一种弓形虫致密颗粒蛋白6抗体的制备方法
【专利摘要】一种弓形虫致密颗粒蛋白6抗体的制备方法，包括如下步骤：(1)选择目的片段作为表达重组蛋白的目的基因；(2)弓形虫致密颗粒蛋白6的合成；(3)弓形虫致密颗粒蛋白6的分离纯化；(4)制备兔抗弓形虫致密颗粒蛋白6多克隆抗体：用步骤(3)纯化后的重组弓形虫致密颗粒蛋白6作为抗原去免疫兔子，得到含抗重组弓形虫致密颗粒蛋白6抗体的抗血清；(5)对步骤(4)中得到的抗弓形虫致密颗粒蛋白6抗体的抗血清进行分离纯化，得到抗重组弓形虫致密颗粒蛋白6抗体干粉。该方法制备的抗体干粉可作为血清学检查的诊断原料，且本发明弓形虫致密颗粒蛋白6表达产量高。
【专利说明】一种弓形虫致密颗粒蛋白6抗体的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及免疫学领域，具体涉及一种弓形虫致密颗粒蛋白6抗体的制备方法。
【背景技术】
[0002]刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种细胞内专性寄生原虫,能够引起孕妇流产、早产、畸胎和死胎，因此检测弓形虫成为孕前和孕期所必需的项目。
[0003]目前，弓形虫的检测方法有很多种:病原学检查，如从体液和组织中镜检虫体，找到虫体可以确诊，但是该方法检出率较低，且耗时交叉；基因检查，如DNA探针技术、聚合酶链式反应等方法，这些方法具有较高的敏感性和特异性，但是操作复杂且对实验环境的要求极其严格，不适合用于日常检测；
[0004]而血清学检查，有染色试验(DT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、间接血凝试验(IHA)、免疫印迹等方法虽然具有较高的敏感性、操作较基因检查简便，但是特异性差，主要是因为缺少具备特异性的诊断原料。因此，急需要开发一种适用于血清学检查的诊断原料用以提高以上方法检测试剂盒的特异性。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是为了解决上述问题而提供一种弓形虫致密颗粒蛋白6抗体的制备方法，该方法制备的抗体干粉可作为血清学检查的诊断原料，且本发明弓形虫致密颗粒蛋白6表达产量高。
[0006]本发明通过以下技术方案实现:
[0007]—种弓形虫致密颗粒蛋白6抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤:
[0008](I)选择目的片段作为表达重组蛋白的目的基因:所选择的目的片段如序列表I所示；
[0009](2)弓形虫致密颗粒蛋白6的合成:将序列表中SEQ ID N0.1所示的目的片段通过PCR扩增，所述扩增使用引物如下，
[0010]上游引物:5’GACTAATTCGTTGGGTGGAGTCG3’
[0011]下游引物:5’GGCCTTTAGCGTTTCTGTGTTCGTTTG3'
[0012]扩增后插入质粒pET28a中，形成pET28a_GRA6质粒载体并转化大肠埃希菌BL21 (DE3)，在加入相应抗体的平板上筛选含有重组质粒的单菌落，提取重组质粒验证，在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达目的蛋白；
[0013](3)弓形虫致密颗粒蛋白6的分离纯化:采用Ni柱纯化，包括蛋白提取和蛋白纯化；
[0014](4)制备兔抗弓形虫致密颗粒蛋白6多克隆抗体:用步骤(3)纯化后的重组弓形虫致密颗粒蛋白6作为抗原去免疫兔子，得到含抗重组弓形虫致密颗粒蛋白6抗体的抗血清；
[0015](5)对步骤(4)中得到的抗弓形虫致密颗粒蛋白6抗体的抗血清进行分离纯化，得到抗重组弓形虫致密颗粒蛋白6抗体干粉。
[0016]在上述技术方案中，步骤(3)中所述蛋白提取的步骤为:收集培养的大肠埃希菌BL21 (DE3)，离心弃上清；沉淀细胞用NTA-O缓冲液溶解形成缓冲体系；向缓冲体系中加入溶菌酶，置冰上冷却处理；将缓冲体系倒入烧杯中于冰上超声处理；后用离心机离心取上清再离心一次，再过0.22 μ m的滤膜过滤。
[0017]在上述技术方案中，步骤(3)中所述蛋白纯化为:取Ni柱流干，后水洗Ni柱；用EDTA溶液洗涤Ni柱；再用水洗Ni柱；用NTA-O缓冲液洗涤Ni柱；后用NiSO4洗涤Ni柱，流干；再用NTA-O缓冲溶液洗涤Ni柱至流出液与NTA-O缓冲液pH相同；以lmL/min速度上样；用NTA-O缓冲溶液洗涤至G250不变蓝为止；后用20mM、60mM、200mM和500mM咪唑溶液洗Ni柱，直至检测G250不变蓝为止，分别收集流出液体，跑胶分析溶液中重组弓形虫致密颗粒蛋白6纯度。
[0018]在上述技术方案中，步骤(4)中免疫兔子的具体步骤为:取步骤(3)中纯化后的重组弓形虫致密颗粒蛋白6与等体积的弗氏佐剂充分乳化后在兔背部皮下注射，注射量为500ug/只，首次免疫注射后第2周进行一次加强免疫注射，以后每隔两周加强免疫注射一次，每次加强免疫注射剂量与首次免疫注射剂量相同，加强免疫时取重组弓形虫致密颗粒蛋白6与等体积的弗氏佐剂充分乳化后在兔背部皮下注射，注射量为500ug/只，静脉采血，得到含抗重组弓形虫致密颗粒蛋白6抗体的抗血清。
[0019]在上述技术方案中，步骤(5)中抗弓形虫致密颗粒蛋白6抗体的抗血清进行分离纯化的具体步骤为:(1)制备抗体亲和层析柱:将弓形虫致密颗粒蛋白6与压积CNBr-Sepharose 4B混合，依次经过交联、清洗、封闭、再次清洗、装柱、平衡，得到重组弓形虫致密颗粒蛋白6亲和层析柱；(2)亲和层析:将重组弓形虫致密颗粒蛋白6抗体溶液通过
(I)所制备的亲和层析柱，去掉非特异性吸附后进行解吸，分段收集解吸液；(3)抗体获取:将(2)收集的解吸液，透析、冷冻干燥，既得重组弓形虫致密颗粒蛋白6抗体干粉。
[0020]本发明具有以下优点:
[0021]本发明通过对弓形虫致密颗粒蛋白6 (GRA6)中可产生较强免疫原性位点的基因片段选择合适的引物(参见序列表SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.3)进行扩增，并采用该位点的氨基酸序列制备重组蛋白片段，用此片段免疫动物得到特异性针对该位点的抗体。在重组蛋白制备的中采用大肠杆菌表达系统，能很好的保证重组蛋白的表达，表达产量高，有利于大批量的制备重组蛋白和相应的抗体，适合于作为诊断原料和疫苗开发的技术。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1构建完成的pET28a_GRA6质粒载体结构示意图。
[0023]图2分离纯化后的重组弓形虫致密颗粒蛋白6电泳图。
[0024]图3Western Blot验证抗重组弓形虫致密颗粒蛋白6抗体效果图。
【具体实施方式】
[0025]下面结合附图和实施方式对本发明做进一步的详细说明。以下实施例仅是范例性的，仅用以对本发明的技术方案做更进一步的详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，在不偏离本发明技术方案的精神和范围内，对技术方案进行的修改或者替换均应涵盖在本发明的权利要求保护范围内。
[0026]1、克隆弓形虫致密颗粒蛋白6(GRA6)免疫原性片段(如序列表中SEQ ID N0.1)所示，具体采用的引物信息如下:
[0027]h游引物:5’ GACTAATTCGTTGGGTGGAGTCG 3’
[0028]下游引物:5’GGCCTTTAGCGTTTCTGTGTTCGTTTG 3’
[0029]用此引物对进行目的片段的PCR扩增，得到序列表中SEQ ID N0.1所对应的核酸片段。
[0030]2、采用常规的分子生物学方法，把扩增得到的弓形虫致密颗粒蛋白6(GRA6)免疫原性片段插入到表达载体中，该表达载体选自:pET28a、pET30a、pET32a、pGEX等，优选为pET28a(载体购自宝生物工程(大连)有限公司)。GRA6免疫原性片段插入到质粒pET28a中，构建重组质粒，图1就是构建完成的pET28a-GRA6质粒载体结构示意图，后将重组质粒载体转化大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3)中，在加入相应抗体的平板上筛选含有重组质粒的单菌落，提取重组质粒验证，得到构建正确的重组质粒；
[0031]3、在大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3)中表达目的蛋白。37°C培养转化了重组质粒的 BL21 到 OD 值 0.6，加入 IPTG 至 0.5mM, 30°C诱导 5h。
[0032]4、重组弓形虫致密颗粒蛋白6的分离纯化。收集培养的大肠杆菌，离心弃上清；沉淀细胞用NTA-O缓冲液溶解；向缓冲体系中加入溶菌酶，置冰上处理一段时间；将反应体系倒入烧杯中于冰上超声处理；后用离心机离心取上清再离心一次，后过0.22 μ m的滤膜；蛋白纯化为:取Ni柱流干，后水洗Ni柱；用EDTA溶液洗涤Ni柱；再用水洗Ni柱；用NTA-O缓冲液洗涤Ni柱；后用NiSO4洗涤Ni柱，流干；再用NTA-O缓冲溶液洗涤Ni柱至流出液与NTA-O缓冲液pH相同；以lmL/min速度上样；用NTA-O缓冲溶液洗涤至G250不变蓝为止；后用20mM、60mM、200mM和500mM咪唑溶液洗柱子，直至检测G250不变蓝为止，分别收集流出液体，跑胶分析溶液中重组弓形虫致密颗粒蛋白6纯度。图2就是分离纯化后目的蛋白表达后的电泳图。
[0033]5、重组弓形虫致密颗粒蛋白6抗血清的制备。取重组弓形虫致密颗粒蛋白6与等体积的弗氏佐剂充分乳化后在兔背部皮下注射，注射量为500ug/只，首次免疫注射后第2周进行一次加强免疫注射，以后每隔两周加强免疫注射一次，每次加强免疫注射剂量与首次免疫注射剂量相同，加强免疫时取重组弓形虫致密颗粒蛋白6与等体积的弗氏佐剂充分乳化后在兔背部皮下注射，注射量为500ug/只，静脉采血，得到含抗重组弓形虫致密颗粒蛋白6抗体的抗血清。
[0034]6、重组弓形虫致密颗粒蛋白6抗血清的分离纯化。(I)制备抗体亲和层析柱:将重组弓形虫致密颗粒蛋白6与压积CNBr-Sepharose 4B混合,依次经过交联、清洗、封闭、再次清洗、装柱、平衡，得到重组弓形虫致密颗粒蛋白6亲和层析柱；(2)亲和层析:将重组弓形虫致密颗粒蛋白6抗体溶液通过(I)所制备的亲和层析柱，去掉非特异性媳妇后进行解吸，分段收集解吸液；(3)抗体获取:将(2)收集的解吸液，透析、冷冻干燥，既得重组弓形虫致密颗粒蛋白6抗体干粉。通过Western Blot检验该方法制备的抗体效果,具体见图3。
【权利要求】
1.一种弓形虫致密颗粒蛋白6抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)选择目的片段作为表达重组蛋白的目的基因:所选择的目的片段如序列表I所示； (2)弓形虫致密颗粒蛋白6的合成:将序列表中SEQID N0.1所示的目的片段通过PCR扩增，所述扩增使用引物如下， 上游引物:5’GACTAATTCGTTGGGTGGAGTCG 3’ 下游引物:5’GGCCTTTAGCGTTTCTGTGTTCGTTTG 3’ 扩增后插入质粒pET28a中，形成pET28a-GRA6质粒载体并转化大肠埃希菌BL21 (DE3)，在加入相应抗体的平板上筛选含有重组质粒的单菌落，提取重组质粒验证，在大肠埃希菌BL2KDE3)中表达目的蛋白； (3)弓形虫致密颗粒蛋白6的分离纯化:采用Ni柱纯化，包括蛋白提取和蛋白纯化； (4)制备兔抗弓形虫致密颗粒蛋白6多克隆抗体:用步骤(3)纯化后的重组弓形虫致密颗粒蛋白6作为抗原去免疫兔子，得到含抗重组弓形虫致密颗粒蛋白6抗体的抗血清； (5)对步骤(4)中得到的抗弓形虫致密颗粒蛋白6抗体的抗血清进行分离纯化，得到抗重组弓形虫致密颗粒蛋白6抗体干粉。
2.如权利要求1所述的弓形虫致密颗粒蛋白6抗体的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述蛋白提取的步骤为:收集培养的大肠埃希菌BL21(DE3)，离心弃上清；沉淀细胞用NTA-O缓冲液溶解形成缓冲体系；向缓冲体系中加入溶菌酶,置冰上冷却处理；将缓冲体系倒入烧杯中于冰上超声处理；后用离心机离心取上清再离心一次，再过0.22 μ m的滤膜过滤。
3.如权利要求1所述的弓形虫致密颗粒蛋白6抗体的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述蛋白纯化为:取Ni柱流干，后水洗Ni柱；用EDTA溶液洗涤Ni柱；再用水洗Ni柱；用NTA-O缓冲液洗涤Ni柱；后用NiSO4洗涤Ni柱，流干；再用NTA-O缓冲溶液洗涤Ni柱至流出液与NTA-O缓冲液pH相同；以lmL/min速度上样；用NTA-O缓冲溶液洗涤至G250不变蓝为止；后用20mM、60mM、200mM和500mM咪唑溶液洗Ni柱，直至检测G250不变蓝为止，分别收集流出液体，跑胶分析溶液中重组弓形虫致密颗粒蛋白6纯度。
4.如权利要求1所述的弓形虫致密颗粒蛋白6抗体的制备方法，其特征在于，步骤(4)中免疫兔子的具体步骤为:取步骤(3)中纯化后的重组弓形虫致密颗粒蛋白6与等体积的弗氏佐剂充分乳化后在兔背部皮下注射，注射量为500ug/只，首次免疫注射后第2周进行一次加强免疫注射，以后每隔两周加强免疫注射一次，每次加强免疫注射剂量与首次免疫注射剂量相同，加强免疫时取重组弓形虫致密颗粒蛋白6与等体积的弗氏佐剂充分乳化后在兔背部皮下注射，注射量为500ug/只，静脉采血，得到含抗重组弓形虫致密颗粒蛋白6抗体的抗血清。
5.如权利要求1所述的弓形虫致密颗粒蛋白6抗体的制备方法，其特征在于，步骤(5)中抗弓形虫致密颗粒蛋白6抗体的抗血清进行分离纯化的具体步骤为:(I)制备抗体亲和层析柱:将弓形虫致密颗粒蛋白6与压积CNBr-Sepharose 4B混合,依次经过交联、清洗、封闭、再次清洗、装柱、平衡，得到重组弓形虫致密颗粒蛋白6亲和层析柱；(2)亲和层析:将重组弓形虫致密颗粒蛋白6抗体溶液通过(I)所制备的亲和层析柱，去掉非特异性吸附后进行解吸，分段收集解吸液；(3)抗体获取:将(2)收集的解吸液，透析、冷冻干燥，既得重组弓形虫致密颗粒蛋白6抗体干粉。
【文档编号】C07K16/20GK104292329SQ201410468090
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年9月15日 优先权日:2014年9月15日
【发明者】沈鹤霄, 华权高 申请人:沈鹤霄