一种畜禽血中生物活性肽BAPs的提取方法及生物活性肽BAPs和应用的制作方法
【专利摘要】一种畜禽血中生物活性肽BAPs的提取方法，该方法包括对新鲜畜禽血抗凝，分离出血浆和血红蛋白溶液，合并后依次加入第一种蛋白变性剂、二硫键还原剂、第二种蛋白变性剂，通过精确控制水解条件达到限量水解目标，获得无异味的BAPs。该产品剂型多样，性能稳定，经压力蒸汽灭菌，常温贮存，无菌有效期可达2年以上，贮存、运输方便。该生物活性肽应用于美容医学治疗痤疮，有效率达90%以上，还可广泛用于开发肽类试剂、肽类药物以及功能食品和食品添加剂等；本发明方法大大简化了工艺流程、降低生产成本、提高产品质量和产量，BAPs含量高达100g/L左右，回收率在70%以上，适应规模化生产，原料来源充足，易于形成产业化。
【专利说明】一种畜禽血中生物活性肽BAPs的提取方法及生物活性肽 BAPs和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物活性肽（bioactive peptides, BAPs)【技术领域】；具体涉及一种畜 禽血中生物活性肽BAPs的提取方法及生物活性肽BAPs和应用。
【背景技术】
[0002] 畜禽血来源广泛，其中蛋白质含量约19%，营养丰富，与畜禽肉相近，故有"液体肉" 之美誉，具有很高的生物效价。畜禽血经抗凝可分离出约60%的血浆(含蛋白质约8%)和约 40%的血细胞(主要为红细胞，含蛋白质约36%)。红细胞经溶血后释放出血红蛋白，约占全 血蛋白质总量的75%。畜禽血蛋白质不但氨基酸组成平衡，必需氨基酸含量达50%以上，而 且这些蛋白质一级结构的肽链中含有一些在组织水平上引起机体生物学效应的活性肽，如 阿片样肽、抗氧化肽、抗菌肽、血管紧张素转换酶抑制肽等。新鲜畜禽血中的蛋白质通过限 量水解处理后，可以将在母体蛋白中那些没有体现生物学活性的肽段释放出来，获得对机 体具有降血压、抗氧化、抗菌消炎和增强免疫活性等生物学效应的活性肽及其它一些肽链 长度不等的肽类混合物。该肽类混合物不仅能提供人体组织生长所需的营养物质，同时还 具有抗感染、抗衰老、调节人体生理机能的功效。因而有可能从畜禽血中生产出满足人们特 定需求的活性肽，为人类更充分地利用蛋白质资源开辟一条新的途径。
[0003] 几十年来，人们对畜禽血，特别是猪血的利用，一直在进行不断地开发。开始还只 是以少数制作血豆腐、猪血饼、血面条和用于肉类似物、香肠、布丁等的配方中，继后有一小 部分被加工成血粉或发酵血粉，作为饲料添加剂和用于生化制药，生产血红素、蛋白胨等。 由于其色泽不好，血腥味重，适口性差等原因，我国对猪血的利用率并不高，相当大一部分 被废弃，既造成巨大浪费，又污染环境。
[0004] 随着蛋白肽理论的发展和人们对畜禽血化学成分认识的深入，相继发现：①畜禽 血蛋白质经酶促限量水解后主要以小分子肽的形式存在，比完全游离的氨基酸更易、更快 被机体吸收利用，这是肽理论和实践的重大突破。这些小分子肽易溶解、低黏度、抗凝胶形 成性、免消化、能完整地通过肠道直接吸收，适用于不能消化和吸收完整蛋白质的肾病、胃 病和肝病等病人，可以作为他们膳食中蛋白质的主要形式；②小分子肽抗原性低，可以避免 完整蛋白引起的免疫调节过敏反应，对人体无过敏性，不会增加肝脏和肾脏的负担；③血红 蛋白和血浆蛋白酶解产物中含有阿片样肽、抗氧化肽、抗菌肽、血管紧张素转换酶抑制肽、 免疫调节肽、促进钙吸收的酪蛋白磷酸肽、抗血栓肽等活性肽，具有对人体的心血管系统、 消化系统、免疫及神经等系统产生重要的生理调节作用。
[0005] 近20多年来，人们在不断地致力于探索寻找一种合适的方法，对畜禽血进行处理 制备小分子活性肽。随着生物酶技术的迅速发展，利用蛋白酶水解畜禽血以提高其利用率 的研究也越来越多，可供选择水解畜禽血的蛋白酶种类也多。由于蛋白酶作用存在专一性， 单一的蛋白酶对一种蛋白质的水解效果往往有一定的局限性，而且在酶解过程中产生了大 量疏水性氨基酸外露的小肽，使得酶解产物具有很重的苦味，严重限制了该方法的使用和 推广。为了达到较高的水解效果，以降低成本，提高经济实用性，人们探讨了各种因素对复 合酶水解畜禽血红蛋白的影响，对获得的某些活性肽进行分离、纯化、测定。所有这些工作 基本上都集中在对血红蛋白的开发研究上，对占全血总蛋白约25%的血浆蛋白并未见有报 导，基本都被废弃浪费。实际上血红蛋白与血浆蛋白合并，制备混合蛋白水解产物，这才是 目前国内外畜禽血综合利用的主要方向。在欧洲、日本等发达国家，猪血的利用率已经达到 50%以上，他们主要是开发肽类试剂、肽类药物以及功能食品和食品添加剂。
[0006] 尽管前段人们对畜禽血常用的酶解工艺进行了一些改进，也取得了一定的效果， 但真正推广的成果并不多。即便有成果转化为产品的，规模也不大。究其原因，主要存在有 以下几个方面的问题。
[0007] (1)酶的产量有限，成本较高：酶的制备主要有直接提取和微生物发酵两种方法。 直接提取法一般是以动植物作为原料，从中直接提取；微生物发酵法是利用微生物发酵来 生产。直接提取法由于动植物生长周期长，又受地理、气候和季节等因素的影响，原料来源 受到限制,酶产量有限,生产成本较高；微生物发酵法虽然酶产量较大,生产成本也较低,但 由于蛋白酶作用存在专一性，单一种酶往往对一种蛋白质的水解有一定的局限性。在实际 应用中，为了获得较好的水解率，往往需要采用数种酶共同作用。因此，微生物发酵生产的 酶还不能完全替代直接提取法制备的某些酶。
[0008] (2)生产周期长，工艺繁琐：酶解时间一般需要8小时以上，有的甚至长达20多小 时；每种酶都有各自的最适pH值，而酶解液的pH值随着酶解反应中游离氨基含量逐渐升高 而改变，在生产过程中需要不断地调整酶解液的pH值。因此，很难发展成规模化生产。
[0009] (3)产物浓度低，增加了后续处理的困难和成本：在酶解反应的初始阶段，随着底 物浓度的提高酶解反应速度加快，但当底物浓度超过酶解平衡点后，反而抑制了酶解反应 的进行。为保证较高的底物水解率和酶解反应速度，一般选择在30?80g/L作为最适的底 物浓度。因此，酶解反应液中目标产物含量低，必须进行浓缩处理。一般先采用微滤澄清， 再采用超滤浓缩，这样显然大大增加了生产工艺的难度和成本。
[0010] (4)产品去味、脱色存在损耗、成本和安全等问题：畜禽血的酶解液有较重的苦腥 味，适口性差，气味难闻，加上血红素的存在，颜色呈棕褐色，产品必须进行去味、脱色处理。 国内外的一些资料介绍，去味脱色一般采用：①活性炭吸附技术，活性炭虽然成本不高，脱 色去味效果也比较满意，但产物的损耗率高达60% ;②大孔树脂、羧甲基纤维素法，此法成 本较高，不适用于工业化生产；③过氧化氢氧化法，此法不可避免地会使某些目标产物肽氧 化，而且残留的过氧化氢会影响到医药和食品的安全。
[0011] 因此，很有必要探寻一种高效的水解提取方法，对畜禽血蛋白进行精确控制的限 量水解，将在母体蛋白中那些没有体现生物学活性的肽段释放出来，提取出具有前述各种 生物学功能的生物活性肽类物质，为解决畜禽血在医药、试剂和功能食品的规模化生产奠 定基础。
[0012] 如前所述，畜禽血不但富含蛋白质，营养价值高，而且选择性的酶解提取物一活 性肽具有某些生物学功能，国内外的研究和应用主要是开发肽类试剂、肽类药物以及功能 食品和食品添加剂。经检索尚未发现有在美容医学领域中应用于治疗痤疮的报导。
[0013] 痤疮又称青春痘、暗疮，是好发于青春期的一种累及毛囊皮脂腺的慢性炎症性皮 肤病。临床表现为粉刺、丘疹、脓疱、结节、囊肿，多见于面部、胸背部等皮脂溢出区。治疗不 当容易遗留瘢痕和色素沉着等损容性的皮肤损害，严重影响患者的身心健康。痤疮的发生 是多种因素综合作用的结果，主要是由于皮脂分泌过多，雄激素分泌增高或雄、雌激素水平 失衡，毛囊皮脂腺导管角化过度及痤疮丙酸杆菌增殖所致，其中痤疮丙酸杆菌在痤疮的多 个致病环节中起重要作用。
[0014] 痤疮丙酸杆菌是一种革兰染色阳性的厌氧菌，是一种细胞内寄生菌，它可以分泌 蛋白质、酶、脂多糖等成分，也可刺激机体产生抗体，所有这些都能作为致病因素。在稳定生 长阶段的痤疮丙酸杆菌可以刺激单层角质形成细胞产生大量的IL-I a、TNF_a和GM-CSF， 这些细胞因子可以趋化炎细胞到毛囊周围，引起炎症损伤，是炎性寻常型痤疮的发病机理 之一。痤疮丙酸杆菌还可以在没有任何刺激的条件下产生大量的细胞内卟啉，主要是粪卟 啉。在紫外线照射下，皮肤表面的痤疮丙酸杆菌粪卟啉可以产生活性氧，导致严重的皮肤损 害。
[0015] 目前，市场上对痤疮的治疗可谓种类繁多，然而美容医学研究发现，由于抗生素的 不恰当使用，导致了大量的对传统抗生素耐药性痤疮丙酸杆菌的出现，很大程度上影响了 治疗效果。因此，开发天然的不易耐药和安全性高的外用抗痤疮丙酸杆菌药物，成了治疗痤 疮的主要手段之一。痤疮丙酸杆菌的生长繁殖必须有一个厌氧的环境，而毛囊皮脂腺导管 角化过度，再加上皮脂分泌过多，使毛囊细胞粘连且不能正常移行于皮肤表面，形成适合痤 疮丙酸杆菌生长繁殖的局部厌氧环境，其结果导致痤疮久治难愈，而且容易复发。因此，根 治痤疮不但要杀灭痤疮丙酸杆菌，而且还要铲除其生存和继续繁殖的厌氧环境。
【发明内容】
[0016] 本发明的目的在于提供一种高效的、适用于规模化生产的畜禽血（包括血浆蛋白 和血红蛋白）中生物活性肽BAPs的提取方法。
[0017] 本发明的目的还在于提供利用上述生物活性肽BAPs的提取方法制备获得的生物 活性肽。
[0018] 本发明的最后一个目的在于提供上述畜禽血中生物活性肽BAPs在医学美容中治 疗痤疮的应用。
[0019] 本发明的关键技术在于： 1、 应用蛋白变性剂和二硫键还原剂对畜禽血蛋白进行水解的过程中，通过精确控制水 解条件达到限量水解目标，即既能将那些在母体蛋白中没有体现生物学活性的肽段最大限 度地释放出来，又不至于水解过度使释放出来的这些具有生物学活性的肽段再失去活性； 2、 用生物化学方法取代活性炭吸附、微滤和超滤方法，将血红素与目标产物分离，大大 简化生产工艺，提高产品的质量和产量，降低生产成本，以适应规模化生产。
[0020] 本发明的第一个目的是通过以下技术方案来实现的：一种畜禽血中BAPs的提取 方法，包括以下步骤： (1) 采取新鲜畜禽血，加入抗凝剂，混匀抗凝，离心，分离血浆和含红细胞的不溶物，分 别收集； (2) 向步骤（1)所得的含红细胞的不溶物中加入纯水，搅匀后进行冷冻处理，解冻后再 进行均质处理或超声波处理，彻底破碎红细胞，使血红蛋白溶出，离心，除去含红细胞膜碎 片的不溶物，收集血红蛋白溶液； (3) 将步骤（1)所得血浆和步骤（2)所得血红蛋白溶液合并，加入第一种蛋白变性剂至 终浓度为〇. 5?5. O mol/L，70?KKTC处理3?5小时，冷却至室温； (4) 向步骤（3)所得反应产物中加入二硫键还原剂至终浓度为0. 2?0. 5mmol/L，80? 100°C处理20?40min，冷却至室温，用透析法除去反应后产物中残留的试剂； (5) 向步骤（4)所得反应产物中加入第二种蛋白变性剂至终浓度为0. 3?0. 8mol/L， 105?125°C蒸汽压力中处理10?30min，冷却至室温； (6) 用酸试剂调节步骤（5)所得反应产物的pH为3. 0?4. 2,静置，收集上清液； (7) 用碱试剂调节步骤（6)所得上清液的pH为6. 8?7. 2,获得无异味的微黄色生物 活性肽BAPs ; (8) 将步骤（7)所得生物活性肽BAPs灭菌，制得畜禽血液相剂型生物活性肽BAPs ; (9) 将步骤（8)所得畜禽血液相剂型BAPs进行干燥处理，制得畜禽血固相剂型生物活 性肽BAPs。
[0021] 在上述畜禽血中BAPs的提取方法中： 步骤（1)中所述的畜禽血优选为猪血、牛血或鹅血等；所述的抗凝剂优选为柠檬酸钠、 柠檬酸钾或草酸钾等，添加量优选为〇. 35~1. 20kg/每100L新鲜畜禽血；离心时的离心力优 选为200(T2500Xg，离心时间优选为5?lOmin。
[0022] 步骤（2)中纯水的加入量优选为含红细胞的不溶物总体积的5~15%，冷冻处理的 温度优选为-15°C?_25°C，冷冻处理的时间优选为6?24h ;均质处理的压力优选为40? 80Mpa，处理时间优选为5?IOmin ;超声波处理的功率优选为800?1500W，处理时间优选 为5?IOmin ;离心时的离心力优选为3000?4000 Xg,离心时间优选为10?20min。
[0023] 步骤（3)中所述的第一种蛋白变性剂优选为N2H4CCK C12H25SO4Na或CH6ClN3 ;步骤 (4)中所述的二硫键还原剂优选为C3H7N02S、C4H ltlO2S2或C4H4S 2O4Na2 (二巯基丁二酸钠)。
[0024] 步骤（5)中所述的第二种蛋白变性剂优选为KOH、NaOH或Ca(OH)2，步骤（6)中所 述的酸试剂优选为HCl、H 2S04、HClO4或Cl3C2O 2H，步骤（7)中所述的碱试剂优选为Na0H、K0H 或 Ca(0H)2。
[0025] 经步骤（3)?（7)处理，畜禽血的蛋白水解率控制在2(Γ24%。
[0026] 步骤（8)中灭菌处理优选采用在12(Tl25°C蒸汽中高压15~25min，进一步优选在 121°C蒸汽中高压20min，制得畜禽血液相剂型生物活性肽BAPs。
[0027] 步骤（9)中干燥处理可以采用冷冻干燥或喷雾干燥，优选喷雾干燥。
[0028] 蛋白水解率通过以下公式计算：蛋白水解率（％)= (TAN产物一 TANbw)/ (TNbw - TAN原料）X 100, BAPs提取物回收率（％)= TBAPs/TPr原料X 100,其中TAN产物指用甲醛滴定法 测定的步骤（7)中生物活性肽BAPs氨基氮总含量，TANbw是指用甲醛滴定法测定的步骤（3) 中血浆与血红蛋白溶液合并原料中氨基氮总含量，TN是指步骤（3)中血浆与血红蛋白溶 液合并原料中蛋白氮总含量，TN原料=TPr原料X 16% (蛋白质中平均氮含量为16%)，TPr原料是 指用双缩脲法测定的步骤（3)中血浆与血红蛋白溶液合并原料中蛋白总含量，TBAPs是指 用双缩脲法测定的步骤（7)中所得生物活性肽BAPs总含量。
[0029] 蛋白水解率可作为控制和调整蛋白水解条件的指标，以求达到限量水解目标； BAPs提取物回收率可作为优化和改进生产工艺的指标，以求达到最大限度收益。
[0030] 本发明的第二个目的是通过以下技术方案来实现的：利用上述畜禽血中生物活性 肽BAPs的提取方法制备获得的生物活性肽BAPs。
[0031] 本发明的最后一个目的是通过以下技术方案来实现的：上述生物活性肽BAPs在 美容医学领域中制备具有治疗痤疮功效的药物中的用途。
[0032] 与现有技术相比，本发明具有如下优点：大大简化了工艺流程，降低了生产成本， 提高了产品的质量和产量，其中生物活性肽BAPs含量高达100g/L左右，回收率在70%以 上，能适应规模化生产，原料来源充足，易于形成产业化。
【具体实施方式】
[0033] 下面结合具体实施例进一步详细说明本发明，以下原料如无特殊说明，均为市售 产品。
[0034] 实施例1 本实施例提供的猪血中生物活性肽BAPs的提取方法，包括以下步骤： (1) 检疫合格的新鲜猪血50L，加入柠檬酸钠180g，混合均匀抗凝，离心力2400 X g离心 6min，分离血浆和红细胞等不溶物，分别收集； (2) 向步骤（1)处理所得红细胞等不溶物中加入纯水2L，搅拌均匀，置-23°C冷冻20h， 解冻后用超声波机，功率1200W超声处理lOmin，彻底破碎红细胞，使血红蛋白溶出，离心力 3900 Xg离心12min，除去红细胞膜碎片等不溶物，收集血红蛋白溶液； (3) 将步骤（1)处理所得血浆与步骤（2)处理所得血红蛋白溶液合并，加入N2H4CO至终 浓度3. 5mol/L，95°C处理4. 5小时，冷却至室温； (4) 向步骤（3)处理所得产物中加入C3H7NO2S至终浓度0. 24mmol/L，98°C处理38min， 冷却至室温，用透析法除去反应后产物中残留的N2H4CO和C 3H7NO2S ; (5) 向步骤（4)处理所得产物中加入KOH至终浓度0. 72mol/L，在106°C压力蒸汽中处 理25min,冷却至室温； (6) 对步骤（5)处理所得产物用C2HCl3O2调pH至3. 4,静置，收集上清液； (7) 对步骤（6)处理所得上清液用KOH调pH至7. 1，得无异味的微黄色BAPs提取物， 经测定，蛋白水解率为23. 6%，BAPs提取物含量为102. 7g/L，BAPs提取物回收率为72. 7% ; (8) 对步骤（7)处理所得BAPs提取物，在121°C蒸汽中高压20min灭菌，制得猪血液相 剂型BAP ; (9) 对步骤（8)处理所得猪血液相剂型BAPs喷雾干燥，制得猪血固相剂型BAPs。
[0035] 蛋白水解率和BAPs提取物回收率的计算方法如下（以下实施例同）： 用双缩脲法测定步骤（3)血浆与血红蛋白溶液合并原料中蛋白总含量（TPr帛44)，TPr β X 16%(蛋白质中平均氮含量为16%)= ΤΝ_ (原料中蛋白氮总含量)，用甲醛滴定法测定步 骤（3)血浆与血红蛋白溶液合并原料中氨基氮总含量（TAN 用双缩脲法测定步骤（7)处 理所得产物中BAPs提取物总含量（TBAPs)，用甲醛滴定法测定步骤（7)处理所得产物BAPs 提取物中氨基氮总含量（TANpfe); 蛋白水解率（％)= (TAN产物一TAN原料）/ (TN原料一TAN原料）X 100 BAPs提取物回收率（％) = TBAPs/ TPr原料X 100 ; 实施例2 本实施例提供的牛血中BAPs提取物的提取方法，包括以下步骤： (1) 检疫合格的新鲜牛血10L，加入柠檬酸钾37g，混合均匀抗凝，离心力2300 X g离心 7min，分离血浆和红细胞等不溶物，分别收集； (2) 向步骤（1)处理所得红细胞等不溶物加入纯水400mL，搅拌均匀，置-20°C冷冻12h， 解冻后用均质机在压力60Mpa下均质处理8min，彻底破碎红细胞，使血红蛋白溶出，离心力 3800 Xg离心15min，除去红细胞膜碎片等不溶物，收集血红蛋白溶液； (3) 将步骤（1)处理所得血浆与步骤（2)处理所得血红蛋白溶液合并，加入CH6ClN3至 终浓度4. Omol/L，72°C处理4. 0小时，冷却至室温； (4) 向步骤（3)处理所得产物中加入C4HltlO2S2至终浓度0. 37mmol/L，92°C处理27min， 冷却至室温，用透析法除去反应后产物中残留的CH6ClN 3和C4HltlO2S2 ; (5) 向步骤（4)处理所得产物中加入NaOH至终浓度0. 48mol/L，在124°C高压蒸汽中处 理15min,冷却至室温； (6) 对步骤（5)处理所得产物用HClO4调pH至4. 0,静置，收集上清液； (7) 对步骤（6)处理所得上清液用KOH调pH至6. 9,得无异味的微黄色生物活性肽 BAPs，经测定，蛋白水解率为21. 8%，生物活性肽BAPs含量为101. 2g/L，生物活性肽BAPs回 收率为70. 9% ; (8) 对步骤（7)处理所得生物活性肽BAPs，在121°C蒸汽中高压20min灭菌，制得牛血 液相剂型生物活性肽BAPs ; (9) 对步骤（8)处理所得牛血液相剂型生物活性肽BAPs喷雾干燥，制得牛血固相剂型 生物活性肽BAPs。
[0036] 实施例3 本实施例提供的鹅血中BAPs提取物的提取方法，包括以下步骤： (1) 检疫合格的新鲜鹅血5L，加入草酸钠50g，混合均匀抗凝，离心力2100Xg离心 8min，分离血浆和红细胞等不溶物，分别收集； (2) 向步骤（1)处理所得红细胞等不溶物中加入纯水200mL，搅拌均匀，置-18°C冷冻 8h，解冻后用均质机在压力60Mpa下均质处理7min，彻底破碎红细胞，使血红蛋白溶出，离 心力3500 Xg离心18min，除去红细胞膜碎片等不溶物，收集血红蛋白溶液； (3) 将步骤（1)处理所得血浆与步骤（2)处理所得血红蛋白溶液合并，加入C12H25SO 4Na 至终浓度〇. 6mol/L，85°C处理3. 6小时，冷却至室温； (4) 向步骤（3)处理所得产物中加入C4H4S2O4Na 2至终浓度0. 45mmol/L，84°C处理30min， 冷却至室温，用透析法除去反应后产物中残留的C12H 25SO4Na和C4H4S20 4Na2。
[0037] (5)向步骤（4)处理所得产物中加入Ca(OH)2至终浓度0· 32mol/L，在115°C压力 蒸汽中处理20min，冷却至室温； (6) 对步骤（5)处理所得产物用HCl调pH至3. 8,静置，收集上清液； (7) 对步骤（6)处理所得上清液用NaOH调pH至7. 0,得无异味的微黄色生物活性肽 BAPs，经测定，蛋白水解率为22. 5%，生物活性肽BAPs含量为99. 6g/L，生物活性肽BAPs回 收率为70. 1% ; (8) 对步骤（7)处理所得生物活性肽BAPs，在121°C蒸汽中高压20min灭菌，制得鹅血 液相剂型生物活性肽BAPs ; (9) 对步骤（8)处理所得鹅血液相剂型生物活性肽BAPs喷雾干燥，制得鹅血固相剂型 生物活性肽BAPs。
[0038] 应用实施例1制得的猪血固相剂型BAPs对痤疮丙酸杆菌的抑菌效果观察 改良的GAM琼脂培养基，115°C蒸汽中高压15min灭菌，加入5%羊血，倾倒在平板培养 皿内，以此用作冻干菌株的复苏平板。利用平板划线法将痤疮丙酸杆菌冻干菌株（ATCC 11827)接种至复苏平板内，37°C厌氧培养72h后，挑取单个生长的菌落用生理盐水稀释成 〇· 5个麦氏单位（约为I. 5X 108cfu/mL)浓度的菌悬液。
[0039] 通过无菌操作，取实施例1制得的猪血固相剂型BAPs用灭菌蒸馏水溶解，调整含 量为10mg/mL。取无菌试管8支，依次编为1?8号。在第1，3?8管中各加灭菌蒸馏水 3mL，在第2、3管中各加上述BAPs溶液3mL，第3?7管依次作倍比稀释，即第3管溶液混匀 后，吸取3mL加入第4管,第4管溶液混匀后，吸取3mL加入第5管,如此一直到第7管,第 7管溶液混匀后吸取3mL弃掉。将改良GAM琼脂培养基加热熔化，吸取12mL加入上述各试 管，混匀后倾注于与试管编号对应的1?8号平板中。使第2?7号琼脂平板BAPs的倍比 稀释度分别为 1:5,1:10,1:20,1:40,1:80,1:160,BAPs 浓度分别为 2. 00, L 00,0· 50,0· 25， 0. 13,0. 06mg/mL ;另取罗红霉素用灭菌蒸馈水溶解至浓度为2. 5mg/mL，按上述方法制备 参照组平板，得第2?7号参照琼脂平板罗红霉素浓度分别为500, 250,125,62. 5, 31. 3， 15. 6M"g/mL〇
[0040] 1号平板为阴性对照(未点种痤疮丙酸杆菌)，8号平板为阳性对照(不含BAPs或罗 红霉素)。将制备好的菌悬液2PL点种于2?8号平板的表面，置厌氧环境中37°C培养48h 后，将平板置于暗色、无反光物体表面，观察能够完全抑制痤疮丙酸杆菌生长的最低药液浓 度，作为对痤疮丙酸杆菌的最低抑菌浓度（MIC)。结果见表1和表2。
[0041] 表I BAPs对痤疮丙酸杆菌的抑菌作用
【权利要求】
1. 一种畜禽血中生物活性肽BAPs的提取方法，其特征包括以下步骤： (1) 采取新鲜畜禽血，加入抗凝剂，混匀抗凝，离心，分离血浆和含红细胞的不溶物，分 别收集； (2) 向步骤（1)所得的含红细胞的不溶物中加入纯水，搅匀后进行冷冻处理，解冻后再 进行均质处理或超声波处理，彻底破碎红细胞，使血红蛋白溶出，离心，除去含红细胞膜碎 片的不溶物，收集血红蛋白溶液； (3) 将步骤（1)所得血浆和步骤（2)所得血红蛋白溶液合并，加入第一种蛋白变性剂至 终浓度为〇. 5?5. O mol/L，70?KKTC处理3?5小时，冷却至室温； (4) 向步骤（3)所得反应产物中加入二硫键还原剂至终浓度为0. 2?0. 5mmol/L，80? 100°C处理20?40min，冷却至室温，用透析法除去反应后产物中残留的试剂； (5) 向步骤（4)所得反应产物中加入第二种蛋白变性剂至终浓度为0. 3?0. 8mol/L， 105?125°C蒸汽压力中处理10?30min，冷却至室温； (6) 用酸试剂调节步骤（5)所得反应产物的pH为3. 0?4. 2,静置，收集上清液； (7) 用碱试剂调节步骤（6)所得上清液的pH为6. 8?7. 2,获得无异味的微黄色生物 活性肽BAPs ; (8) 将步骤（7)所得生物活性肽BAPs灭菌，制得畜禽血液相剂型生物活性肽BAPs ; (9) 将步骤（8)所得畜禽血液相剂型生物活性肽BAPs进行干燥处理，制得畜禽血固相 剂型生物活性肽BAPs。
2. 根据权利要求1所述的畜禽血中生物活性肽BAPs的提取方法，其特征是：步骤（1) 中所述的畜禽血为猪血、牛血或鹅血；所述的抗凝剂为柠檬酸钠、柠檬酸钾或草酸钾，添加 量为0· 35?I. 20kg/每100L新鲜畜禽血，离心时的离心力为200(T2500Xg，离心时间为 5~10min〇
3. 根据权利要求1所述的畜禽血中生物活性肽BAPs的提取方法，其特征是：步骤（2) 中纯水的加入量为含红细胞的不溶物总体积的5~15%，冷冻处理的温度为-15°C?_25°C， 冷冻处理时间为6?24h ;均质处理的压力为40?80Mpa，处理时间为5?IOmin ;超声波 处理的功率为800?1500W，处理时间为5?IOmin ;离心时的离心力为3000?4000Xg， 离心时间为10?20min。
4. 根据权利要求1所述的畜禽血中生物活性肽BAPs的提取方法，其特征是：步骤（3) 中所述的第一种蛋白变性剂为N2H 4COX12H25SO4Na或CH6ClN 3 ;步骤（4)中所述的二硫键还原 剂为 C3H7NO2S、C4HltlO 2S2 或 C4H4S2O4Na215
5. 根据权利要求1所述的畜禽血中生物活性肽BAPs的提取方法，其特征是：步骤（5) 中所述的第二种蛋白变性剂为KOH、NaOH或Ca (OH) 2，步骤（6冲所述的酸试剂为HCl、H2S04、 HClO4或Cl3C2O2H，步骤（7)中所述的碱试剂为NaOH、KOH或Ca(0H) 2。
6. 根据权利要求1所述的畜禽血中生物活性肽BAPs的提取方法，其特征是：经步骤 (3)?（7)处理后，畜禽血的蛋白水解率控制在2(Γ24%。
7. 根据权利要求1所述的畜禽血中生物活性肽BAPs的提取方法，其特征是：步骤（8) 中灭菌处理采用在12(Tl25°C蒸汽中高压15~25min，制得畜禽血液相剂型BAPs。
8. 根据权利要求7所述的畜禽血中生物活性肽BAPs的提取方法，其特征是：将畜禽血 液相剂型BAPs经干燥处理，制得畜禽血固相剂型BAPs。
9. 权利要求1-8任一项所述的畜禽血中生物活性肽BAPs的提取方法制备获得的生物 活性肽BAPs。
10. 权利要求9所述的生物活性肽BAPs在美容医学领域中制备具有治疗痤疮功效的药 物中的用途。
【文档编号】C07K1/34GK104211755SQ201410411874
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年8月21日 优先权日:2014年8月21日
【发明者】肖应庆 申请人:广州天赐福音生物科技有限公司