一种樟芝菌中腺苷的提取方法
【专利摘要】本发明涉及一种樟芝菌中腺苷的提取方法。所述的提取方法包括以下步骤：先将樟芝菌接种于PDA培养基中进行菌种活化，再将活化后的樟芝菌接种于液体种子培养基中，摇床培养得到摇床培养后的樟芝菌摇床培养，再取2%-5%的摇床培养后的樟芝菌接种于发酵罐中培养，得到深层发酵后的樟芝菌发酵液，最后制备樟芝菌菌丝体干粉，并将其溶于加有有机溶剂的水中在40-50°C的恒温水浴锅里浸提40-60min，离心取沉淀用水洗涤，取洗涤液即为腺苷的提取液。本发明中先对样品进行预处理，在有机溶剂提取时，将提取温度控制在40-5CTC，提取时间控制在40-60min,大大缩短了提取时间，同时也使腺苷,提取率明显增加，还能维护腺苷结构的稳定性。
【专利说明】一种樟芝菌中腺苷的提取方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种真菌有效成份的提取，具体涉及一种樟芝菌中腺苷的提取方法。
【背景技术】
[0002] 樟芝Antrodia camphorata又称牛樟芝或牛樟燕，是台湾特有珍贵真菌。研究发 现樟芝成分复杂，含有很多生理活性物质具有多种生理活性，如抗氧化、保肝、抗癌、解毒、 消炎等，对食物中毒等危急病症具有神奇的疗效。腺苷也是牛樟芝重要成分中的一种，其是 一种内源性嘌呤核苷酸，具有广泛的生理活性，如可以减少心肌漏出酶，维持细胞膜完整， 降低冠状动脉阻力和肺动脉压，并能促进造血等功能。另外，腺苷在炎症中由大量ATP降解 而成，局部浓度可达1200nm 〇L/L，腺苷浓度在此水平时具抗炎作用。目前ATP已广泛用于心 功能不全及血管动脉硬化等疾病的治疗。目前，国内外对腺苷的提取方法主要包括超声提 取、冷凝回流提取及水浴提取，提取介质主要包括水、甲醇、乙醇等，提取时采用的提取介质 不同、提取方法不同时，腺苷提取率也不同，但上述方法存在操作繁琐或提取率低等缺点。 为此，本发明对水浴浸提的方法进行了进一步改进，提供一种操作简单，腺苷提取率高的提 取方法。
【发明内容】
[0003] 针对上述现有技术的不足，本发明提供一种对樟芝菌中腺苷进行有效提取的方 法。
[0004] 本发明的技术方案如下： 一种樟芝菌中腺苷的提取方法，包括以下步骤： (1) 菌种活化：将樟芝菌接种于PDA培养基中，培养活化得到活化后的樟芝菌； (2) 摇床培养：将步骤（1)中得到的活化后的樟芝菌接种于液体种子培养基中，摇床培 养得到摇床培养后的樟芝菌； (3) 发酵培养：取2%-5%的步骤（2)中得到的摇床培养后的樟芝菌接种于发酵罐中培 养，得到深层发酵后的樟芝菌发酵液； (4) 樟芝菌干粉制备：取步骤（3)中得到的深层发酵后的樟芝菌发酵液离心，取沉淀加 水洗涤，再次离心，洗涤，将洗涤液在45-55°C条件下真空冷冻干燥，粉碎过筛，制得樟芝菌 菌丝体干粉； (5) 腺苷提取及腺苷含量测定：将步骤（4)中制得的樟芝菌菌丝体干粉溶于加有有机 溶剂的水中，在40-50°C的恒温水浴锅里浸提40-60min，离心，弃上清液，取沉淀用水洗涤， 取洗涤液即为腺苷的提取液。
[0005] 步骤（1)中所述的PDA培养基由以下重量份的组分组成：牛樟木萃取的营养液 5%-10%，葡萄糖10-30%，蛋白胨5-10%，酵母粉2-5%，琼脂5%-8%，水余量。
[0006] 步骤（1)中所述的PDA培养基的制成方法具体为：将5%_10%牛樟木萃取的营养 液，10-30%的葡萄糖，5-10%的蛋白胨，2-5%的酵母粉，5%-8%的琼脂，水余量，加热融化，装 试管，灭菌。
[0007] 所述的灭菌方法具体为：121°C条件下湿热灭菌30_45min。
[0008] 优选的，步骤（1)中所述的培养温度为25_28°C，培养时间为5-7d。
[0009] 步骤（2)中所述的液体种子培养基及步骤（3)中所述的发酵罐中的培养基均由以 下重量份的组分制成：牛樟木萃取的营养液5%_10%，葡萄糖10-30%，蛋白胨5-10%，酵母粉 2-5%，水余量。
[0010] 优选的，步骤（2)中所述的摇床培养的培养温度为25-28°C，培养时间为5-10d，摇 床速度为 150_180r/min。
[0011] 优选的，步骤（3)中所述的培养温度为25-28°C，培养时间为3-5d，通气量为lvvm。
[0012] 优选的，步骤（4)及步骤（5)中所述的离心速度为3000-5000r/min，离心温度为 25-28°C ;所述的过筛为过60-80目筛。
[0013] 优选的，步骤（5)中所述的溶剂选自乙醇或甲醇中的一种；所述的溶剂与水的体 积比为（3-5) : (11-17) 本发明与现有技术相比，有益效果体现在以下几点： 1.研究显示，真菌中腺苷的提取温度对腺苷的提取率具有显著的影响，提取温度在 40-50°C时，腺苷提取率有所增加，而当超过50°C时，腺苷提取率明显下降，因此，本发明中， 在对腺苷进行恒温水浴浸提时，将温度控制在40-50°C，更加利于样品中腺苷的有效提取， 此外，在温度控制在40-50 °C时还有利于维护腺苷结构的稳定性。
[0014] 2.研究显示，采用有机溶剂进行腺苷提取时，提取时间在2. 5h左右时，腺苷提取 率最高，本发明中，先对样品进行预处理制得樟芝菌干粉，在采用有机溶剂提取时，将溶剂 与水的体积比限定为（3-5) : (11-17)，在保证提取效果的基础上，可明显缩短提取时间。
【具体实施方式】
[0015] 下面结合实施例对本发明做进一步说明。
[0016] 实施例1 一种樟芝菌中腺苷的提取方法，包括以下步骤： (1) 菌种活化：将樟芝菌接种于PDA培养基中，在25°C条件下培养5d，培养活化得到活 化后的樟芝菌； (2) 摇床培养：将步骤（1)中得到的活化后的樟芝菌接种于液体种子培养基中，在 25°C，150r/min条件下摇床培养5d，得到摇床培养后的樟芝菌； (3) 发酵培养：取2%的步骤（2)中得到的摇床培养后的樟芝菌接种于发酵罐中在25°C 条件下培养3d，通气量为lvvm，得到深层发酵后的樟芝菌发酵液； (4) 樟芝菌干粉制备：取步骤（3)中得到的深层发酵后的樟芝菌发酵液在25°C条件下 采用3000r/min离心，取沉淀加水洗涤，以3000r/min再次离心，洗涤，将洗涤液在45°C条件 下真空冷冻干燥，粉碎过60目筛，制得樟芝菌菌丝体干粉； (5) 腺苷提取及腺苷含量测定：将步骤（4)中制得的樟芝菌菌丝体干粉溶于加有乙醇 的水中，乙醇与水的体积比为3:11，在40°C的恒温水浴锅里浸提40min，在25°C条件下以 3000r/min离心，弃上清液，取沉淀用水洗涤，取洗涤液即为腺苷的提取液。
[0017] 步骤（1)中所述的PDA培养基由以下重量份的组分组成：牛樟木萃取的营养液5%， 葡萄糖10%，蛋白胨5%，酵母粉2%，琼脂5%，水余量。
[0018] 步骤（1)中所述的PDA培养基的制成方法具体为：将5%牛樟木萃取的营养液，10% 的葡萄糖，5%的蛋白胨，2%的酵母粉，5%的琼脂，水余量，加热融化，装试管，在121°C条件下 湿热灭菌30min。
[0019] 步骤（2)中所述的液体种子培养基及步骤（3)中所述的发酵罐中的培养基均由以 下重量份的组分制成：牛樟木萃取的营养液5%，葡萄糖10%，蛋白胨5%，酵母粉2%，水余量。
[0020] 实施例2 一种樟芝菌中腺苷的提取方法，包括以下步骤： (1) 菌种活化：将樟芝菌接种于PDA培养基中，在28°C条件下培养7d，培养活化得到活 化后的樟芝菌； (2) 摇床培养：将步骤（1)中得到的活化后的樟芝菌接种于液体种子培养基中，在 28°C，180r/min条件下摇床培养10d，得到摇床培养后的樟芝菌； (3) 发酵培养：取5%的步骤（2)中得到的摇床培养后的樟芝菌接种于发酵罐中在28°C 条件下培养5d，通气量为lvvm，得到深层发酵后的樟芝菌发酵液； (4) 樟芝菌干粉制备：取步骤（3)中得到的深层发酵后的樟芝菌发酵液在28°C条件下 采用5000r/min离心，取沉淀加水洗涤，以5000r/min再次离心，洗涤，将洗涤液在55°C条件 下真空冷冻干燥，粉碎过80目筛，制得樟芝菌菌丝体干粉； (5) 腺苷提取及腺苷含量测定：将步骤（4)中制得的樟芝菌菌丝体干粉溶于加有甲醇 的水中，甲醇与水的体积比为5:17,在50°C的恒温水浴锅里浸提60min，在28°C条件下以 5000r/min离心，弃上清液，取沉淀用水洗涤，取洗涤液即为腺苷的提取液。
[0021] 步骤（1)中所述的PDA培养基由以下重量份的组分组成：牛樟木萃取的营养液 10%，葡萄糖30%，蛋白胨10%，酵母粉5%，琼脂8%，水余量。
[0022] 步骤（1)中所述的PDA培养基的制成方法具体为：将10%牛樟木萃取的营养液， 30%的葡萄糖，10%的蛋白胨，5%的酵母粉，8%的琼脂，水余量，加热融化，装试管，在121°C条 件下湿热灭菌45min。
[0023] 步骤（2)中所述的液体种子培养基及步骤（3)中所述的发酵罐中的培养基均由以 下重量份的组分制成：牛樟木萃取的营养液10%，葡萄糖30%，蛋白胨10%，酵母粉5%，水余 量。
[0024] 实施例3 一种樟芝菌中腺苷的提取方法，包括以下步骤： (1) 菌种活化：将樟芝菌接种于PDA培养基中，在26°C条件下培养6d，培养活化得到活 化后的樟芝菌； (2) 摇床培养：将步骤（1)中得到的活化后的樟芝菌接种于液体种子培养基中，在 26°C，160r/min条件下摇床培养8d，得到摇床培养后的樟芝菌； (3) 发酵培养：取3%的步骤（2)中得到的摇床培养后的樟芝菌接种于发酵罐中在26°C 条件下培养4d，通气量为lvvm，得到深层发酵后的樟芝菌发酵液； (4) 樟芝菌干粉制备：取步骤（3)中得到的深层发酵后的樟芝菌发酵液在26°C条件下 采用4000r/min离心，取沉淀加水洗漆，以4000r/min再次离心，洗漆，将洗漆液在50°C条件 下真空冷冻干燥，粉碎过80目筛，制得樟芝菌菌丝体干粉； (5)腺苷提取及腺苷含量测定：将步骤（4)中制得的樟芝菌菌丝体干粉溶于加有甲醇 的水中，甲醇与水的体积比为4:15,在45°C的恒温水浴锅里浸提50min，在26°C条件下以 4000r/min离心，弃上清液，取沉淀用水洗涤，取洗涤液即为腺苷的提取液。
[0025] 步骤（1)中所述的PDA培养基由以下重量份的组分组成：牛樟木萃取的营养液8%， 葡萄糖20%，蛋白胨8%，葡萄糖12%，酵母粉3%，琼脂6%，水余量。
[0026] 步骤（1)中所述的PDA培养基的制成方法具体为：将8%牛樟木萃取的营养液，20% 的葡萄糖，8%的蛋白胨，3%的酵母粉，6%的琼脂，水余量，加热融化，装试管，在121°C条件下 湿热灭菌40min。
[0027] 步骤（2)中所述的液体种子培养基及步骤（3)中所述的发酵罐中的培养基均由以 下重量份的组分制成：牛樟木萃取的营养液8%，葡萄糖20%，蛋白胨8%，酵母粉3%，水余量。
[0028] 上述实施例仅为本发明的优选实施方式，并不应理解为对本发明的限定，本领域 技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保 护范围之内。
【权利要求】
1. 一种樟芝菌中腺苷的提取方法，其特征于，包括以下步骤： (1) 菌种活化：将樟芝菌接种于PDA培养基中，培养活化得到活化后的樟芝菌； (2) 摇床培养：将步骤（1)中得到的活化后的樟芝菌接种于液体种子培养基中，摇床培 养得到摇床培养后的樟芝菌； (3) 发酵培养：取2%-5%的步骤（2)中得到的摇床培养后的樟芝菌接种于发酵罐中培 养，得到深层发酵后的樟芝菌发酵液； (4) 樟芝菌干粉制备：取步骤（3)中得到的深层发酵后的樟芝菌发酵液离心，取沉淀加 水洗涤，再次离心，洗涤，将洗涤液在45-55°C条件下真空冷冻干燥，粉碎过筛，制得樟芝菌 菌丝体干粉； (5) 腺苷提取及腺苷含量测定：将步骤（4)中制得的樟芝菌菌丝体干粉溶于加有有机 溶剂的水中，在40-50°C的恒温水浴锅里浸提40-60min，离心，弃上清液，取沉淀用水洗涤， 取洗涤液即为腺苷的提取液。
2. 根据权利要求1所述的一种樟芝菌中腺苷的提取方法，其特征于，步骤（1)中所述的 PDA培养基由以下重量份的组分组成：牛樟木萃取的营养液5%-10%，葡萄糖10-30%，蛋白胨 5-10%，酵母粉2-5%，琼脂5%-8%，水余量。
3. 根据权利要求1所述的一种樟芝菌中腺苷的提取方法，其特征于，步骤（1)中所述的 PDA培养基的制成方法具体为：将5%-10%牛樟木萃取的营养液，10-30%的葡萄糖，5-10%的 蛋白胨，2-5%的酵母粉，5%-8%的琼脂，水余量，加热融化，装试管，灭菌。
4. 根据权利要求3所述的一种樟芝菌中腺苷的提取方法，其特征于，所述的灭菌方法 具体为：121°C条件下湿热灭菌30-45min。
5. 根据权利要求1所述的一种樟芝菌中腺苷的提取方法，其特征于，步骤（1)中所述的 培养温度为25-28°C，培养时间为5-7d。
6. 根据权利要求1所述的一种樟芝菌中腺苷的提取方法，其特征于，步骤（2)中所述的 液体种子培养基及步骤（3)中所述的发酵罐中的培养基均由以下重量份的组分制成：牛樟 木萃取的营养液5%-10%，葡萄糖10-30%，蛋白胨5-10%，酵母粉2-5%，水余量。
7. 根据权利要求1所述的一种樟芝菌中腺苷的提取方法，其特征于，步骤（2)中所述的 摇床培养的培养温度为25-28°C，培养时间为5-10d，摇床速度为150-180r/min。
8. 根据权利要求1所述的一种樟芝菌中腺苷的提取方法，其特征于，步骤（3)中所述的 培养温度为25-28°C，培养时间为3-5d，通气量为lvvm。
9. 根据权利要求1所述的一种樟芝菌中腺苷的提取方法，其特征于，步骤（4)及步骤 (5)中的所述的离心速度为3000-5000r/min，离心温度为25-28°C ;所述的过筛为过60-80 目筛。
10. 根据权利要求1所述的一种樟芝菌中腺苷的提取方法，其特征于，步骤（5)中所述 的溶剂选自乙醇或甲醇中的一种；所述的溶剂与水的体积比为（3-5) : (11-17)。
【文档编号】C07H1/06GK104212856SQ201410471596
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年9月17日 优先权日:2014年9月17日
【发明者】刘巴宁, 郑安乔 申请人:中山安荞生物科技有限公司