含量为200 μ g/mL的溶液。
[0034] 兔血红细胞悬浮液的制备：兔耳静脉抽血EDTA抗凝后，2000r/min离心3min。弃 血浆,生理盐水洗涤3次后，再用生理盐水配成2%的兔红细胞悬液备用。
[0035] 凝集活性测定：在96孔V型血凝板中分别加入（20mmol / L，25 μ L PBS (ρΗ7· 2) 后，分别加入25以1^不同质量倍比稀释的样品（200、100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.56以8/ mL)。每孔加入50 μ L 2%兔红细胞悬液，振荡混勻，室温放置1小时后观察结果。无凝集时 血球沉于V型板底部，呈一小圆点；凝集时红细胞相互集聚呈膜状附于孔底。血凝活力以产 生血凝作用所需的最低凝集素质量浓度（yg / mL)。结果天花粉凝集素最小凝集浓度为 3.13 μ g/mL。
[0036] (六）步骤f中天花粉淀粉的鉴定方法为： 以100 mL水洗涤50g残渣并转移至250mL锥形瓶中，沸水浴加热15min，使淀粉糊化， 待凉至60°C以下，加20mL淀粉酶溶液，50?60°C搅拌保温1小时至加碘不出现蓝色为止。 过滤后定容至250mL，吸取2mL置25mL容量瓶中，同时加入3,5_二硝基水杨酸（DNS)显色 齐[J 1. 5mL，于沸水浴中加热5分钟，冷却后定容至25mL、520nm处测定吸光值，根据葡萄糖标 准曲线计算出酶解后糖的含量，再减去其总糖含量即得淀粉含量。
[0037] 实施例2 : 本发明从天花粉中综合提取多种生物活性成分的方法，其详细步骤为： a、 醇溶物的提取： 首先称取1000g新鲜天花粉粉碎，粉碎后加入7倍天花粉重量的乙醇（乙醇的体积百 分浓度为90%)，然后在25°C条件下超声波震荡7分钟，超声波处理后加热至90°C回流提 取3小时，移出提取液；将移出的提取液进行抽滤，所得滤渣按照上面同样方法再提取一 次，提取后移出提取液，提取液移出后再次进行抽滤，所得滤渣用于步骤b进一步提取；合 并两次抽滤所得的滤液，将所得滤液进行减压浓缩(减压浓缩过程中真空度为〇. 〇8MPa、温 度为60°C)，回收乙醇；当滤液浓缩至膏状后再次进行真空干燥(真空度为0. 05MPa、温度为 60°C)，干燥至粉末状，得到粉状醇溶物180. lg ; b、 天花粉水溶性多糖的提取： 将步骤a多次收集的滤渣800g中加入3. 6kg的蒸馏水，加热至60°C条件下搅拌提取 2小时，移出提取液进行离心，离心后移出上清液；在移出上清液后所剩的沉淀物中加入蒸 馏水，所述沉淀物与蒸馏水二者之间的质量比为1:4. 5,加热至60°C条件下搅拌再次提取 2小时，移出提取液，进行离心，离心后移出上清液；合并两次离心后得到的上清液，两次提 取后所剩沉淀物用于步骤c进一步提取；将合并后上清液中加入无水乙醇至体积百分浓度 为50%，静置收集沉淀物用于步骤c进一步提取，所得上清液进行旋转蒸发(旋转蒸发时压 力为0. 06MPa、干燥温度为60°C，旋转蒸发仪的旋转速度为80rmp)，浓缩至原上清液体积的 1/6,所得浓缩液中加入质量百分浓度为20%的三氯乙酸，当三氯乙酸终浓度为8%时停止加 入，然后搅拌30分钟，搅拌后在4°C条件下静置14小时，静置后离心，离心后所得沉淀物用 于步骤c进一步提取，所得上清液中加入无水乙醇至体积百分浓度为75%，静置沉淀出的多 糖用体积百分浓度为95%的乙醇进行洗涤，洗涤后进行真空干燥(真空度为0. 05MPa、温度 为60°C)，干燥至粉末状，得到粉状天花粉水溶性粗多糖200g ; c、 天花粉碱溶性多糖的提取： 将步骤b多次收集的沉淀物600g中加入3kg质量浓度为4%的氢氧化钠水溶液，加热 至55°C提取40分钟，提取后移出提取液，进行离心，离心后移出上清液；移出上清液后的沉 淀物按照同样的方法进行第二次提取，提取后移出提取液、离心分离，移出第二次上清液， 同时得到所剩的沉淀物，该沉淀物用于步骤d进一步提取；合并两次所得上清液，在上清液 中加入浓度为12mol/L浓盐酸中和至pH值为7. 0,接着进行离心，移出上清液，得到沉淀碱 溶性多糖，用水洗涤所得碱溶性多糖3次，洗涤后进行真空干燥(真空度为0. 05MPa，干燥温 度为60°C )，干燥至粉末状，得到粉状碱溶性粗多糖15. 4g ; d、 天花粉蛋白的提取： 称取步骤c多次收集的所剩沉淀物570g，然后加入pH值为10的氢氧化钠水溶液4L，在 15°C条件下搅拌提取40分钟，提取后移出提取液进行离心分离，离心分离后移出上清液， 得到的沉淀物用于步骤e进一步提取；所得上清液减压浓缩至原体积的1/5(减压浓缩采用 旋转蒸发仪进行，其压力为〇. 〇6MPa，干燥温度为60°C，旋转蒸发仪的旋转速度为80rmp)， 所得浓缩液中加入5倍体积的无水乙醇，所述无水乙醇预先冷却至8°C，无水乙醇边加入边 搅拌，充分搅拌后于4°C条件下静置20小时；静置后离心，离心后得到沉淀的蛋白；所得蛋 白用体积百分浓度为95%乙醇洗涤3次，洗涤后真空干燥至粉末状(真空干燥时真空度为 0. 05MPa、温度为60°C)，得天花粉蛋白4g ; e、 天花粉凝集素的提取： 称取步骤d多次收集的沉淀物550g，然后加入pH值5. 5的盐酸水溶液3. 85L，然后在 15°C下搅拌提取18小时，提取后移出提取液，移出提取液后所剩的沉淀物用于步骤f进一 步提取；所得提取液中加入饱和硫酸铵溶液，所述提取液与饱和硫酸铵溶液之间的体积比 1 :2,静置收集所得沉淀、透析过夜后真空干燥至粉末状(真空干燥时真空度为0. 05MPa、温 度为55°C )，干燥后得到天花粉凝集素2g ; f、 天花粉淀粉的提取： 称取步骤e中多次收集的沉淀物530g，首先用蒸馏水洗涤3次，以除去沉淀物中残留的 盐酸，然后在l〇〇°C烘干6小时，烘干后得到天花粉淀粉170g。
[0038] 实施例3 : 本发明从天花粉中综合提取多种生物活性成分的方法，其详细步骤为： a、 醇溶物的提取： 首先称取1000g新鲜天花粉粉碎，粉碎后加入5倍天花粉重量的乙醇（乙醇的体积百 分浓度为80%)，然后在20°C条件下超声波震荡5分钟，超声波处理后加热至80°C回流提 取2小时，移出提取液；将移出的提取液进行抽滤，所得滤渣按照上面同样方法再提取一 次，提取后移出提取液，提取液移出后再次进行抽滤，所得滤渣用于步骤b进一步提取；合 并两次抽滤所得的滤液，将所得滤液进行减压浓缩(减压浓缩过程中真空度为〇. 〇7MPa、温 度为80°C)，回收乙醇；当滤液浓缩至膏状后再次进行真空干燥(真空度为0. 03MPa、温度为 80°C)，干燥至粉末状，得到粉状醇溶物150g ; b、 天花粉水溶性多糖的提取： 将步骤a第二次抽滤后多次收集的滤渣800g中加入2. 4kg的蒸馏水，加热至50°C条件 下搅拌提取2小时，移出提取液进行离心，离心后移出上清液；在移出上清液后所剩的沉淀 物中加入蒸馏水，所述沉淀物与蒸馏水二者之间的质量比为1:3,加热至50°C条件下搅拌 再次提取2小时，移出提取液，进行离心，离心后移出上清液；合并两次离心后得到的上清 液，两次提取后所剩沉淀物用于步骤c进一步提取；将合并后上清液中加入无水乙醇至体 积百分浓度为40%，静置收集沉淀物用于步骤c进一步提取，所得上清液进行旋转蒸发(旋 转蒸发时压力为〇. 〇4MPa、干燥温度为80°C，旋转蒸发仪的旋转速度为60rmp)，浓缩至原上 清液体积的1/6,所得浓缩液中加入质量百分浓度为20%的三氯乙酸，当三氯乙酸终浓度为 8%时停止加入，然后搅拌30分钟，搅拌后在4°C条件下静置10小时，静置后离心，离心后 所得沉淀物用于步骤c进一步提取，所得上清液中加入无水乙醇至体积百分浓度为70%，静 置沉淀出的多糖用体积百分浓度为95%的乙醇进行洗涤，洗涤后进行真空干燥(真空度为 0. 03MPa、温度为80°C)，干燥至粉末状，得到粉状天花粉水溶性粗多糖170g ; c、 天花粉碱溶性多糖的提取： 将步骤b多次收集的沉淀物600g中加入1. 8kg质量浓度为4%的氢氧化钠水溶液，加热 至55°C提取30分钟，提取后移出提取液，进行离心，离心后移出上清液；移出上清液后的沉 淀物按照同样的方法进行第二次提取，提取后移出提取液、离心分离，移出第二次上清液， 同时得到所剩的沉淀物，该沉淀物用于步骤d进一步提取；合并两次所得上清液，在上清液 中加入浓度为12mol/L浓盐酸中和至pH值为7. 0,接着进行离心，移出上清液，得到沉淀碱 溶性多糖，用水洗涤所得碱溶性多糖3次，洗涤后进行真空干燥(真空度为0. 04MPa，干燥温 度为80°C )，干燥至粉末状，得到粉状碱溶性粗多糖12. 4g ; d、 天花粉蛋白的提取： 称取步骤c多次提取后所剩沉淀物550g,然后加入pH值为10的氢氧化钠水溶液 2. 75L，在20°C条件下搅拌提取30分钟，提取后移出提取液进行离心分离，离心分离后移出 上清液，得到的沉淀物用于步骤e进一步提取；所得上清液减压浓缩至原体积的1/5 (减压 浓缩采用旋转蒸发仪进行，其压力为〇. 〇4MPa，干燥温度为80°C，旋转蒸发仪的旋转速度为 60rmp)，所得浓缩液中加入5倍体积的无水乙醇，所述无水乙醇预先冷却至10°C，无水乙醇 边加入边搅拌，充分搅拌后于4°C条件下静置18小时；静置后离心，离心后得到沉淀的蛋 白；所得蛋白用体积百分浓度为95%乙醇洗涤3次，洗涤后真空干燥至粉末状(真空干燥时 真空度为〇. 〇3MPa、温度为80°C)，得天花粉蛋白2g ; e、 天花粉凝集素的提取： 称取步骤d多次提取后得到的沉淀物500g，然后加入pH值5. 5的盐酸水溶液2. 5L， 然后在20°C下搅拌提取18小时，提取后移出提取液，移出提取液后所剩的沉淀物用于步 骤f进一步提取；所得提取液中加入饱和硫酸铵溶液，所述提取液与饱和硫酸铵溶液之间 的体积比1 :〇. 3,静置收集所得沉淀、透析过夜后真空干燥至粉末状(真空干燥时真空度为 0. 04MPa、温度为75°C)，干燥后得到天花粉凝集素1. 5g ; f、 天花粉淀粉的提取： 称取步骤e中多次提取后所剩的沉淀物400g，首先用蒸馏水洗涤3次，以除去沉淀物中 残留的盐酸，然后在l〇〇°C烘干6小时，烘干后得到天花粉淀粉101g。
【权利要求】
1. 一种从天花粉中综合提取多种生物活性成分的方法，其特征在于，所述提取方法包 括以下步骤： a、 醇溶物的提取： 首先在天花粉中加入5?10倍天花粉重量的乙醇，然后在20?25°C条件下超声波震 荡5?10分钟，超声波处理后加热至80?90°C回流提取2?4小时，移出提取液；将移出 的提取液进行抽滤，所得滤渣按照上面同样方法再提取一次，提取后移出提取液，提取液移 出后再次进行抽滤，所得滤渣用于步骤b进一步提取；合并两次抽滤所得的滤液，将所得滤 液进行减压浓缩，回收乙醇；当滤液浓缩至膏状后再次进行真空干燥，干燥至粉末状，得到 粉状醇溶物； b、 天花粉水溶性多糖的提取： 将步骤a所得滤渣中加入滤渣质量3?6倍的蒸馏水，加热至50?70°C条件下搅拌 提取2?3小时，移出提取液进行离心，离心后移出上清液；在移出上清液后所剩的沉淀物 中加入沉淀物质量3?6倍的蒸馏水，加热至50?70°C条件下搅拌再次提取2?3小时， 移出提取液，进行离心，离心后移出上清液；合并两次离心后得到的上清液，两次提取后所 剩沉淀物用于步骤c进一步提取；将合并后上清液中加入无水乙醇至体积百分浓度为40? 60%，静置收集沉淀物用于步骤c进一步提取，所得上清液进行旋转蒸发，浓缩至原上清液 体积的1/6?1/8,所得浓缩液中加入质量百分浓度为20%的三氯乙酸，当三氯乙酸终浓度 为8%时停止加入，然后搅拌30?60分钟，搅拌后在4°C条件下静置10?16小时，静置后 离心，离心后所得沉淀物用于步骤c进一步提取，所得上清液中加入无水乙醇至体积百分 浓度为70?80%，静置沉淀出的多糖用体积百分浓度为95%的乙醇进行洗涤，洗涤后进行真 空干燥，干燥至粉末状，得到粉状天花粉水溶性粗多糖； c、 天花粉碱溶性多糖的提取： 收集步骤b得到的沉淀物，在收集的沉淀物中加入质量浓度为4%的氢氧化钠水溶液， 所述沉淀物与氢氧化钠溶液二者之间的质量比为1 :3?7,加热至55?65°C条件下提取 30?50分钟，提取后移出提取液，进行离心，离心后移出上清液；移出上清液后的沉淀物按 照同样的方法进行第二次提取，提取后移出提取液、离心分离，移出第二次上清液，同时得 到所剩的沉淀物，该沉淀物用于步骤d进一步提取；合并两次所得上清液，在上清液中加入 浓度为12mol/L浓盐酸中和至pH值为7. 0,接着进行离心，移出上清液，得到沉淀碱溶性多 糖，用水洗涤所得碱溶性多糖3?5次，洗涤后进行真空干燥，干燥至粉末状，得到粉状碱溶 性粗多糖； d、 天花粉蛋白的提取： 在步骤c所剩沉淀物中加入pH值为10的氢氧化钠水溶液，所述沉淀物与氢氧化钠水 溶液二者之间的比例为lg :5?10mL，在4?20°C条件下搅拌提取30?50分钟，提取后移 出提取液进行离心分离，离心分离后移出上清液，得到的沉淀物用于步骤e进一步提取；所 得上清液减压浓缩至原体积的1/5?1/6,所得浓缩液中加入5倍体积的无水乙醇，所述无 水乙醇预先冷却至4?10°C，无水乙醇边加入边搅拌，充分搅拌后于4°C条件下静置18? 22h ;静置后离心，离心后得到沉淀的蛋白；所得蛋白用体积百分浓度为95%乙醇洗涤2?3 次，洗涤后真空干燥至粉末状，得天花粉蛋白； e、 天花粉凝集素的提取： 在步骤d得到的沉淀物中加入pH值5. 5的盐酸水溶液，所述沉淀物与盐酸水溶液二则 之间加入量的比例为lg :5?10mL，然后在4?20°C下搅拌提取12?24小时，提取后移出 提取液，移出提取液后所剩的沉淀物用于步骤f进一步提取；所得提取液中加入饱和硫酸 铵溶液，所述提取液与饱和硫酸铵溶液之间的体积比1 :〇. 1?2,静置收集所得沉淀、透析 过夜后真空干燥至粉末状，干燥后得到天花粉凝集素； f、天花粉淀粉的提取： 步骤e中所剩的沉淀物首先用蒸馏水洗涤3?5次，以除去沉淀物中残留的盐酸，然后 在100?110°C烘干4?6小时，烘干后得到天花粉淀粉。
2. 根据权利要求1所述的从天花粉中综合提取多种生物活性成分的方法，其特征在 于：步骤a中所述在天花粉中加入5?10倍天花粉重量的乙醇，其乙醇的体积百分浓度为 80?95% ;所述超声波震荡时功率为250W、频率为50KHz。
3. 根据权利要求1所述的从天花粉中综合提取多种生物活性成分的方法，其特征在 于：步骤a中所述将所得滤液进行减压浓缩，减压浓缩时真空度为0. 07?0. 09MPa、温度为 40?80°C ;所述当滤液浓缩至膏状后再次进行真空干燥，其真空度为0. 01?0. 07MPa、温 度为40?80°C。
4. 根据权利要求1所述的从天花粉中综合提取多种生物活性成分的方法，其特征在 于：步骤b中所述所得上清液进行旋转蒸发，旋转蒸发时压力为0. 01?IMPa、干燥温度为 40?80°C，旋转蒸发仪的旋转速度为1?120rmp ;所述洗涤后进行真空干燥，其真空度为 0· 01 ?0· 07MPa、温度为 40 ?80°C。
5. 根据权利要求1所述的从天花粉中综合提取多种生物活性成分的方法，其特征在 于：步骤c中所述洗涤后进行真空干燥，其真空度为0. 01?0. 07MPa，干燥温度为40? 80。。。
6. 根据权利要求1所述的从天花粉中综合提取多种生物活性成分的方法，其特征在 于：步骤d中所述所得上清液减压浓缩至原体积的1/5?1/6,所述减压浓缩采用旋转蒸 发仪进行，其压力为〇. 01?IMPa，干燥温度为40?80°C，旋转蒸发仪的旋转速度为1? 120rmp〇
7. 根据权利要求1所述的从天花粉中综合提取多种生物活性成分的方法，其特征在 于：步骤d中所述洗涤后真空干燥至粉末状，真空干燥时真空度为0. 01?0. 07MPa、温度为 40 ?80°C。
8. 根据权利要求1所述的从天花粉中综合提取多种生物活性成分的方法，其特征在 于：步骤e中所述透析过夜后真空干燥至粉末状，真空干燥时真空度为0. 01?0. 07MPa、温 度为40?80°C。
【文档编号】C07K14/42GK104045729SQ201410291925
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2014年6月26日 优先权日:2014年6月26日
【发明者】陈颖, 孙涌栋, 刘明久, 李勇超 申请人:河南科技学院