一种长春碱的提取及纯化方法
【专利摘要】本发明公开了一种长春碱的提取及纯化方法，包括：将长春花进行盐津、冷冻干燥预处理；预处理的原料酸性提取，然后萃取加硫酸得硫酸长春碱粗品；将硫酸长春碱粗品碱化萃取、水洗、上硅胶柱分离、结晶，得长春碱纯品。本发明步骤简洁、耗用时间少，先对长春花进行预处理再进行提取，即可以除掉长春花部分溶于水的色素杂质，又使长春花细胞壁破碎，更利于产品的溶出。通过对提取步骤和条件的选择，提高了粗品的得率和含量，通过对各提取试剂、萃取试剂、洗脱试剂和结晶试剂的选择，提高了长春碱的收率和纯度，通过一次结晶即可得到长春碱纯品，简化了纯化过程，更为快速的实现了长春碱的分离和纯化，且最终得到的产品纯度高，更为满足临床需求。
【专利说明】一种长春碱的提取及纯化方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种从长春花中提取并分离纯化长春碱的方法，属于药物提取技术领 域。
【背景技术】
[0002] 长春花是夹竹桃科长春花属一种重要的药用植物，原产南亚、非洲东部及美洲热 带。长春花全草入药可止痛、消炎、安眠、通便及利尿，全株具有毒性，误食后会造成白血球 减少、血小板减少、肌肉无力、四肢麻痹等症状。长春花中含有几十种吲哚类生物碱，长春碱 是其中的一种，具有抗癌的作用，为临床上广泛应用的抗肿瘤药物，具有很高的药用价值， 国内外对其提取分离的研究由来已久。但是由于长春花中含有几十种生物碱，长春碱含量 很低，仅为万分之几，提取并初步成盐后的硫酸长春碱粗品含量仅60%左右，无法满足使用 要求，需要对其进一步纯化。
[0003] 目前报道的长春碱的提取方法有溶剂提取法、超临界萃取法、超声波提取法等，分 离方法有TLC法、柱色谱法、高效逆流色谱法等。这些方法各有自己的优势和缺点，如果能 对这些方法进行改进和结合，提高长春碱的提取率和纯度，将会更有利于其工业化应用。
【发明内容】
[0004] 本发明提供了一种长春碱的提取及纯化方法，该方法对长春碱的提取和分离纯化 方法都进行了改进，所得长春碱提取率高、纯度高。
[0005] 本发明具体技术方案如下： 一种长春碱的提取及纯化方法，包括以下步骤： (1)取长春花，用15-25wt%的氯化钠水溶液超声浸泡15min，然后取出直接放入流速为 5-8m/s的-20°C的冷空气中冷冻干燥20min，冷冻干燥后将长春花粉碎。
[0006] (2)将步骤（1)的长春花加入30体积％乙醇中，用柠檬酸调节pH为1.5,回流提 取，过滤取滤液，将滤液用氢氧化钠调整pH为8-9,然后以喷雾的形式从萃取罐顶部喷入， 同时将萃取剂以喷雾的形式从萃取罐的底部喷入，喷入完毕萃取收集有机相；所述萃取剂 为体积比为10:1-2. 5的三氯乙烯和己烷的混合物； (3) 有机相减压除去溶剂，固体用乙醇完全溶解，加浓度5wt%的硫酸的乙醇溶液调节 pH为3. 8,离心、干燥得硫酸长春碱粗品； (4) 将硫酸长春碱粗品用水溶解，加饱和碳酸氢钠溶液调节pH为8-9,加入二氯甲烷 萃取，二氯甲烷有机相用水洗涤直至洗涤后的水相透明无色，收集水洗后的有机相，减压蒸 馏除去二氯甲烷，所得剩余物上硅胶柱，用体积比为90 :10?98 :2的二氯甲烷与甲醇氨 饱和溶液的混合物作为流动相进行洗脱，收集无色流份，将流份减压蒸馏至干，所得固体加 入体积比为9 :0.3-0.8 :1-3的甲醇、石油醚和乙酸乙酯的混合液中，常温超声5min，然后 在-HTC低温静置24h，所得晶体在-KTC低温抽滤，-KTC冻干，得长春碱纯品。
[0007] 上述步骤（1)中，长春花与氯化钠水溶液的质量比为I:9-10。
[0008] 上述步骤（I)中，氯化钠溶液的浓度优选为20wt%。
[0009] 上述步骤（2)中，长春花与30体积％乙醇的质量比为1:4-6,回流提取的时间为 2_3h。
[0010] 上述步骤（2)中，滤液与萃取剂的体积比为3. 5:1?6:1，优选4. 7:1。
[0011] 上述步骤（2)中，滤液喷入萃取罐的速度为188-240ml/s，滤液和萃取剂同一时间 喷完。
[0012] 上述步骤（2)中，三氯乙烯和己烷的体积比优选为10:1. 75。
[0013] 上述步骤（3)中，固体与乙醇的质量比优选为1:0. 8。
[0014] 上述步骤（4)中，对二氯甲烷有机相进行水洗时，水洗用水与二氯甲烷有机相的质 量比为1:1-2。
[0015] 上述步骤（4)中，所述甲醇氨饱和溶液是向甲醇中通入氨气直至有氨气溢出所形 成的氨气饱和的甲醇溶液。
[0016] 上述步骤（4)中，硅胶的目数为200-300目，剩余物与硅胶的质量比为1:10-20,优 选1:15,洗脱温度为16-25°c，流动相流速为3-5ml/min。
[0017] 上述步骤（4)中，流份减压蒸馏所得的固体质量与甲醇、石油醚、乙酸乙酯总体积 的比值为Ig:3. 5_8ml，优选Ig:5ml。
[0018] 上述步骤（4)中，二氯甲烷与甲醇氨饱和溶液的体积比优选为97 :3。
[0019] 上述步骤（4)中，甲醇、石油醚和乙酸乙酯的体积比优选为9:0. 5:1. 7。
[0020] 本发明以长春花为起始原料，先通过提取并初步成盐后得到硫酸长春碱粗品，再 通过纯化得到纯度高的长春碱产品。本发明方法中，在起始阶段，先通过盐浸-冷冻干燥对 长春花进行预处理，不仅可以除掉长春花部分溶于水的色素杂质，而且可以使长春花细胞 壁破碎，更利于下步产品的溶出。然后在酸性条件下乙醇提取、碱性条件下萃取，萃取剂和 乙醇提取液以喷雾的形式接触，大大提高了萃取效率，并且通过对萃取剂的调配，提高了 长春碱的含量及得率。采用本发明提取方法所得粗品中长春碱的含量可达80%以上。所得 粗品采用碱化萃取、水洗+硅胶柱分离+结晶的方式进行纯化。碱化萃取水洗后，可以除掉 粗品中水溶性的多糖及色素等组分，更有利于产品下步的纯化。柱分离阶段采用二氯甲烷 与甲醇氨饱和溶液的混合物作为流动相，流动性的选择使分离效果更明显，有效成分得到 很好的纯化，收率也得到提高。最后将产品放入甲醇、石油醚和乙酸乙酯的混合液中进行结 晶，结晶前先进行超声处理，以使晶粒形貌更为均匀，一次结晶后所得长春碱产品纯度和收 率均较高，无需多次重复结晶，大大减少了产品的损失。
[0021] 本发明步骤简洁、耗用时间少，先对长春花进行预处理再进行提取，不仅可以除掉 长春花部分溶于水的色素杂质，而且可以使长春花细胞壁破碎，更利于下步产品的溶出。通 过对提取步骤和条件的选择，提高了硫酸长春碱粗品的得率和含量，通过对各提取试剂、萃 取试剂、洗脱试剂和结晶试剂的选择，提高了长春碱的收率和纯度，通过一次结晶即可得到 长春碱纯品，简化了纯化过程，更为快速的实现了长春碱的分离和纯化，且最终得到的产品 纯度高，更为满足临床需求。
【专利附图】
【附图说明】
[0022] 图1为所得产品的高效液相色谱图。
[0023] 图2为本发明提取所得长春碱的核磁谱图。
【具体实施方式】
[0024] 下面通过具体实施例对本发明进行进一步的阐述，应该明白的是，下述说明仅是 为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
[0025] 本发明中，长春碱的含量测定方法为：高效液相色谱法，高效液相色谱的条件如 下： 色谱柱：PhenomenexPRODIGY0DS3-C18 柱（250.OmmX4. 6mm, 5μm); 流动相：体积比68:6. 4:25. 6的磷酸缓冲盐一甲醇一乙腈为流动相；磷酸缓冲盐配制 方法是：取6. 8g磷酸二氢钾与IOml的三乙胺，混合后加水补至1000ml，然后用磷酸调至 ρΗ4· 2,制得。
[0026]柱温：30°C; 波长：262nm; 流速：1. 5ml/min〇
[0027] 下述实施例中，得率的计算方法为：得率=所得硫酸长春碱粗品或长春碱纯品的 质量/长春花的总质量。
[0028] 下述实施例中，乙醇的浓度均为体积浓度，其他试剂的浓度均为质量浓度。
[0029] 实施例1 以长春花(鲜）为原料，按照下述方法提取分离硫酸长春碱： 1、提取硫酸长春喊粗品： (1)取IOOkg长春花，加入900kg20%的氯化钠水溶液中，超声浸泡15min，然后将长春 花取出直接放入流速为6m/s的-20°C的冷空气中冷冻干燥20min，冷冻干燥后将长春花粉 碎。
[0030] (2)将步骤（1)处理后的长春花加入500kg30%的乙醇中，用柠檬酸调节pH为1.5， 回流提取2h，过滤取滤液，滤液用氢氧化钠调整pH为8-9,调整好pH后，将滤液加高压，以 喷雾的形式从萃取罐顶部喷入，速度为200ml/s，同时将萃取剂也加高压，以喷雾的形式从 萃取罐的底部喷入，滤液与萃取剂的体积比为4. 7 :1,滤液和萃取剂同时喷入萃取罐，同时 喷完，喷入完毕萃取收集有机相；所述萃取剂为体积比为10:1. 75的三氯乙烯和己烷的混 合物。
[0031] (3)将有机相减压蒸馈，所得剩余物约200g，将剩余物加入乙醇200ml溶解，然后 加入浓度为5%的硫酸的乙醇溶液调节pH为3. 8,有浆状物沉淀出现，离心、干燥得硫酸长春 碱粗品11. 2g，经计算，硫酸长春碱的得率为0. 112%。，经HPLC检测，粗品中硫酸长春碱含量 为 84. 3%。
[0032] 2、分离纯化硫酸长春碱： 将上述11. 2g硫酸长春碱粗品用50ml水溶解，加入饱和碳酸氢钠溶液调节pH为8-9， 加入150ml二氯甲烷萃取，得有机相，所得有机相加入IOOml高纯水洗漆，直至洗涤后的 水相透明无色，取水洗后的有机相，将其减压蒸馏除去溶剂，所得产物l〇g，将该产物上 200-300目的硅胶柱，产物与硅胶的质量比为1:15,用体积比为97:3的二氯甲烷与甲醇氨 饱和溶液（甲醇氨饱和溶液是向甲醇中通入氨气直至有氨气溢出所形成的氨气饱和的甲醇 溶液)的混合溶剂作为流动相进行洗脱，洗脱温度为18-20°C，流动相流速为3-5ml/min。收 集无色流份，减压蒸馏得7.Sg固体。将所得固体加入39ml体积比为9 :0. 5 :1. 7的甲醇、石 油醚和乙酸乙酯的混合液中，常温超声5min，然后在-KTC下低温静置24h后，在-KTC下低 温抽滤，-KTC冻干得长春碱6. 3g。
[0033] 图1为所得产品的高效液相色谱图，其图谱分析结果如下表，从表中可以看出，本 发明所得长春碱纯品中，长春碱纯度为99. 8%。
【权利要求】
1. 一种长春碱的提取及纯化方法，其特征是包括以下步骤： (1) 取长春花，用15-25wt%的氯化钠水溶液超声浸泡15min，然后取出直接放入流速为 5-8m/s的-20°C的冷空气中冷冻干燥20min，冷冻干燥后将长春花粉碎； (2) 将步骤（1)的长春花加入30体积％乙醇中，用柠檬酸调节pH为1. 5,回流提取，过 滤取滤液，将滤液用氢氧化钠调整pH为8-9,然后以喷雾的形式从萃取罐顶部喷入，同时将 萃取剂以喷雾的形式从萃取罐的底部喷入，喷入完毕萃取收集有机相；所述萃取剂为体积 比为10:1-2. 5的三氯乙烯和己烷的混合物； (3) 有机相减压除去溶剂，固体用乙醇完全溶解，加浓度5wt%的硫酸的乙醇溶液调节 pH为3. 8,离心、干燥得硫酸长春碱粗品； (4) 将硫酸长春碱粗品用水溶解，加饱和碳酸氢钠溶液调节pH为8-9,加入二氯甲烷 萃取，二氯甲烷有机相用水洗涤直至洗涤后的水相透明无色，收集水洗后的有机相，减压蒸 馏除去二氯甲烷，所得剩余物上硅胶柱，用体积比为90 :10?98 :2的二氯甲烷与甲醇氨 饱和溶液的混合物作为流动相进行洗脱，收集无色流份，将流份减压蒸馏至干，所得固体加 入体积比为9 :0.3-0.8 :1-3的甲醇、石油醚和乙酸乙酯的混合液中，常温超声5min，然后 在-l〇°C低温静置24h，所得晶体在-10°C低温抽滤，-10°C冻干，得长春碱纯品。
2. 根据权利要求1所述的提取及纯化方法，其特征是：步骤（1)中，长春花与氯化钠水 溶液的质量比为1 :9_10。
3. 根据权利要求1所述的提取及纯化方法，其特征是：步骤（2)中，长春花与30体积％ 乙醇的质量比为1:4-6,回流提取的时间为2-3h。
4. 根据权利要求1所述的提取及纯化方法，其特征是：步骤（2)中，滤液与萃取剂的体 积比为3. 5:1?6:1，优选4. 7:1 ;滤液喷入萃取罐的速度为188-240ml/s，滤液和萃取剂同 一时间喷完。
5. 根据权利要求1所述的提取及纯化方法，其特征是：步骤（4)中，流份减压蒸馏所得 的固体质量与甲醇、石油醚、乙酸乙酯总体积的比值为lg :3. 5-8ml，优选lg :5ml。
6. 根据权利要求1所述的提取及纯化方法，其特征是：步骤（4)中，硅胶的目数为 200-300目，剩余物与硅胶的质量比为1:10-20,优选1:15,洗脱温度为16-25°C，流动相流 速为 3_5ml/min。
7. 根据权利要求1所述的提取及纯化方法，其特征是：步骤（4)中，对二氯甲烷有机相 进行水洗时，水洗用水与二氯甲烷有机相的质量比为1:1-2。
8. 根据权利要求1-6中任一项所述的提取及纯化方法，其特征是：步骤（1)中，氯化钠 溶液的浓度为20wt%;步骤（2)中，三氯乙烯和己烷的体积比为10:1.75 ;步骤（3)中，固体 与乙醇的质量比为1:0. 8 ;步骤（4)中，二氯甲烷与甲醇氨饱和溶液的体积比为97 :3 ;步骤 (4)中，甲醇、石油醚和乙酸乙酯的体积比为9:0. 5:1. 7。
9. 根据权利要求1-6中任一项所述的提取及纯化方法，其特征是：所述甲醇氨饱和溶 液是向甲醇中通入氨气直至有氨气溢出所形成的氨气饱和的甲醇溶液。
【文档编号】C07D519/04GK104262362SQ201410439509
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年9月1日 优先权日:2014年9月1日
【发明者】王洪磊, 张永明, 孙中亮 申请人:海南希源化工科技有限公司