从动物心管制备胶原蛋白肽的方法
【专利摘要】本发明公开了一种从动物心管制备胶原蛋白肽的新型方法。所述方法包括如下步骤：包括新鲜动物心管的低温保持，切碎，浸泡漂洗，磨浆，酸浸提，离心，酶解，纳滤脱盐，除菌冷冻干燥等步骤。本发明的方法具有抽提效果好，所获得胶原蛋白肽具有纯度高、高活性和容易吸收等特点。本发明还提供了通过本发明方法所制备的胶原蛋白肽在制备药物、食品、保健品和化妆品的用途。本发明方法操作简单，生产成本低廉，适用于大规模工业化生产，实现了从动物心管中高效制备高活性胶原蛋白肽的目的。
【专利说明】从动物心管制备胶原蛋白肽的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及从动物心管中制备胶原蛋白肽的方法，属于蛋白质生物化学工程领域。
【背景技术】
[0002]胶原蛋白(Collagen)又称胶原，是由三条肽链拧成的螺旋形纤维状蛋白质，是细胞外结缔组织最重要的水不溶性纤维蛋白，是构成细胞外基质的骨架，占人体蛋白质总量的25% -30%，是人体内含量最多的蛋白质。结缔组织除了含60~70%的水分外，胶原蛋白占了约20~30%，因为有高含量的胶原蛋白，结缔组织具有了一定的结构与机械力学性质，如张力强度、拉力、弹力等以达到支撑、保护的功能。原胶原是由三条α-肽链组成的纤维状蛋白，相互拧成三股螺旋状构型，长300nm，直径1.5nm。胶原蛋白，主要存在于人和动物的皮肤、骨骼、眼睛、牙齿、肌腱、内脏(包括心、胃、肠、膀胱、血管、肺、气管、脑等)部位，所有组织脏器都含有不同数量和种类的胶原蛋白，其功能是维持组织器官的形态和结构，也是修复各损伤组织的重要原料物质。人体胶原蛋白有28种，不同部位所含的胶原蛋白的类型也各不相同。不同类型的胶原蛋白定位于体内的特定组织，也有2-3种不同的胶原存在于同一组织中。血管中主要含有I型和III型胶原蛋白，血管属于上皮组织，其组成中胶原蛋白和硬弹性蛋白含量较高，保证了血管有一定的强度容纳血液，并有一定的渗透性来保证物质交换正常进行。胶原蛋白能维护血管弹性，防止血管破裂、栓塞。
[0003]为了确保胶原蛋白原有构象，我们在低温和低酸碱度的条件下，使用动物心脏大血管，即心管生产富含III型胶原蛋白的产品，并使用酶解法制备胶原蛋白肽。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种从动物心管制备高活性胶原蛋白肽的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤:所述包括如下步骤:动物心管的低温保持，切碎，浸泡漂洗，磨浆，酸抽提，离心，酶解，过滤，纳滤脱盐，除菌冷冻干燥步骤。
[0005]在本发明的又一个方面，对所述动物心管的低温非变性处理包括快速低温冷冻处理；优选地，所述动物为哺乳动物，例如牛、猪、羊等哺乳动物。
[0006]在本发明的又一个方面，利用酸抽提的方法从所述动物心管提取胶原蛋白，所述的酸为有机酸或无机酸，优选为醋酸。
[0007]在本发明的又一个方面，提供了一种从动物心管制备高活性胶原蛋白肽的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤:
[0008]I)取冷冻动物心管，切碎后加入5-10倍体积的清水，用清水反复冲洗3次，去除血水，骨泥磨磨浆后，加入20-40倍体积的2-10%醋酸，搅拌浸提6-12小时，用14000转/离心，收集沉淀得胶原蛋白粗品；
[0009] 2)胶原蛋白粗品加3-5倍重量体积去离子水，搅拌混匀，调pH7_9.0，加入胶原蛋白粗品重量的0.1%胰蛋白酶，42°C保温水解6-8小时，得酶解胶原蛋白肽粗品；
[0010]3)酶解胶原蛋白肽粗品用0.2微米的滤膜过滤，过滤液用截留分子量在400-500道尔顿的纳滤膜纳滤脱盐3-5次，再浓缩到含蛋白肽4-10%，
[0011]上述的脱盐、浓缩步骤如下:先纳滤膜浓缩，然后加水稀释到原体积时再进行纳滤膜浓缩以达到脱盐的目的，反复3-5次；
[0012]4)除菌过滤，冷冻干燥制备高活性的动物心管胶原蛋白肽冻干粉。
[0013]在本发明的一个具体方面，提供了一种从动物心管制备高活性胶原蛋白肽的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤:
[0014]I)取冷冻动物心管，切碎，加5倍体积的清水，浸泡过夜，用清水反复冲洗3次，去除血水，骨泥磨磨浆后，加入20倍体积3%醋酸，搅拌浸提8小时，用14000转/分离心，收集沉淀得胶原蛋白粗品；
[0015]2)沉淀加3-5倍重量体积去离子水，搅拌混匀，调pH8.6，加入胶原蛋白粗品重量的0.1%胰蛋白酶，42°C保温水解8小时，得酶解胶原蛋白肽粗品；
[0016]3)酶解胶原蛋白肽粗品用0.2微米的滤膜过滤，过滤液用截留分子量在400-500道尔顿的纳滤膜纳滤脱盐3次，再浓缩到含蛋白肽4-10%，
[0017]上述的脱盐、浓缩步骤如下:先纳滤膜浓缩，然后加水稀释到原体积时再进行纳滤膜浓缩以达到脱盐的目的，反复3次；
[0018]4)除菌过滤 ，冷冻干燥制备高活性的动物心管胶原蛋白肽冻干粉。
[0019]在本发明的另一个方面，提供了一种胶原蛋白肽产品，当胶原蛋白肽浓度为0.5mmol/mL时，其具有超过40%以上的ACE抑制率；且当胶原蛋白肽浓度为1mmol/mL时，其具有超过60%以上的ACE抑制率；和低于0.55mg/mL IC500
[0020]在本发明的又一个方面，提供了一种胶原蛋白肽产品，当胶原蛋白肽浓度为0.5mmol/mL时，其具有大于45%的ACE抑制率；且当胶原蛋白肽浓度为1mmol/mL时，其具有大于65%的ACE抑制率；和低于0.50mg/mL IC500
[0021]在本发明的另一个方面，提供了通过本发明方法制备的胶原蛋白制品的用途，所述的用途包括将所述的胶原蛋白用于预防和/或防治受试者老化的药物、食品、保健品或化妆品中的应用。其中，所述药物、食品、保健品或化妆品为口服制剂、外用制剂、吸入制剂、经鼻制剂、经直肠制剂、经皮制剂或注射制剂。
[0022]本发明的方法操作简单，生产成本低廉，适用于大规模工业化生产，实现了从动物心管中高效制备胶原蛋白资源。离心和过滤所得到的滤液由于不含有任何有害物质，不会污染环境。本工艺几乎不产生固形废弃物，没有垃圾，无需专门进行垃圾处理。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1、从动物心管制备胶原蛋白肽工艺流程图。
[0024]图2、马尿酸含量测定标准曲线。
[0025]图3、不同胶原蛋白的ACE活性抑制效果。
[0026]图4、不同胶原蛋白的IC5tl比较。
[0027]图5、根据本发明方法所制备的牛、猪和羊心管胶原蛋白肽的冻干粉外部形状。【具体实施方式】
[0028]为了提供对本发明的实质性理解，在下文中以不同的详细程度描述了本发明的某些方面、模式、实施方式、变型和特征。
[0029]在实施本发明的过程中，使用了生物化学、蛋白质生物化学、医学、病理学、动物实验学的很多传统技术。这些技术是熟知的。
[0030]在本发明的一个实施方式中，本发明提供了一种从动物心管制备高活性胶原蛋白肽的新型方法。所述方法包括如下步骤:包括动物心管的低温保持，切碎，浸泡漂洗，磨浆，酸抽提，离心，酶解，过滤，纳滤脱盐，除菌冷冻干燥等步骤(如图1所示)。
[0031]术语“动物”是指动物学意义上的任何动物，优选为哺乳动物。所述哺乳动物可源自于任何种类的动物，包括陆生的或者水生的哺乳动物，本文的陆生哺乳动物包括但不限于人类、猩猩，猴、牛、水牛、野牛、猪、野猪、羊(例如羊盖、绵羊、山羊)、驴、鹿、骆骑、鼠类、马等，本文的水生哺乳动物包括但不限于鲸鱼、河马、海豹等。因此本文中的哺乳动物是指能够提供心管的一切哺乳动物，并且用该心管制备胶原蛋白。
[0032]术语“一”，“一种”和“该”:除非内容清楚指明，否则本说明和所附的权利要求中使用的单数形式“一”，“一种”和“该”包括复数的引用对象。例如，所提及的“一种心管”包括两种不同动物心管或更多种动物心管的组合等。
[0033]在本发明的又一实施方式中，提供了哺乳动物心管的非变性的低温保持方法。所述心管可以整块冷冻保存，也可以成数个大块甚至切碎保存。保存时可以不加任何添加剂或者添加添加剂以防止冻结变性。常用防止心管冻结变性的防护剂本文仅为举例但不限于例如糖类和/或糖醇类。
[0034]本发明可以直接使用新鲜的心管组织也可以使用低温保持过的动物心管组织。
[0035]术语“低温保持”包括“冷藏保持”和“冷冻保藏”两种方式。
[0036]在另一个实施方式中，冷藏保持可在低于约10°C的温度下将所述肉与所述组合物一起温育，例如在(TC以上至约9 °C之间，适合地在约I °C至约5 °C，适合地在约2 °C至约6 °C之间，优选在约2°C至约4°C之间温育。
[0037]当将所述肉与所述组合物在低于约10°C的温度下低温保持，例如在约0°C至约9 0C之间的温度，适合地在约I °C至约5 °C之间的温度，适合地在约2 °C至约5 °C之间的温度，优选在约2°C至约4°C之间的温度温育时，优选将所述肉与所述组合物温育约4小时至约20小时之间。
[0038]在一个实施方式中，适合地，可将所述肉与所述组合物冷冻保藏约I天至35天，适合地一起冷冻保藏约2天至20天小时之间，优选在一起冷冻保藏约5天至10天。
[0039]在另一个实施方式中，可在低于约(TC (比如液态氮)的温度下将所述肉与所述组合物一起冷冻保藏，例如在0°c以下至约-180°c之间，适合地在约-20°c至约-80°c，适合地在约_25°C至约_80°C之间，优选在约_25°C至约_40°C之间冷冻保藏。
[0040]术语“快速低温冷冻”就是将要处理的动物组织，通过喷洒，或者直接置于液氮_180°C等超低温的液体内，达到动物组织瞬间降温的效果。然后再将处理后的动物组织置于所期望的温度中冷冻保存，该方法也可以被称之为“cooling shock”。
[0041] 当将所述肉与所述组合物在低于约0°C (比如液态氮)的温度下将所述肉与所述组合物一起冷冻保藏时，例如在0°c以下至约-180°c之间，适合地在约约-20°c至约-80°c，更适合地在约_25°C至约_80°C之间，优选在约_25°C至约_40°C之间冷冻保藏约5天至8天。
[0042]所述糖类可以是白砂糖、木糖、葡萄糖、聚葡萄糖、果糖、半乳糖、鼠李糖、异麦芽酮糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、海藻糖、低聚果糖、木糖、异麦芽糖、低聚麦芽糖、低聚异麦芽糖、异麦芽酮糖、低聚半乳糖(半乳寡糖)、甘露低聚糖(甘露寡糖)、低聚木糖(木寡糖)、淀粉、纤维素、肝糖原、肌糖原、蛋白多糖、蜂蜜等，这些甜味剂可以单独使用或者由上述甜味剂组成的组的一种或两种以上混合使用；优选为使用白砂糖、海藻糖、木糖、果糖、半乳糖、异麦芽糖、低聚麦芽糖、低聚异麦芽糖、异麦芽酮糖、聚葡萄糖，更优选为海藻糖、异麦芽糖、低聚麦芽糖、低聚异麦芽糖、异麦芽酮糖、和/或聚葡萄糖。用于本发明的糖醇类可以是赤藓糖醇(赤藻糖醇)、木糖醇、山梨糖醇、甘露醇、麦芽糖醇、葡萄糖醇、异麦芽糖醇、木糖醇、乳糖醇和异麦芽酮糖醇，优选为赤藓糖醇、山梨糖醇、异麦芽糖醇，更优选为赤藓糖醇和/或异麦芽糖醇。如果心管组织为1000重量份来计算，糖类和/或糖醇类可以为20-80重量份，合适为20-70重量份，优选为20-65重量份，更优选为20-50重量份，最优选为25-50重量份。
[0043]在本发明的又一个【具体实施方式】中，将动物心管切成切片、块、丝、条、剁碎成肉末和/或机械粉碎成肉糜，优选为肉末或肉糜。使其形状更有利于充分如下抽提步骤。
[0044]在本发明的又一个【具体实施方式】中，对切碎的动物心管进行了浸泡和漂洗。浸泡可以用1-10倍或者10倍以上的清水来进行，温度可以在0-25°C直接任意温度进行，通常在低于10°C、例如8°C 、6°C或4°C，优选4°C。通常浸泡过夜，对于浸泡效果本领域技术人员可以根据实际观察的心管组织的状态做出选择。漂洗可以进一步去除动物心管中的漂浮的脂肪和血水，通常漂洗2次以上，例如3次，4次，5次等。
[0045]在本发明的又一个【具体实施方式】中，对浸泡漂洗后的动物心管进行了酸抽提。所述的酸包括有机酸或无机酸。
[0046]本文中的术语“有机酸”是指单独一种有机酸，或将两种以上的有机酸。用于本发明的所述有机酸选自一元羧酸、二元羧酸和多元羧酸组成的组的一种或两种以上，例如，所述一元羧酸包括但不限于甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、乳酸、辛酸、葵酸、月桂酸、肉桂酸、ARA(花生四烯酸)、硬脂酸、亚麻酸、油酸、亚油酸、芥酸、肉豆蘧酸、葡萄糖酸、棕榈酸，适合地为乳酸、月桂酸、肉桂酸、花生酸、硬脂酸、亚麻酸、油酸、葡萄糖酸、亚油酸、棕榈酸，优选具有乳酸、月桂酸、棕榈酸、硬脂酸、葡萄糖酸。本文仅为举例性质，所述二元羧酸包括但不限于苹果酸、琥珀酸、酒石酸、马来酸、甲基马来酸、富马酸、甲基富马酸、草酸、丙二酸、戊二酸、己二酸、庚二酸、辛二酸、壬二酸，适合地为苹果酸、琥珀酸、酒石酸、马来酸；优选地为苹果酸、琥珀酸。
[0047]术语“无机酸”包括含有卤素、碳、氮、硼、硅、磷、硫等原子的含有氧或者非含有氧原子的所有无机酸；仅为举例性质例如:碳酸、硫酸、亚硫酸、醋酸、硼酸、硝酸、亚硝酸、焦磷酸、亚磷酸、磷酸、氯酸、次氯酸、重铬酸、溴酸、次溴酸、碘酸、次碘酸等；用于本发明的无机酸可以是一种或两种以上的无机酸，优选地，所述无机酸为醋酸、碳酸、硫酸、亚硫酸、硝酸、亚硝酸、焦磷酸、亚磷酸、磷酸所组成的组的一种或两种以上的；更优选地，所述无机酸为醋酸。
[0048]在本发明的进一步优选实施方式中，所述的酸为是硫酸，盐酸，柠檬酸，醋酸，甲酸，丁酸，更优选为醋酸。
[0049]上述酸可以为固体或者是液体，如果是固体一般用水溶解后稀释使用。
[0050]按照体积比，用于抽提的动物心管组织沉淀与液体酸的体积比(vol:vol)为1:2-40，例如1:5-40，1:10-40，或1:20_40。酸的浓度根据具体酸的性质而定，使用醋酸的情况下，可以是 1% -20%，例如 1% -15%,1-10%,2-10%ο
[0051]上述抽提的pH 为 1-6.8，例如 pH 为 6.7,6.6,6.5,6.4,6.2,6.1,6.0,5.9,5.8、
5.7,5.6,5.5,5.4,5.3,5.2,5.1 有时候低于 5 都有可能，例如 pH 低于 4.5,4.0,3.5,3.0，甚至低于2.0。
[0052]抽提的温度可以选择在室温中进行，也可以在低于室温下进行，低于20°C，例如180C、16°C、15°C，合适地 10°C 以下，例如 8°C、6°C、或 4°C。
[0053]抽提时间依据抽提温度、抽提效果和胶原蛋白性质来决定，例如2-24小时，例如，4-20小时，6-16个小时；即使抽提超过24小时也是可能的。在一些实例中进行了过夜抽提，即抽提在通常在8-12小时。本领域技术人员会根据抽提液的浓度和效果选择合理的抽提时间。
[0054]本发明的另一【具体实施方式】是对抽提后样品采用了离心操作，离心可以采用实验室常用的各种离心设备，例如真空离心机，或非真空离心机。也可采用冷冻离心机或者常温离心机。工业化生产的离心机。例如:高速连续离心机，此外离心机离心力的计算为本领域已知的技术。例如，离心机的转速和相对离心力计算公式为:RCF(g)=
11.18X (rpm/1000)2XR
[0055]其中:RCF是英文Relative Centrifugal Forece (相对离心力)的简称，通常以克(g)为单位。RPM为revolut1ns per minute的简称，即每分钟离心机的转了多少转。
[0056]2为开平方
[0057]R为离心机半径，例如水平离心机半径为离心机轴至试管底部的距离，；或垂直式离心机为离心机轴至试管口中央的距离，以厘米(cm)为单位来表示。
[0058]例如水平离心机半径R = 10cm, rpm = 10000时，其RCF = 11180g
[0059]例如垂直式离心机半径R = 15cm, rpm = 10000时,其RCF = 16770g
[0060]通常离心力大小以g为单位进行计算转速的设定，离心力可以在10000g以上，也可以在100g至20000g之间，例如100g至1000g之间，优选为8000g，更优选为lOOOOOg。
[0061]离心也可以以每分转速来表示，例如，在1000、1500、2000、3000、5000、10000转以上，15000转以上，20000转甚至100000转以上。
[0062]离心温度可以选择在室温中进行，也可以在低于室温下进行，例如低于20°C，或低于15°C，优选为低于10°C，更优选为6°C，最优选为4°C。
[0063]离心时间可以为任何小时，基于不能使离心时间过长导致过多的杂质沉淀而导致纯度降低，同时过长时间也容易导致胶原蛋白变性。合适为0.5-2小时，优选为0.5-1个小时,例如I小时，45分钟，30分钟。离心后可以有效去除含有杂质的上清液，保留含有胶原蛋白的沉淀粗品。
[0064]本发明的另一实施方式是对上述离心后胶原蛋白的沉淀粗品进行酶解(利用水解蛋白酶分解胶原蛋白)。本发明使用的水解蛋白酶分解胶原蛋白可以为任何酶，包括但不限于胰蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶中性蛋白蛋、酸性蛋白酶等，优选为胰蛋白酶。
[0065]上述水解时间可以在24小时以上，也可以在24小时以内，但为了水解效果和避免水解带来的降解，比较合适的水解时间为12小时以内，例如2-12小时，2-10个小时，4-8个小时。优选为8小时,更优选为6小时,最优选为4小时。
[0066]在本发明的又一个实施方式中，提供了对酶解胶原蛋白肽粗品过滤和纳滤脱盐的方法，过滤采用了利用板筐压滤机和纳滤机过滤。常用的板筐压滤机有手动板框压滤机、机械板框压滤机和液压板框压滤机，过滤机通常装有过滤膜，膜的大小可以任意调节，例如5微米、2微米、I微米、0.5微米、0.2微米、0.1微米、0.05微米等等。同时采用纳滤机进行浓缩脱盐，常用的纳滤机有空心纤维柱式纳滤机和反渗透纳滤机。纳滤机通常装置有纳滤膜，其大小根据所截留蛋白分子大小的目的而设置，本发明采用了分子量为400-500道尔顿的纳滤膜进行了纳滤脱盐和浓缩。
[0067]在本发明的一个【具体实施方式】中，提供了一种从动物心管制备高活性胶原蛋白肽的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤:
[0068]I)取冷冻动物心管，切碎后加入5-10倍体积的清水，用清水反复冲洗3次，去除血水，骨泥磨磨浆后，加入20-40倍体积的2-10%醋酸，搅拌浸提6-12小时，用14000转/离心，收集沉淀得胶原蛋白粗品；
[0069]2)胶原蛋白粗品加3-5倍重量体积去离子水，搅拌混匀，调pH7_9.0，加入胶原蛋白粗品重量的0.1%胰蛋白酶，42°C保温水解6-8小时，得酶解胶原蛋白肽粗品；
[0070]3)酶解胶原蛋白肽粗品用0.2微米的滤膜过滤，过滤液用截留分子量在400-500道尔顿的纳滤膜纳滤脱盐3-5次，再浓缩到含蛋白肽4-10%，
[0071]上述的脱盐、浓缩步骤如下:先纳滤膜浓缩，然后加水稀释到原体积时再进行纳滤膜浓缩以达到脱盐的目的，反复3-5次；
[0072]4)除菌过滤，冷冻干燥制备高活性的动物心管胶原蛋白肽冻干粉。
[0073]在本发明的进一步【具体实施方式】中，提供了一种从动物心管制备高活性胶原蛋白肽的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤:
[0074]I)取冷冻动物心管，切碎，加5倍体积的清水，浸泡过夜，用清水反复冲洗3次，去除血水，骨泥磨磨浆后，加入20倍体积3%醋酸，搅拌浸提8小时，用14000转/分离心，收集沉淀得胶原蛋白粗品；
[0075]2)沉淀加3-5倍重量体积去离子水，搅拌混匀，调pH8.6，加入胶原蛋白粗品重量的0.1%胰蛋白酶，42°C保温水解8小时，得酶解胶原蛋白肽粗品；
[0076]3)酶解胶原蛋白肽粗品用0.2微米的滤膜过滤，过滤液用截留分子量在400-500道尔顿的纳滤膜纳滤脱盐3次，再浓缩到含蛋白肽4-10%，
[0077]上述的脱盐、浓缩步骤如下:先纳滤膜浓缩，然后加水稀释到原体积时再进行纳滤膜浓缩以达到脱盐的目的，反复3次；
[0078]4)除菌过滤，冷冻干燥制备高活性的动物心管胶原蛋白肽冻干粉。
[0079]在本发明的又一个实施方式中，提供了一种胶原蛋白肽，其以对ACE(血管紧张素转换酶)抑制的百分率和IC5tl来表征。如果以对ACE (血管紧张素转换酶)抑制的百分率作为活力参数，当使用浓度0.lmmol/L本发明所制备的胶原蛋白肽制品时，超过22 %的ACE被抑制，例如大于25%，大于30%，甚至大于35%的ACE被抑制；当使用浓度为0.5mmol/L时，超过40%以上的ACE被抑制，例如大于45%以上或者大于50%以上的ACE被抑制；当使用浓度为lmmol/L时，超过60以上的ACE被抑制，例如大于65%以上或者大于70%以上的ACE被抑制。IC5tl是衡量ACE抑制剂效果的指标，也是对胶原蛋白的活性衡量指标。利用本发明方法所制备的各种心管胶原蛋白的IC5tl均低于0.65mg/mL,例如低于0.60mg/mL、
0.55mg/mL、0.50mg/mL、0.45mg/mL、0.40mg/mLo
[0080]同时，还对所制备的胶原蛋白肽的纯度进行了测定，可以通过现有技术中的常用蛋白质条带染色强度来衡量纯度，在一些实施例中所制备的纯度在60 %以上，例如均在80%以上。在本发明的又一些实施例中通过本发明的方法制备高纯度的胶原蛋白肽，例如纯度在 85%，86%，87%，88%，89%，90%，92%，95%，96% 以上。
[0081]蛋白质纯度的检测采用了常规的MS质谱分析仪，质谱分析仪检测操作规程可参考说明书，通过本发明制备的心管胶原蛋白肽的纯度均在85%以上，例如90%、91%、92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%,99.5%,99.6%,99.7%,99.8%,99.9%,99.95%,99.99%。
[0082]在本发明的一些实施方式中，对蛋白质浓度进行了测定，利用本发明方法制备的胶原蛋白肽的蛋白质浓度在850mg/g以上，例如900mg/g以上，950mg/g以上，980mg/g以上，990mg/g 或 995mg/g 以上。
[0083]在本发明的又一个实施方式中，提供了通过本发明方法制备的胶原蛋白制品的用途，所述的用途包括将所述的胶原蛋白用于预防和/或防治受试者老化的药物、食品、保健品或化妆品中的应用。其中，所述药物、食品、保健品或化妆品为口服制剂、外用制剂、吸入制剂、经鼻制剂、经直肠制剂、经皮制剂或注射制剂。
[0084]在本发明的再一个实施方式中，每天对人施用预防和/或治疗有效量的含有本发明所制备的胶原蛋白肽，上述有效量可以为任何有效量，例如0.5ug/kg、lug/kg或10ug/kg人体重，合适地的有效量包括对人每天施用约lug/kg至约10000mg/kg体重的胶原蛋白肽。
[0085]通过如下实施例描述，更好地理解本发明，但本发明并不仅仅局限于所记载的实施例。
[0086]实施例
[0087]实施例1
[0088]牛屠宰后取新冷冻鲜心管1kg,切碎,加50升自来水,浸泡过夜,次日用清水反复冲洗3次，充分去除血水，用胶体磨磨浆，加入200升3%醋酸，搅拌浸提过夜。用14000转/分离心，收集沉淀。沉淀加30升去离子水，搅拌混匀，调pH8.6，加入30克胰蛋白酶，42°C保温8小时。用0.2微米的膜板筐过滤机过滤，穿过液用纳滤机浓缩到10升，再加入去离子水到30升，搅拌后纳滤浓缩，反复4次，最后浓缩到10升，冷冻干燥，得胶原蛋白肽0.3公斤。实施例2
[0089] 猪屠宰后取新鲜冷冻心管100kg，切碎，加500升自来水，浸泡过夜，次日用清水反复冲洗3次，充分去除血水，用胶体磨磨浆，加入2000升3%醋酸，搅拌浸提过夜。用14000转/分离心，收集沉淀。沉淀加300升去离子水，搅拌混匀，调pH8.6，加入300克胰蛋白酶，42°C保温8小时。用0.2微米的膜板筐过滤机过滤，穿过液用纳滤机浓缩到100升，再加入去离子水到30升，搅拌后纳滤浓缩，反复4次，最后浓缩到100升，冷冻干燥，得胶原蛋白肽
3.5公斤。
[0090]实施例3
[0091]猪屠宰后取新鲜冷冻心管500kg，切碎，加2500升自来水，浸泡过夜，次日用清水反复冲洗3次，充分去除血水，用胶体磨磨浆，加入10000升3%醋酸，搅拌浸提过夜。用14000转/分离心，收集沉淀。沉淀加1500升去离子水，搅拌混匀，调pH8.6，加入3000克胰蛋白酶，42°C保温8小时。用0.2微米的膜板筐过滤机过滤，穿过液用纳滤机浓缩到2500升，再加入去离子水到15000升，搅拌后纳滤浓缩，反复4次，最后浓缩到400升，冷冻干燥，得胶原蛋白肽20公斤。
[0092]实施例4
[0093]实验为使用本工艺制备的猪心管胶原蛋白肽(下文称之为自制猪心管胶原蛋白，为实施例1获得的胶原蛋白肽)与市售的的德国(vikki胶原蛋白，http://www.vikkiup.com/)和法国产胶原蛋白肽(法国罗赛洛(R0USSEL0T)集团，http://cctv.manager8844.com/fIxdtjdbf/)进行血管紧张素转化酶(Ang1tensin-Converting Enzyme,ACE)抑制试验，以此检验我们制备的胶原蛋白肽质量。分为以下几个步骤:
[0094](I)从猪肺中提取血管紧张素转化酶(刘宏，陈兰英.血管紧张素转换酶纯化与性质研究.中国生物化学与分子生物学报，2000，06:788-792 ;刘淑集，王茵，苏永昌，吴成业.血管紧张素转换酶(ACE)的提取与活性验证，福建水产，2009，02:1-5)将200g新鲜猪肺放置冷藏室中12h后用预冷的0.9%的生理盐水清洗，剪成小块，除去脂肪和大血管，加入600mL的蒸馏水，断续匀浆10 X 20s，加入15mL的10% Triton X-100，慢速搅拌30min，4层纱布过滤，滤液4°C离心(6000gX20min),保留上清液，1.6~2.6mol/L硫酸铵分级沉淀，收集沉淀溶液。用预冷的pH 8.3、100mmol/L的磷酸缓冲液(含0.3mol/L NaCl)溶解。溶解液离心后取上清进行透析以及浓缩，得到ACE浓缩液。
[0095](2)马尿酸标准曲线的制作:将马尿酸标准样品用磷酸缓冲液溶解配成Immol/L的标准母液。然后将标准母液稀释成5 μ mol/L、10 μ mol/L、50 μ mol/L、100 μ mol/L、150 μ mol/L、200 μ mol/L系列浓度。经0.45 μ M滤膜过滤后，在228nm下分别测定吸光值。以马尿酸浓度为横坐标，其吸光值为纵坐标，绘制标准曲线(见图2)。
[0096]⑶ ACE活力测定参考Cushman等的(CUSHMAN D ff, CHEUNG H.Spectrophotometricassay and properties of the ang1tensin-converting enzyme of rabbit lung[J].B1chemical Pharmacology, 1971, 20: 1637-1648,和，PRADIPTA B C, SHANTH1.1solat1n of novel b1active reg1ns from bovine Achilles tendon collagenhaving ang1tensin 1-converting enzyme-1nhibitory properties[J].ProcessB1chemistry, 2012, 4712)的经典方法并稍作修改:在37°C，pH8.3的条件下，ACE催化血管紧张素I的模拟物HHL产生马尿酸。产物马尿酸在波长228nm处具有特殊吸收峰。根据马尿酸标准曲线上相对应的值即可进行活性计算。
[0097](4)胶原蛋白对ACE抑制效果的比较:将以上三种胶原蛋白用磷酸缓冲液溶解配成 lmg/mL 的标准母液。经过稀释之后配成 0.01mg/mL、0.05mg/mL、0.lmg/mL、0.5mg/mL、
1.0mg/mL系列浓度后。分别与提取的适量ACE预先混合，将混合物在37°C水浴锅中先温浴 1min。实验具体操作步骤根据 PRADIPTA 等方法(PRADIPTA B C, SHANTH1.1solat1n ofnovel b1active reg1ns from bovine Achilles tendon collagen having ang1tensin1-converting enzyme-1nhibitory properties[J].Process B1chemistry, 2012, 4712),并稍作修改:测量的总体积为350yL，含lOOmmol/L pH 8.3磷酸缓冲液、0.3mol/L NaCl、5mmol/L HHL。在37°C恒温水浴3min，然后加入温浴1min后的混合物启动反应，恒温保持4011^11后，加入25(^1^ lmol/L HCl中止反应。再加入1.5mL乙酸乙酯，用力混合15s，3500转/min离心15min后取出1.0mL酯层转入另一试管中，在120°C的烘箱经30min蒸干,再将它重新溶于1.0mL的磷酸缓冲液中，在228nm处测定吸光值。抑制率的计算方法根据TSAI等的方法(TSAI J S，CHEN J L, BONNIE S P.ACE-1nhibitory peptides identified fromthe muscle protein hydrolysate of hard clam(Meretrix lusoria).Process B1chemistry.，2008，43(7):743-747)。如下式计算:①抑制率) = (ODa-ODb)/(ODa-ODc)，(注:ODa为不存在抑制剂时的光密度；0DBS存在抑制剂与酶时的光密度；0D。为抑制剂与酶都不存在时的光密度。对ACE抑制率达到50%时的抑制剂浓度即为半抑制浓度，记为IC5(I。IC50值越小，说明抑制剂活性越大。
[0098](5)测定结果:不同产地的胶原蛋白对ACE的抑制率结果见表1，根据表1结果绘制的不同来源不同浓度的胶原蛋白ACE活性的抑制曲线见图3。从图3中可以看出当浓度在0.01mg/mL~0.05mg/mL时，三种不同来源的胶原蛋白对ACE活性的抑制率几乎处在同一水平上，并没有表现出明显的活性抑制作用。在加入的浓度到达0.lmg/mL时，自制胶原蛋白对ACE的抑制率就达到了将近30%，而另外两种商品化13父原蛋白的抑制率仅为20%左右。继续升高浓度，自制胶原蛋白依然在ACE抑制作用上表现出很好的效果，在加入浓度为0.5mg/mL时,就已经达到50%以上的ACE抑制率。而在同样的浓度下,另外两种商品化胶原蛋白的ACE抑制率相比其有一定的差距。而当浓度升至lmg/mL时，这种差距进一步被拉大。根据表1中IC5tl结果绘制的不同胶原蛋白对ACE抑制效果柱状图见图4。IC50是一种公认检验ACE抑制剂效果的指标，IC5tl的值越低说明抑制ACE作用的效果越好。如下表I或图3所示，通过计算得出自制猪、牛和羊心管胶原蛋白，德国胶原蛋白以及法国胶原蛋白的 IC5tl 分别为 0.46mg/mL、0.49mg/mL、0.38mg/mL, 0.68mg/mL 和 0.97mg/mL。根据结果绘制不同胶原蛋白IC5tl的比较柱状图见图4，通过分析后发现，自制的胶原蛋白对ACE的抑制效果极显著地超越于另外两种商品化的胶原蛋白(P〈0.01)，其抑制能力甚至接近法国产胶原蛋白的2倍之多。
[0099] 表1不同胶原蛋白对ACE的抑制效果比较
[0100]
【权利要求】
1.一种从动物心管制备胶原蛋白肽的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤:动物心管的低温保持，切碎，浸泡漂洗，磨浆，酸抽提，离心，酶解，纳滤脱盐，除菌冷冻干燥步骤。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述动物心管的低温保持包括将新鲜动物心管进行快速低温冷冻处理步骤。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述酸抽提为醋酸抽提。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纳滤脱盐包括将酶解胶原蛋白肽粗品用0.2微米的滤膜过滤，过滤液用截留分子量为400-500道尔顿的纳滤膜脱盐3-5次，再浓缩到含蛋白肽4-10%的步骤。
5.如上述权利要求所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤: 1)取冷冻动物心管，切碎后加入5-10倍体积的清水，用清水反复冲洗3次，去除血水，骨泥磨磨浆后，加入20-40倍体积的2-10%醋酸，搅拌浸提6-12小时，用14000转/离心，收集沉淀得胶原蛋白粗品； 2)胶原蛋白粗品加3-5倍重量体积去离子水，搅拌混匀，调PH7-9.0，加入胶原蛋白粗品重量的0.1%胰蛋白酶，42°C保温水解6-8小时，得酶解胶原蛋白肽粗品； 3)酶解胶原蛋白肽粗品用0.2微米的滤膜过滤，过滤液用截留分子量在400-500道尔顿的纳滤膜纳滤脱盐3-5次，再浓缩到含蛋白肽4-10%， 上述的脱盐、浓缩步骤如下:先纳滤膜浓缩，然后加水稀释到原体积时再进行纳滤膜浓缩以达到脱盐的目的，反复3-5次； 4)除菌过滤，冷冻干燥制备高活性的动物心管胶原蛋白肽冻干粉。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤: 1)取冷冻动物心管,切碎,加5倍体积的清水，浸泡过夜，用清水反复冲洗3次，去除血水，骨泥磨磨浆后，加入20倍体积3%醋酸，搅拌浸提8小时，用14000转/分离心，收集沉淀得胶原蛋白粗品； 2)沉淀加3-5倍重量体积去离子水，搅拌混匀，调pH8.6，加入胶原蛋白粗品重量的0.1%胰蛋白酶，42°C保温水解8小时，得酶解胶原蛋白肽粗品； 3)酶解胶原蛋白肽粗品用0.2微米的滤膜过滤，过滤液用截留分子量在400-500道尔顿的纳滤膜纳滤脱盐3次，再浓缩到含蛋白肽4-10%， 上述的脱盐、浓缩步骤如下:先纳滤膜浓缩，然后加水稀释到原体积时再进行纳滤膜浓缩以达到脱盐的目的，反复3次； 4)除菌过滤，冷冻干燥制备高活性的动物心管胶原蛋白肽冻干粉。
7.如权利要求1-6所述方法制备的胶原蛋白肽，其特征在于，当胶原蛋白肽浓度为0.5mmol/mL时，其具有超过40%以上的ACE抑制率；且当胶原蛋白肽浓度为1mmoI/mL时，其具有超过60%以上的ACE抑制率；和低于0.55mg/mL IC500
8.如权利要求7所述的胶原蛋白肽,其特征在于，当胶原蛋白肽浓度为0.5mmol/mL时，其具有大于45%的ACE抑制率；且当胶原蛋白肽浓度为1mmol/mL时，其具有大于65%的ACE抑制率；和低于0.50mg/mL IC500
9.如权利要求7或8所述的胶原蛋白肽的用途，所述用途包括将所述的胶原蛋白肽用于预防和/或防治人类老化的药物、食品、保健品或化妆品中的应用。
10.如权利要求9所述的用途，其特征在于:所述药物、食品、保健品或化妆品为口服制剂、外用制剂、吸入制 剂、经鼻制剂、经直肠制剂、经皮制剂或注射制剂。
【文档编号】C07K14/78GK104164468SQ201410398332
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2014年8月13日 优先权日:2014年4月24日
【发明者】刘爽, 邓小霞, 庞玉, 王子华 申请人:吉林省金梓源生物科技有限公司