源于人工合成基因的重组蛋白rLj-RGD4在抗肿瘤药物中的应用的制作方法
【专利摘要】“源于人工合成基因的重组蛋白rLj-RGD4在血管新生抑制剂类抗肿瘤药物中的应用”属于生物【技术领域】，涉及到人工合成基因lj-rgd4的基因克隆、蛋白表达，以及其重组蛋白rLj-RGD4剂量依赖性强效抑制血管新生和抑制肿瘤的功能及其作为血管新生抑制剂在抗肿瘤药物中的应用。
【专利说明】源于人工合成基因的重组蛋白rLj-RGD4在抗肿瘤药物中的应用
【技术领域】
[0001]“源于人工合成基因的重组蛋白rLj-RGD4在抗肿瘤药物中的应用”属于生物【技术领域】，涉及到重组RGD模体蛋白Lj-RGD4的基因克隆、蛋白表达，以及rLj-RGD4通过抑制新生血管内皮细胞表面高表达的整合素的信号转导途径而强效抑制血管新生功能及其作为血管新生抑制剂在抗肿瘤制药中的应用。
【背景技术】
[0002]血管形成是肿瘤生长和转移的基础。当血管体积达到f 2 mm3时，肿瘤呈现出血管生成表型，并从周围基质补充血管。原发实体瘤的生长和发展高度依赖于血管的生成作用。在临床前期模型中，以肿瘤血管系统为靶向的抗血管新生药物都已显示出了阻碍或推迟肿瘤生长，甚至促进肿瘤退化或休眠作用。血管新生抑制疗法可使肿瘤细胞凋亡速度加快、坏死及退化到最初的休眠状态，进而抑制肿瘤细胞转移而达到治疗癌症的目的。目前许多血管生成抑制剂正在进行I?III期临床研究，例如血管抑素、内皮抑素、烟曲霉素类似物及金属蛋白酶抑制因子和尿激酶、白介素一 12、血小板因子、Bufotanine等。
[0003]RGD(Arg-Gly-Asp)毒素蛋白是含R⑶模体的吸血动物分泌的毒素蛋白。由于RGD序列能与新生血管内皮细胞和肿瘤细胞表面高表达的某些整合素特异性结合，进而阻止其与细胞外基质的结合，封闭整合素介导的信号转导通路，因此具有抑制血管新生和抑制肿瘤细胞的增殖、粘附、浸润和转移，并引起血管内皮细胞和肿瘤细胞的凋亡而达到抗肿瘤的功效。
[0004]迄今为止，R⑶毒素蛋白发现于五个物种。除本实验室发现于七鳃鳗的R⑶毒素肽外，只在另外四种不同物种的毒腺或唾液腺中发现了的RGD模体毒素家族，这四大家族分别是毒蛇以及吸血动物水蛭、蜱类、七鳃鳗、牛虻(1_4)。来源于蛇毒的R⑶模体毒素也叫去整合素，是被研究得最为透彻也是最大的一族，种类可依蛇种来源不同达数十种；来源于水蛭唾液腺的RGD模体毒素目前为止只发现decorsin及ornatin两类；来源于蝶类的含RGD模体毒素称为variabilin ;来源于牛蛇的含RGD模体毒素称为Tablysin_15。
[0005]本实验室在七鳃鳗口腔腺EST文库中发现了三种能翻译出RGD模体的cDNA序列，并对其进行了基因克隆与表达，分别获得了具有一个RGD模体的基因重组蛋白rL j-RGDl、二个RGD模体的rLj-RGD2、三个RGD模体的rLj-RGD3。前期研究结果表明，rLj-RGD3具有潜在药用价值。为了获得分子量更小的有功效的RGD毒素蛋白，我们以rLj-RGD3基因为原型设计改造并人工合成了一个174bp的基因序列并对其进行了基因克隆，其重组蛋白具有4个RGD模体，由58个氨基酸残基组成，被命名为rLj-RGD4。rLj-RGD4是全新人工合成基因重组蛋白，目前在国内外尚无研究与报道，本发明属首次发现。rLj-RGD4有望应用于血管新生抑制剂类抗肿瘤药物制备领域。
[0006]参考文献:
1.Chunsik Lee， Molecular Mechanisms of act1n of Histidine-richglycoprotein in ang1genesis inhibit1n, Digital comprehensive summaries ofuppsala dissertat1ns from the faculty of medicine 192， ACTA UniversitatisUpsaliensis Uppsala (2006).2.Blank M.， Shoenfeld Y.，Histidine-rich glycoprotein modulat1n ofimmune/auto immune, vascular, and coagulat1n systems, Clin Rev Allergy Immunol34 (2008) 307-312.3.Vanwildemeersch M.， Olsson A.K.， Gottfridsson E.， Claesson-WelshL，Lindahl U.，Spillmann D.，The ant1-ang1genic His/Pro-rich fragment ofhistidine-rich glycoprotein binds to endothelial cell heparan sulfate in aZn2+_dependent manner, J B1l Chem 281 (2006) 10298-10304.4.Dongying Malj Xueqing Xu2， Su Anl et aL A novel family of RGD-containingdisintegrins (Tablysin-15) from the salivary gland of the horsefly Tabanus yaotargets a IIbβ 3 or a V β 3 and inhibits platelet aggregat1n and ang1genesis.Thrombosis and Haemostasis 105 (2011) 1032-45。
【发明内容】
[0007]本发明人工设计并合成了 lj-rgd4基因，将基因克隆于pET-23b载体，对其重组蛋白iiJ-RGD4在大肠杆菌中进行了高效诱导表达。rLj-RGD4生物学活性涉及到通过与血管内皮细胞高表达整合素结合而行使抗血管新生功能、抗肿瘤功能。
[0008]本发明涉及日本七鳃鳗口腔腺重组蛋白Lj-RGD4的基因克隆、在大肠杆菌中的表达，以及其抑制血管新生、抗肿瘤的功效。
[0009]基因序列(开放阅读框)174bp长，其蛋白质由58个氨基酸组成，理论分子量为6.2 kDa，其cDNA序列及由其推导的蛋白质氨基酸序列详见说明书中核苷酸/氨基酸序列表。
[0010]LJ-RGD4抑制血管新生及肿瘤的生物学活性如下:
通过MTT法检测rLj-RGD4对bFGF诱导的人脐静脉内皮细胞HUVEC增殖呈剂量依赖性抑制，rLj-RGD4抑制HUVEC细胞增殖的IC50为19.95 μ mol/L。
[0011]体内血管生成实验采用鸡绒毛尿囊膜(CAM)模型进行。用bFGF ( 200 ng/embryo)诱导血管新生24 h后，用不同剂量的rLj-RGD4或等量的PBS作用于鸡胚。结果表明，bFGF诱导后用PBS处理过的CAM的主枝血管清晰而发达，毛细血管网逐渐形成；而rLj-RGD4处理过的CAM，随着剂量的加大，CAM主枝血管发生明显衰退现象，数量明显减少，毛细血管几乎已不复存在。且rLj-RGD4对bFGF诱导的CAM血管新生呈剂量依赖性抑制。
[0012]以喉癌Hep-2细胞荷瘤裸鼠为动物模型的体内肿瘤抑制实验结果表明，与模型组比较，低、中、高(12.5 μ g.kg'25.0 μ g.kg'50.0 μ g.kg—1)剂量 rLj-RGD4 对瘤重抑制率分别为22.6 %、35.1 %、65.4 %，说明rLj-RGD4呈剂量依赖方式抑制肿瘤生长。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1:rLj-RGD4对bFGF诱导的HUVEC细胞增殖的抑制作用。
[0014]图2:rLj-RGD4纯化蛋白对bFGF诱导的六日龄鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管新生的抑制作用(OLYMPUS数码相机拍摄)(A) PBS作用于六日龄鸡胚24小时；(B) 200 ng的bFGF作用于六日龄鸡胚24小时;(C)- (D):200ng的bFGF诱导24小时后，rLj-RGD4作用于 CAM 的血管新生情况。(C)20 μ g; (D) 40 μ g ; (E) 60 μ g0
[0015]图3:rLj-RGD4对!fep-2人喉癌移植瘤瘤重的影响:连续给药3周后，rLj-RGD4呈剂量依赖性减小肿瘤瘤重，给药组(剂量由低到高)肿瘤瘤重分别是0.80±0.17 g、0.67±0.14、0.36±0.16，与模型组相比，抑制率分别为 22.6 %, 35.1 %, 65.4% (ρ〈0.01)。注:η=8;与模型组比较*Ρ〈0.05，林Ρ〈0.01。
【具体实施方式】
[0016]\Jj-rgd4基因与pET23b载体相连接，转化入大肠杆菌后进行阳性转化子的筛选鉴定。
[0017]为产生带有组氨酸标签的融合蛋白，选择pET_23b做为基因克隆的载体，克隆具体操作如下:
Cl)目的基因的回收与测序:目的基因的回收采用TaKaRa PCR Fragment RecoveryKit进行；对回收DNA进行测序，此项工作由大连宝生物工程有限公司完成。
[0018](2)质粒的提取:采用宝生物的质粒提取试剂盒进行。
[0019](3)目的基因DNA片段与载体pET23b的连接:由于所设计的引物分别带有I和"i/?d III酶切位点，而这两个酶切位点也是pET23b的多克隆位点，这使得将目的基因DNA片段与载体pET23b的连接成为可能。
[0020](4)将连接产物CaCl2法转化至克隆菌E.coli BL21中。
[0021](5)阳性转化子的筛选鉴定:利用T7通用引物法和双酶切法进行阳性转化子的筛选鉴定。
[0022]2、对阳性重组子进行终浓度为lmmol/L的IPTG诱导表达。诱导表达条件为30°C过夜诱导。
[0023]3、对表达的重组蛋白进行组氨酸亲和层析纯化。
[0024](I) 10000 g离心10 min收获菌体，弃上清，并使残液尽量流出。以每100 ml的原培养液加4 ml冰冷的I X Binding buffer的比例重悬细胞。
[0025](2)将上述样品置于冰上超声裂解细胞，直至溶液不再粘稠。
[0026](3) 14000 g离心20 min以去除细胞碎片。
[0027](4)上清以0.45 μ m的滤膜过滤。
[0028](5)吸去His.Bind Column上室的忙液，并打开下面管口。
[0029](6)用 10 ml 的 Ix Binding Buffer 对柱子进行平衡。
[0030](7)将过滤好的上清液上样。
[0031](8)用 10 ml 的 Ix Binding Buffer 洗柱。
[0032](9)用 10 ml 的 Ix Wash Buffer 洗柱。
[0033](10)用 5 ml 的 Ix Elute Buffer 洗脱目的蛋白。
[0034]4、MTT法测定rLj_RGD4对人脐静脉内皮细胞HUVEC增殖的抑制作用。
[0035]具体方法如下:
(I)将HUVEC细胞接种于96孔板中，在bFGF终浓度为3ng/ml的1640培养液中培养
24h ；
(2)分别加入梯度浓度的蛋白到培养液中，并用PBS补齐，继续培养24h；
(3)加入培养液10%的浓度为0.5mg/ml的MTT溶液继续培养4h ；
(4)吸去培养液，加入与培养液相同量的DMSO；
(5)振荡lOmin，使结晶充分溶解；
(6)在酶标仪上测定光吸收值，测定波长为490nm；
(7)计算细胞杀伤率:
杀伤率=(对照孔的均值-试验孔均值)/对照孔均值X 100%, 3次实验取平均值。
[0036]5、利用鸡绒毛尿囊膜CAM系统进行抗血管新生功能测定。
[0037]具体实验步骤如下:
(O取六日龄鸡胚，用0.1%的新洁尔灭消毒；
(2)在绒毛尿囊膜体表投影距胚头Icm处开窗定位，并锯出I cm2的小窗；
(3)无菌玻璃纤维滤纸用40μ1的bFGF(200ng/disk)或等量PBS饱合，置于CAM上，透明胶带覆盖；
(4)于37°C60%湿度的隔水式恒温孵箱内孵育24 h后，加不同剂量的rLj-RGD4或等体积的PBS于覆在CAM上的滤纸上，透明胶带覆盖；
(5)继续孵育24h后用数码相机观察拍照。
[0038]6、人喉癌!fep-2细胞荷瘤裸鼠模型的建立及rLj_RGD4对人喉癌!fep-2细胞移植瘤生长影响的测定
(O动物模型建立:当所培养的处于对数生长期的ifep-2人喉癌细胞数量达到要求后，消化细胞制备成细胞悬液，用ImL注射器接种到裸鼠右侧腋下，每只裸鼠0.2mL,复制模型。
[0039](2) rLj-RGD4对人喉癌H印_2细胞移植瘤生长的影响:取裸鼠40只，将浓度为5X 15个/mL的处于对数生长期的人喉癌Hep-2细胞悬液接种于裸鼠右侧腋下，每只裸鼠接种0.2 mL。当肿瘤的直径达到5?7 _，将荷瘤裸鼠随机分为5组(每组8只):模型(生理盐水)组，阳性对照药顺钼(3mg.kg—1)组，rLj-RGD4低剂量(12.5 μ g.kg—1)组，rLj-RGD4中剂量(25.0 1^.1^_1)组，1'1^-1?04高剂量(50.0 yg.kg—1)组。各组裸鼠腹腔注射不同受试药物，每日2次，给药容量0.2 mL/10g，连续给药3周。给药3周后将裸鼠脱颈处死，剥离肿瘤组织，测瘤体积及瘤重。利用公式计算肿瘤瘤重抑制率。
抑瘤率=(模型组平均瘤重一给药组平均瘤重).模型组平均瘤重―1.100%。
【权利要求】
1.一种人工合成基因Λ/Τ##的CDNA序列及由其推导的蛋白质Lj-RGD4氨基酸序列，
人工合成基因174bp长，其蛋白质由58个氨基酸组成，其cDNA序列及由其推导的蛋白质氨基酸序列为: atg gcc att tgt cat aag cag aat tat ccc atg ggt acg gag aca cag48
Met Ala lie Cys His Lys Gln Asn Tyr Pro Met Gly Thr Glu Thr Gln
151015 gga gac aca cgt gga gac aca egg gga gac aca cgt gga gac aca egg96
Gly Asp Thr Arg Gly Asp Thr Arg Gly Asp Thr Arg Gly Asp Thr Arg
202530 ggg gcc cgc gga gac gca egg aga cac gga cac aac aaa cat tta cac 144 Gly Ala Arg Gly Asp Ala Arg Arg His Gly His Asn Lys His Leu His 354045 aga atg agt gca gcg gtg agt gaa tgt gtt174
Arg Met Ser Ala Ala Val Ser Glu Cys Val
5055。
2.根据权利要求1所述的序列连接任何类型载体的基因克隆产品所表达的重组蛋白rLj-RGD4在抗血管新生类抗肿瘤药物方面的应用，其特征为rLj-RGD4重组蛋白是含有四个RGD模体的蛋白，其具有RGD模体的抗血管新生及抗肿瘤功能，有望应用于血管新生抑制剂类抗肿瘤药物制备领域。
【文档编号】C07K14/46GK104232652SQ201410413382
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年8月21日 优先权日:2014年8月21日
【发明者】李庆伟, 王继红, 吕莉, 郑媛媛, 张安伟, 管萧玉, 杨兰, 邵钫钰, 白娟 申请人:辽宁师范大学