缓呆肽在制备磷脂酰丝氨酸及治疗神经系统疾病中的应用的制作方法

缓呆肽在制备磷脂酰丝氨酸及治疗神经系统疾病中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种缓呆肽及其制备方法以及其在制备磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine，PS)中的应用及其在治疗中枢神经系统疾病，包括脑力的保健药物中的应用。本发明描述了缓呆肽及其编码该蛋白多肽的多核苷酸序列。同时阐明了该蛋白多肽和多核苷酸的制备方法；并就其在制备磷脂酰丝氨酸中的应用及其在调节神经免疫系统的功能，拮抗阿尔茨海默病(AD)的作用等功能研究做了科学的表述。尤为重要的是指明了该蛋白多肽和多核苷酸在治疗中枢神经系统疾病，包括脑力的保健药物中的应用等巨大开发前景。
【专利说明】缓呆肽在制备磷脂酰丝氨酸及治疗神经系统疾病中的应用
[0001] 本发明描述了缓呆肽及其编码该蛋白多肽的多核苷酸序列。同时阐明了该蛋白多 肽和多核苷酸在制备磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine，PS)和治疗神经系统疾病中的 应用等功能研究做了科学的表述。尤为重要的是指明了该蛋白多肽和多核苷酸的巨大开发 前景。

【技术领域】 [0002] 本发明所属领域包括以下内容。
[0003] 1)分子生物学范畴。
[0004] 2)蛋白分子研究领域。
[0005] 3)免疫学功能研究领域。
[0006] 4)疾病治疗医学研究领域。

【背景技术】
[0007] 1)分子生物学：本申请的主体是缓呆肽及其编码该蛋白多肽的多核苷酸序列。而 该蛋白质基因是从Daudi细胞中提取mRNA，经剪切、拼接变构，克隆获得了不含膜结合部位 及信号肽的，可编码199个氨基酸的缓呆肽cDNA序列。
[0008] 2)蛋白分子研究：同时建立了稳定表达有增强型绿色荧光蛋白和无绿色荧光蛋 白的融合蛋白的CH0细胞株，大批量提取蛋白，检测其水解和磷脂酰基转移活性，并进行体 内用药的示踪定位，从而为进一步研究缓呆肽的生物催化作用及其药效奠定基础。
[0009] 3)生物催化功能研究：
[0010] 缓呆肽也是一种活性酶，其底物有磷脂酰肌醇（phosph-ateidylinasitol), 磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine)等，但其主要的底物为磷脂酰胆碱 (phosphatidylcholine，PC)。在生理条件下，缓呆肽水解PC产生PA和胆碱；另一 方面，PLD在有合适醇类受体存在的情况下，还能催化各种含羟基的底物结合到磷 脂的碱基上，形成新的磷脂。这一特性即转酰基活性，该反应叫做转磷脂酰基反应 (transphosphat-idylation reaction)或喊基交换反应（base exchange)。在短链伯醇存 在的情况下，PLD优先催化PC与短链伯醇发生转磷脂酰基（transphosphatidylation)反 应，产生稳定的磷脂酰醇（phasphatidylaleohol)和水。转磷脂酰基反应是目前检测PLD 活性的特异性反应，许多研究也利用此反应抑制缓呆肽的生理性产物PA的生成。
[0011] 4)抗炎及神经免疫调节功能的研究：
[0012] 通过运用Αβ 1-40脑内注射建立AD模型，并采用免疫组化、尼氏染色、ELISA等多 种实验手段，我们证实了缓呆肽不仅脑内注射无明显毒性，而且和与PS-样对阿尔茨海默 病（AD)干预有效。
[0013] 因为缓呆肽注入脑内后可迁移至皮质、丘脑，少部分停留于海马，通过与细胞膜融 合定位于细胞膜表面，对AD起到与PS干预效果类似的减轻作用。另缓呆肽不仅可以对AD 的行为学改变起到减轻作用，还能抑制AD病程中的神经元丢失、椎体层断裂等病理改变， 对神经元起到保护作用。缓呆肽还能够抑制T淋巴细胞向AD模型脑实质中的浸润以及脑 内TGF-β 1的分泌；并能抑制外周血Thl型细胞的增多；尤其是我们的实验还首次证实了 缓呆肽能够抑制AD模型中Treg细胞的减少，促进Foxp3表达的作用。
[0014] 缓呆肽拮抗AD的可能机制为发挥其转酰基活性催化得到PS，进而通过PS发挥抗 AD的效果；通过缓呆肽本身所具有的神经元保护功能，提高神经元的存活率；还可能通过 抑制TGF-β 1、IFN-y等炎性介质的释放以及促进Treg细胞的增多等功能，发挥拮抗AD的 作用。


【发明内容】

[0015] (一）缓呆肽的应用：本申请的主体是缓呆肽具有磷脂酰基转移活性，能催化大豆 卵磷脂（PC)生成磷脂酰丝氨酸（PS)产品；不仅可体内定位示踪，还可以具有调节神经免疫 系统的功能，达到拮抗阿尔茨海默病（AD)的作用。
[0016] (二）发明的特征
[0017] 1、缓呆肽的特征：
[0018] 1)本研究室已纯化干燥的缓呆肽蛋白产品是一种无味的白色或淡黄色的粉末。较 易溶于水，其溶解度在常温下为88-100%。缓呆肽蛋白分子量为48KD。
[0019] 融合蛋白缓呆肽的转酰基活性为：20-60U/mg。其生物学活性有效范围约在 0. 5ng/ml-150mg/ml〇 最佳范围：3. Ong/ml-80 μ g/ml，2mg/ml-10mg/ml 〇
[0020] 2)其编码基因序列为不含膜结合部位及信号肽的，可编码199个氨基酸的缓呆肽 cDNA 序列，全长 605bp。详见 SEQ ID N0:1。
[0021] 3)缓呆肽的氨基酸多肽序列，全长199个氨基酸。详见SEQ ID NO:2。
[0022] 2、缓呆肽的应用特点
[0023] 1)本发明人通过基因变构重组表达了具有较高活性的缓呆肽。现经实验证实该物 质具有水解活性，而且具有磷脂酰基转移活性。可利用缓呆肽催化大豆卵磷脂与L-丝氨酸 制备得到磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine，PS)。
[0024] 2)本发明人通过大量实验数据表明：缓呆肽和PS -样均具有拮抗阿尔茨海默病 (AD)的作用。
[0025] 本发明的目的：
[0026] 1.提供分离的新的缓呆肽多肽，它包含：具有SEQ ID N0. 2氨基酸序列的多肽、或 其保守性变体、生物活性片段、类似物或衍生物。
[0027] 2.提供编码该多肽的多核苷酸。它包含选自下组的一种核苷酸序列或其变体：
[0028] (a)编码具有SEQ ID N0. 2氨基酸序列的多肽的多核苷酸；
[0029] (b)与多核苷酸（a)互补的多核苷酸；
[0030] (c)与（a)或（b)的多核苷酸序列具有至少88%相同性的多核苷酸。
[0031] 即本发明提供了分离的核酸（多核苷酸），基本由编码具有SEQ ID N0. 2氨基酸序 列的多肽的多核苷酸组成。本发明的多核苷酸序列包括SEQ ID NO. 1的核苷酸序列。
[0032] 3.本发明的多核苷酸可以是DNA形式或是RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组 DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编 码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO. 1所示的编码区序列相同或者是简并的变异 体。编码SEQ ID N0. 2的成熟多肽的多核苷酸包括：只有成熟多肽的编码序列；成熟多肽的 编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列（和任选的附加编码序列）以及非编 码序列。
[0033] 4.本发明还涉及上述描述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序 列的多肽或多肽的片断、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变 异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异 体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸 的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
[0034] 5.本发明提供了一种新的多肽一一缓呆肽，其基本上是由SEQ ID N0. 2所示的氨 基酸序列组成的。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组 技术从原核或真核宿主（例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞）中产生。根据 重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的 多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
[0035] 6.提供含有编码缓呆肽的多核苷酸的重组载体。特别是表达载体；本发明中，编 码缓呆肽的多核苷酸序列可插入到载体中，以构成含有本发明所述多核苷酸的重组载体。 包括本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病 毒、逆转录病毒或其它载体。
[0036] 本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体/转录调控元件（如启动子、增 强子等）和选择性标记基因。
[0037] 7.提供含有编码缓呆肽的多核苷酸的基因工程化宿主细胞。本发明中，缓呆肽的 多核苷酸或含有该多核苷酸的重组载体可转化或转导入宿主细胞，以构成含有该多核苷酸 或重组载体的基因工程化宿主细胞。术语"宿主细胞"指原核细胞，如细菌细胞；或是低等 真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链 霉菌属；细菌细胞如鼠伤寒沙门氏菌；真菌细胞如酵母；植物细胞；昆虫细胞如果蝇S2或 Sf9 ;动物细胞如CHO、C0S或Bowes黑素瘤细胞等。
[0038] 8.提供生产缓呆肽的方法。用本发明所述的DNA序列或含有所述DNA序列的重 组载体转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠 杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl 2法处理，所用的步骤在 本领域众所周知。可供选择的是用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿 主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，或者常规机械方法如显微注 射、电穿孔、脂质体包装等。
[0039] 通过常规的重组DNA技术，利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产重组的 缓呆肽。一般来说有以下步骤：
[0040] (1)用本发明的编码缓呆肽的多核苷酸（或变异体），或用含有该多核苷酸的重组 表达载体转化或转导合适的宿主细胞；（2)在合适的培养基中培养宿主细胞；（3)从培养基 或细胞中分离、纯化蛋白质。
[0041] 在步骤（2)中，根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养 基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合 适的方法（如温度转换或化学诱导）诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
[0042] 在步骤（3)中，重组多肽可包被于细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。 如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。 这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法包括但并不限于：常规的复性处理、蛋白 沉淀剂处理（盐析方法）、离心、渗透破菌、超声波处理、超离心、分子筛层析（凝胶过滤）、 吸附层析、离子交换层析、高效液相层析（HPLc)和其它各种液相层析技术及这些方法的结 合。
[0043] 9.本发明的编码缓呆肽的特异的多核苷酸序列能用多种方法获得。例如，用本领 域熟知的杂交技术分离多核苷酸。这些技术包括但不局限于：1)用探针与基因组或CDNA文 库杂交以检出同源的多核苷酸序列，和2)表达文库的抗体筛选以检出具有共同结构特征 的克隆的多核苷酸片段。
[0044] 10.提供针对本发明的缓呆肽的抗体，及涉及一种能与本发明多肽特异性结合的 抗体。
[0045] 11.本发明涉及本发明的多肽或多核苷酸在制备磷脂酰丝氨酸中的应用。即本发 明提供了一种用缓呆肽酶解大豆磷脂生产磷脂酰丝氨酸的工艺流程和技术。
[0046] 12.可以将本发明的多肽、多核苷酸及其模拟物、激动剂、拮抗剂和抑制剂与合适 的药物载体组合后使用。这些载体可以是水、葡萄糖、乙醇、盐类、缓冲液、甘油以及它们的 组合。组合物包含安全有效量的多肽或拮抗剂以及不影响药物效果的载体和赋形剂。这些 组合物可以作为药物用于中枢神经系统疾病（阿尔茨海默病：AD)的防治，包括脑力的保 健等。
[0047] 本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。

【专利附图】

【附图说明】
[0048] 下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的 本发明范围。
[0049] 图1是本发明缓呆肽的PCR产物凝胶电泳图。
[0050] 图2为缓呆肽蛋白的Western blot检测图。蛋白质的分子量为48kDa。
[0051] 图1. PCR产物凝胶电泳图图2.蛋白的Western blot检测图
[0052] M: Marker 1.重组质粒 pEGFP-缓呆肤 M. Marker ;
[0053] 2. Hind III和BamH I双酶切重组质粒pEGFP -缓呆肽 1 · pEGFP-缓呆肽转染 C0S-7细胞
[0054] 2.空质粒转染C0S-7细胞；
[0055] 3. C0S-7细胞 4.不加样品
[0056] 图3是本发明缓呆肽和人磷脂酶的氨基酸序列同源性比较图。FROM NET是缓呆 肽。
[0057] 图4.缓呆肽催化大豆卵磷脂（PC)生成磷脂酰丝氨酸（PS)的薄层层析图
[0058] 泳道1，2为标准PS，曝光前后PS斑点均可清晰显示
[0059] 泳道3, 4为大豆卵磷脂（PC)，PC斑点显示清晰
[0060] 泳道5, 6, 7为为用缓呆肽催化大豆卵磷脂（PC)和L-丝氨酸后的反应生成物，在 与标准PS位点同一水平上可见清晰的斑点，说明反应生成物中含有PS。

【具体实施方式】
[0061] ( 一）实施案例
[0062] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如 sanlbrook等人，分子克隆：实验室手册（New York :cold Spring Harbor Laboratory Pres s，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0063] 实施例1:缓呆肽的克隆
[0064] 缓呆肽的克隆系列：根据研究及应用的需要，我们构建了一系列的缓呆肽克隆。
[0065] 根据GenBank公布的已知的cDNA序列进行引物设计与合成。含有HKD1结构基因 PLD2cDNA的上下游引物为：
[0066] 克隆 1: 1F5, -CG AAG CTT GT GTC CGT GTG TCT ATT CTG-3,（SEQ ID N0. 3); 1R5'-GC GAT ATC TCC AAG GTC AGT CAG TCG G-3'（SEQ ID N0.4);预期扩增片段长 248bp。
[0067] 克隆2:含有HKD2结构基因 cDNA的上下游引物为：2F :5' -CG GAT ATC TCA ATC CTG CAT CGC CT-3'（SEQ ID NO. 5) ;2R :5' -CG GGT ACC GGC CAG CTC ACT GTC CCG-3'（SEQ ID N0.6);预期扩增片段长219bp。
[0068] 克隆3:含有CT结构基因 cDNA的上下游引物为3F :5' -CG GGT ACC TTG GCT CGG TCT GAG CTC-3'（SEQ ID NO. 7) ;3R:5'-CG GGA TCC CTA TGT CCA CAC TTC TAG GG-3'（SEQ ID NO. 8);预期扩增片段长132bp。
[0069] 克隆 4:pEGFP-Cl_ 缓呆肽 _6His
[0070] 根据重组质粒pEGFP-缓呆肽的测序报告，委托上海英骏生物工程技术服务有限 公司进行引物的设计与合成。在原下游引物3'端连续引入6个编码组氨酸的序列，上下游 引物分别引入相应的酶切位点（上游用HindIII限制性酶切位点；下游用BamHI限制性酶切 位点）和保护碱基。引物序列如下：
[0071] 上游引物为：F5' -CG MG CTT GT GTC CGT GTG TCT ATT CTG-3'（SEQ ID N0. 9)
[0072] 下游引物为：R5' -CG GGA TCC CTA ATG ATG ATG ATG ATG ATG TGT CCA CAC TTC TAG GG-3/ (SEQ ID NO. 10)
[0073] 将引物用灭菌双蒸水溶解，每条引物浓度均为10 μ M，_20°C保存备用。并分别引入 HindIII、EcoR V、KpnI、BamH I 限制性内切酶位点。
[0074] 克隆5:重组质粒pcDNA3. 1-缓呆肽_6His
[0075] 具体步骤参照《分子克隆》。DNA序列测定表明：PCR产物的DNA序列与序列表 〈210>1所示的l-605bp完全相同。（见图1.)
[0076] 表1. RT-PCR的引物序列
[0077] Primerl ：5'-CG AAG CTT GT GTC CGT GTG TCT ATT CTG-3' (SEQ ID NO:3)
[0078] Primer2 :5'-GC GAT ATC TCC AAG GTC AGT CAG TCG G-3'（SEQ ID N0:4)
[0079] Primer3 :5,-CG GAT ATC TCA ATC CTG CAT CGC CT-3, （SEQ ID N0:5)
[0080] Primer4 :5,-CG GGT ACC GGC CAG CTC ACT GTC CCG-3,（SEQ ID N0:6)
[0081] Primer5 :5'-CG GGT ACC TTG GCT CGG TCT GAG CTC-3'（SEQ ID N0:7)
[0082] Primer6 :5'-CG GGA TCC CTA TGT CCA CAC TTC TAG GG-3' （SEQ ID N0:8)
[0083] Primer7 :5'-CG AAG CTT GT GTC CGT GTG TCT ATT CTG-3'（SEQ ID N0:9)
[0084] Primer8 :5'-CG GGA TCC CTA ATG ATG ATG ATG ATG ATG TGT CCA CAC TTC TAG GG-3' (SEQ ID NO:10)
[0085] 实施例2:缓呆肽表达载体的构建
[0086] PCR产物采用基因内引物PCR扩增和基因内限制性内切酶酶切方法进行分析鉴定 正确后，克隆到载体pUCm-Tvector/pSK或pEGFP-Cl真核表达载体上。分别采用酶切、PCR 及测序鉴定其正确性。继而获得了不含膜结合部位及信号肽的，可编码199个氨基酸的缓 呆肤cDNA序列。
[0087] 克隆2:重组质粒pcDNA3. 1-缓呆肽_6His
[0088] 克隆 3:pEGFP-Cl_ 缓呆肽 _6His
[0089] 实施例3:缓呆肽蛋白的鉴定及活性分析
[0090] 缓呆肽蛋白的检测
[0091] 具体检测方法同3. 3. 3. 2,设1泳道加预染蛋白MarkerlO μ 1，用上样缓冲液补至 30 μ 1，另设3个泳道分别加 pEGFP-缓呆肽转染的CH0细胞株，空质粒pEGFP-Cl转染的CH0 细胞株，未转染CH0细胞株的总蛋白各30 μ 1，依次用鼠抗人PLD2 -抗和山羊抗小鼠二抗孵 育。
[0092] 融合蛋白pEGFP-缓呆肽活性的测定
[0093] 融合蛋白pEGFP-缓呆肽水解活性的测定
[0094] 样品准备
[0095] (1)准备好60mm细胞培养皿的待测培养细胞（约5X 106细胞）。
[0096] ⑵小心加入3mlGENMED清理液，覆盖细胞生长表面。
[0097] (3)小心抽去清理液。
[0098] (4)使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞。
[0099] (5)加入3mlGENMED清理液，混匀细胞。
[0100] (6)移入到预冷的15ml锥形离心管
[0101] (7)放进4°C台式离心机，300g离心5min。
[0102] (8)小心抽去上清液。
[0103] (9)加入500 μ 1GENMED裂解液，充分混匀。
[0104] (10)转移到预冷的1. 5ml的离心管中。
[0105] (11)强力游润震荡15秒。
[0106] (12)置于冰槽里孵育30分钟。
[0107] (13)放进4°C台式离心机，16000g离心5min。
[0108] (14)小心移取500 μ 1上清液到新的预冷的1. 5ml离心管。
[0109] (15)取20 μ 1进行蛋白定量检测。
[0110] (16)即刻放进-80°c保存或置于冰槽里继续后续操作。
[0111] 细胞总蛋白的定量测定
[0112] 用Braford方法测定蛋白浓度，具体方法见下：
[0113] (1)配制蛋白标准品：0· 5mgBSA加入到lmlPBS中，完全溶解。
[0114] (2)将蛋白标准品按照 0 μ 1，1 μ 1，2 μ 1，4 μ 1，8 μ 1，12 μ 1，16 μ 1，20 μ 1 分别加 入到96孔酶标反应板中，再加入PBS至总体积20 μ 1。
[0115] (3)将所提取的蛋白样品10 μ 1加入到96孔酶标板中，用PBS补充到20 μ 1。做 2个复孔。
[0116] (4)各孔加入200 μ 1G250染色液，室温放置5min。将标准品的第一个孔设为试剂 对照组，用酶标仪测定波长570nm处的吸光度，结果见表3。
[0117] (5)根据蛋白标准的浓度与吸光度之间的关系，绘制标准曲线，计算的蛋白样品浓 度。
[0118] 缓呆肽水解活性的测定
[0119] 用GENMED细胞缓呆肽水解活性酶连续循环比色法定量检测试剂盒检测缓呆肽的 水解活性，其具体的检测原理为：磷脂酰胆碱在突触核蛋白敏感性缓呆肽的作用下，水解产 生磷脂酸和胆碱后，通过肌胆碱激酶，丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶系统，测定还原型烟酰胺腺 嘌呤二核苷酸转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的峰值变化，来定量分析缓呆肽的水解 活性。缓呆肽连续循环反应体系为：
[0120]

【权利要求】
1. 一种新的缓呆肽及其编码该蛋白多肽的多核苷酸序列。它包含：由各种表达载体表 达的pEGFP-缓呆肽融合蛋白，缓呆肽融合蛋白，或其保守性变体、生物活性片段、类似物或 衍生物。也包含具有SEQ ID NO. 2氨基酸序列的多肽。
2. 能编码该多肽的多核苷酸，具有SEQ ID NO. 1多核苷酸序列。它也包含选自能编码 下组氨基酸的一种核苷酸序列或其变体。 (a)编码具有SEQ ID NO. 2氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(b)与多核苷酸（a)互补的 多核苷酸；（c)与（a)或（b)的多核苷酸序列具有至少88%相同性的多核苷酸；更佳地，该 多核苷酸的序列是能编码选自下组的一种：（a)具有SEQ ID NO. 2中49一56位的序列；和 (b)具有SEQ ID NO. 2中124 -131位的序列；和（c)具有SEQ ID NO. 2中170-179位的 序列。
3. 如权利要求1或2所述的多核苷酸的变异体，其编码与该有相同的氨基酸序列的多 肽或多肽的片断、类似物和衍生物；此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或 非天然发生的变异体；这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体；如 本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取 代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
4. 一种新的多肽一缓呆肽，其基本上是由SEQ ID N0 :2所示的氨基酸序列组成的； 该多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主 (例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞）中产生；根据重组生产方案所用的宿 主，该的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的；该多肽还可包括或不包括起始的甲硫 氨酸残基。
5. 含有编码权利要求2所述的缓呆肽的多核苷酸的重组载体，特别是表达载体；含有 编码缓呆肽的多核苷酸的基因工程化宿主细胞；编码缓呆肽的多核苷酸序列可插入到载 体中，以构成含有该所述多核苷酸的重组载体；包括本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母 质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其它载体；缓呆肽的多核 苷酸或含有该多核苷酸的重组载体可转化或转导入宿主细胞，以构成含有该多核苷酸或重 组载体的基因工程化宿主细胞；术语"宿主细胞"指原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核 细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞；代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌 属；细菌细胞如鼠伤寒沙门氏菌；真菌细胞如酵母；植物细胞；昆虫细胞如果蝇S2或Sf9 ; 动物细胞如CHO、COS或Bowes黑素瘤细胞等。
6. -种缓呆肽的抗体，及涉及一种能与该多肽特异性结合的抗体。
7. 本发明还涉及本发明的多肽或多核苷酸在制备磷脂酰丝氨酸中的应用。 其特征在于：融合蛋白缓呆肽的转酰基活性为：20-60U/mg。其生物学活性有效范围约 在 0· 5ng/ml-150mg/ml〇 最佳范围：3. Ong/ml-80 μ g/ml，2mg/ml-10mg/ml 〇
8. -种缓呆肽的多肽或多核苷酸在制备治疗中枢神经系统疾病，包括脑力的保健药 物中的应用。其特征在于：缓呆肽的多肽以及该多肽的拮抗剂、激动剂和抑制剂可直接用 于疾病治疗，例如，可治疗中枢神经系统疾病，包括脑力的保健等；包括将该的多肽、多核 苷酸及其模拟物、激动剂、拮抗剂和抑制剂与合适的药物载体组合后使用；这些载体可以是 水、葡萄糖、乙醇、盐类、缓冲液、甘油以及它们的组合；组合物包含安全有效量的多肽或拮 抗剂以及不影响药物效果的载体和赋形剂。
9.根据权利要求8、9所述用途，其特征在于：将缓呆肽或由其制备的磷脂酰丝氨酸或 缓呆肽与磷脂酰丝氨酸的不同比例混合物，添加适当的药用辅料，按常规的制剂工艺，即可 制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、滴丸剂、口服液等口服药物制剂和冻干粉剂、水剂的注射药物制 剂等。
【文档编号】C07K16/40GK104087564SQ201410316859
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年7月4日 优先权日:2014年7月4日
【发明者】朱玲 申请人:福建医科大学