具有阻断新生血管形成功能的多肽化合物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种具有阻断新生血管形成功能的多肽化合物。该多肽化合物为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。该小分子多肽化合物可以通过阻断新生血管的形成而抑制实验小鼠体内实体肿瘤的生长，属于生物医学领域。本发明基于该小分子多肽化合物能够抑制体外人脐静脉内皮细胞形成血管状结构，抑制裸鼠皮下接种基底膜基质中血管的生成，抑制裸鼠皮下接种实体瘤的生长；并且与传统的抗瘤药物顺铂相比，该小分子多肽化合物对小鼠的体重无明显影响，因此具有低副作用的优势，可作为治疗肿瘤的潜在的高效低副作用的药物。
【专利说明】具有阻断新生血管形成功能的多肽化合物
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种具有阻断新生血管形成和抑制实体瘤生长功能的多肽化合物。
【背景技术】
[0002]目前，恶性肿瘤已经成为人类死亡的主要病因。在中国，恶性肿瘤死亡率占总疾病死亡率的28.53%，仅次于心脑血管疾病。所以，寻求高效低副作用的新型预防和治疗肿瘤的药物有着重要的现实和社会意义。
[0003]传统的治疗肿瘤的方法包括物理治疗与化学治疗。物理治疗主要指放射疗法和手术摘除等。放射治疗对身体其他正常组织损害较大，手术摘除亦存在物理损伤和提高癌细胞释放和转移的风险。化学治疗又称化疗，采用化学药物直接破坏或杀伤癌细胞，如顺钼，抗生素类(丝裂霉素、平阳霉素、博来霉素等)，植物类(长春新碱、托泊替康等)，激素类(地塞米松、法乐通等)等药物。顺钼通过阻断DNA复制来达到抑制肿瘤细胞生长的目的。抗生素类抑癌药物主要作用于遗传信息传递的不同环节，通过干扰DNA、RNA、蛋白质的合成来抑制肿瘤细胞的生长。植物类药物多作用于细胞分裂的M期，阻止有丝分裂，使癌细胞致死。激素类抗癌药，一般通过改变体内激素水平，对激素依赖性的肿瘤进行抑制。化疗的缺点是选择性差，毒性大，在杀伤癌细胞的同时也会对正常体细胞有较强的杀伤作用，所以传统的抑瘤药物都会对癌症患者带来诸多副作用，例如食欲下降，呕吐，头晕，脱发等等。实体瘤在患者体内的生长和转移主要依赖新生血管的形成。当实体瘤体积超过数个_3时，如果没有足够的新生血管为其提供营养物质，排除代谢产物，肿瘤将无法继续生长并会进而坏死。因此，抑制肿瘤内的血管生成为治疗肿瘤的一个重要方向。新生血管的形成是指从已有的血管增殖形成新的血管，是促血管形成因子(VEGF、TOGF等)和抑制血管形成因子协调作用的结果。首先，血管内皮细胞上的促血管形成因子受体被激活；其次，活化的内皮细胞开始释放蛋白酶来降解基底膜；然后，内皮细胞迁移并繁衍形成周围基质及萌芽状机构；进而芽状机构扩大形成环形，最后形成完整的血管腔。新生血管的形成在生长，发育和不同的病理和生理过程中扮演重要的角色，例如在胎儿生长发育，伤口愈合、女性经期恢复等。而在肿瘤恶化病变中，新生血管的形成是实体瘤增值的必要条件。所以，抑制新生血管的形成成为抗肿瘤研究的热点领域。近年来，以促血管形成因子为靶位点开发了多种抑制剂药物。其中以拮抗VEGF及其受体为主。但因为新生血管的形成受多种分子的调控，所以单一位点的抑制药物常常达不到理想的结果。所以采用多位点，多途径的方案来抑制新生血管形成成为一个新的研究突破点。
[0004]整合素(integrin)家族是一类介导细胞和细胞之间以及细胞和基质之间相互识别的跨膜粘连蛋白分子。每个整合素成员是由α和β两亚基组成的异二聚体。目前，在哺乳动物中共发现18种α亚基和8种β亚基，它们相互组合可形成24种不同的整合素分子。几乎所有不同组织的细胞上都有一种或几种整合素分子表达。整合素的活性由穿膜双向信号通路调控。整合素激活后可以识别并结合胞外配基，介导细胞的粘附和迁移；而配基的结合可以诱导胞内多种调控信号，从而进一步调控细胞形态，生长，分化和凋亡等。整合素ανβ 3受体在多种恶性肿瘤细胞表面和肿瘤组织中新生血管内皮细胞膜上高表达，而在成熟血管内皮细胞和绝大多数正常器官中微量或不表达。该蛋白分子作为内皮细胞与细胞外基质的桥梁，通过调节内皮细胞的黏附、迁移、增殖等功能，在肿瘤血管生成的过程中发挥着重要的作用。
[0005]基于整合素在肿瘤发生发展中的关键作用，以整合素为靶点进行抗肿瘤药物的研发及相应治疗方法的开发已成为近几年来肿瘤治疗的热点。当前的整合素靶向抗肿瘤药物主要分为以下几类:整合素抗体类药物、含有与整合素高亲和力结合序列的抗肿瘤药物、以整合素为靶点的其他类药物等，其中一部分药物已顺利进入临床研究阶段。尽管到目前为止，还未见此类药物上市的报道，但良好的疗效使其显示出巨大的应用前进和市场潜力。
[0006]目前针对整合素ανβ3受体而开发的抗体类药物主要包括:(I)Vitaxin(MED1-523或LM609)，是由Medlmmune公司研究开发的整合素α νβ 3的人源化单克隆抗体，在临床研究中显现抗肿瘤血管生成的活性；(2)Abegrin (MED1-522或Etaracizumab),是对Vitaxin的改进；(3)CNT095是一种完全人源的整合素α V亚基单克隆抗体，起作用靶位点是整合素ανβ3和ανβ 5，在临床前异种移植瘤模型中表现出抗肿瘤与抗血管生成的双重活性；(4) IMGN388是一种新颖的抗体-药物复合物，由整合素α V亚基的完全人源化抗体与具有杀伤癌细胞作用的DM4共价连接而成，其作用靶位点分布广泛。临床前研究表明，具有抗血管生成和细胞毒双重效应，目前正处于晚期实体瘤I期临床试验阶段。
[0007]含有与整合素高亲和力结合序列的抗肿瘤药物:整合素能与多种保守氨基酸序列高亲和力结合，其中，RGD序列(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)最为典型。含有RGD序列的化合物或多肽能与ανβ3、ανβ5、α5β1等识别RGD序列的整合素特异性结合并抑制其生物学功能，目前以RGD序列为基础开发的小肽类整合素拮抗分子主要有:(1) Cilengitide(EMD121974)，是一种具有环状多肽(RGDfV)结构的小分子化合物，其作用靶位点为整合素ανβ3和ανβ5，目前正进行肺癌和前列腺癌的临床II期试验与胶质母细胞瘤的III期试验；(2) S247是整合素ανβ3的阻断剂，目前处于临床前研究；(3)ΗΜ-3和EDSM-Y的作用靶位点为整合素ανβ3。这些多肽在体内外实验中均表现出抗血管生成与抗肿瘤活性。另外，也有一些不含RGD序列的多肽类整合素抑制剂，如ΑΤΝ-161 (针对α5β1)等。
[0008]除此之外，一些非肽类整合素拮抗剂也显示具有抗肿瘤转移的作用，如PSK1404
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[0009]与传统肿瘤治疗方法相比，整合素靶向抗肿瘤药物表现出明显的高特异性和低毒副作用等特点。但同时整合素错综复杂的信号调控和多重的功能机制在一定程度上也给整合素靶向治疗带来了挑战。
[0010]以上针对整合素的抗体或小分子拮抗剂都是针对整合素胞外区域而设计的，整合素ανβ 3受体位于细胞表面，直接与血液接触，这些药物易达到靶位点。但整合素介导的细胞信号通路是双向的(由内至外和由外至内)，双向信号的转导是通过整合素胞内序列介导的。比如整合素β3亚基胞内段部分，它自身含有与多种胞内信号分子结合的位点，如kindlin, β 3-endonexin, Src, talin等,而这些信号分子在新生血管形成中可能起到重要的调控作用。所以，针对β 3型整合素胞内端肽段与胞内不同信号分子结合的特点来开发新型抗新生血管形成和抗肿瘤生长的特效药物有着很强的可行性。
【发明内容】
[0011]本发明的目的在于提供了一种阻断新生血管形成功能的多肽化合物。
[0012]为达到上述目的，本发明采用如下技术方案:
一种具有阻断新生血管形成的多肽化合物，其特征在于该多肽化合物为SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列。
[0013]上述的具有阻断新生血管形成的多肽化合物在制备抑制新生血管形成药物中的应用。
[0014]上述的具有阻断新生血管形成的多肽化合物在制备抑制实体瘤生长药物中的应用。
[0015]本发明基于该小分子多肽化合物能够抑制体外人脐静脉内皮细胞形成血管状结构，抑制裸鼠皮下接种基底膜基质中血管的生成，抑制裸鼠皮下接种实体瘤的生长；并且与传统的抗瘤药物顺钼相比，该小分子多肽化合物对小鼠的体重无明显影响，因此具有低副作用的优势，可作为治疗肿瘤的潜在的高效低副作用的药物。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1为本发明的小分子多肽化合物Mibtide3.1的氨基酸序列和组成。穿膜多肽为具有11个氨基酸的序列(称为Tat序列)，可以介导与之偶联的多肽或分子进入细胞内；目的多肽为含有12个氨基酸的多肽序列，其自身不具有穿越细胞膜进入细胞内的功能；Mibtide3.1多肽序列是Tat序列与目标多肽的复合体，可穿越细胞膜进入细胞内发挥功倉泛。
[0017]图2为本发明的小分子多肽化合物Mibtide3.1抑制脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)体外形成血管样小管效果对比图。
[0018]图3为本发明的小分子多肽化合物Mibtide 3.1抑制皮下种植基底膜基质(Matrigel)团块中血管的形成。
[0019]图4为本发明的小分子多肽化合物抑制裸鼠皮下实体瘤的生长。
[0020]图5为本发明的小分子多肽化合物Mibtide3.1抑制实体瘤内血管的形成。
【具体实施方式】
[0021]实施例一:合成并纯化Mibtide 3.1多肽分子
该多肽合成于公司，采用手动固相Fmoc法，以Fmoc-Gly-Wang树脂为起始原料,从C端向N端方向合成。纯化采用HPllOO型(美国安捷伦公司)反相高效液相色谱仪，其纯度可达99.62%。
[0022]实施例二:脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)管道形成的实验:
体外培养的人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)在含生长因子的基底膜基质上能自行组装成类似血管的管道结构。在细胞培养液中加入Mibtide 3.1 (终浓度20 μ M)，观察其抑制HUVEC组装管道的能力。参见图1和图2，结果显示，与无药处理组相比较，添加Mibtide 3.1的能够有效的抑制管道的形成；而加入相同浓度的未加修饰的目标多肽或单独的穿膜多肽分子不具有抑制作用，说明Mibtide3.1多肽(20μΜ)对HUVEC体外形成血管样管道结构起到显著的抑制作用(# P < 0.01)。
[0023]实施例二:小鼠体内基底I旲基质中血管形成实验:
实验材料为裸鼠(BALB/C)，6周龄，雄性，皮下注射500 μ I基底膜基质(Matrigel，含250ng/ml bFGF 和 60U/ml heparin), Mibtide 3.1 处理组添加 Mibtide 3.1 (50 MM),历时7-10天。取出填充物,测定血红蛋白含量,发现相同重量的基质中,Mibtide 3.1处理组相对与无药对照组所含血红蛋白含量明显降低。同时进行组织化学分析(HE染色)，发现Mibtide 3.1处理组新生血管量比无药对照组显著减少。参见图3, (A) Matrigel放在冰上融化为液态后分别添加生长因子bFGF (250 ng/ml),肝素(60U/ml)和所列不同多肽化合物(50 μΜ)，并在液体状态下注射到实验小鼠(BALB/c裸鼠)背部皮下。Matrigel进入小鼠体内迅速固态化并诱导新生血管的生长，十天后固态Matrigel块小心从小鼠皮下剥离取出并经固定和H&E染色后，然后显微镜下观察。红色团块为血管内红细胞染色，浅粉色背景为Matrigel染色。图示标尺为lOOMm。(B)不同组别Matrigel中形成的血管(直径>100 Mffl)在显微镜下计数。无药物处理组和单纯穿膜多肽处理组每个视野一般含有4 一 6个血管，两者没有明显差别，而Mibtide3.1多肽处理组每个视野一般只形成I 一 2个血管，相对于前两组有显著的区别(** P < 0.01)。(C)从小鼠皮下剥离出的固态Matrigel团块先用PBS清洗并称重。取相同质量的Matrigel团块，加入适量组织蛋白萃取液(RIPA)，匀浆后离心取上清，然后用利用ELISA Kit测定血红蛋白的含量。结果显示Mibtide3.1处理组Matrigel团块中血红蛋白含量明显低于对照组(** p < 0.01),说明Mibtide3.1处理可以有效抑制Matrigel中血管的形成。以上结果证明Mibtide 3.1对新生血管的形成具有明显的抑制作用。
[0024]实施例四:比较Mibtide 3.1与临床抗癌药物顺钼对小鼠实体瘤生长的作用:
实验材料为裸鼠(BALB/C)，6周龄，雄性，皮下注射结肠癌细胞HT-29 (2xl07 /只)，并添加1%基底膜基质。在5天左右成瘤后，随机分3组，第一组连续7天皮下注射Mibtide3.1 (20μΜ；100μ I);第二组皮下注射等量PBS缓冲液作为对照；第三组腹腔注射顺钼(给药量2.5mg/kg);记录小鼠肿瘤大小与体重变化。
[0025]参见图4，(A) BALB/c裸鼠背部皮下注射结肠癌HT-29细胞。第三天开始每天给药，历时7天。Mibtide3.1组局部给药(药物浓度为20μΜ，局部注射ΙΟΟμΙ);顺钼组腹腔注射顺钼溶液(2.5mg/kg);对照组肿瘤周围皮下注射100 μ I PBS。第五天起每天记录肿瘤体积(V)大小(V=LXWX 0.52 ;其中L为肿瘤测量长度，W为肿瘤测量宽度)，每组小鼠n=7。相对于对照组，Mibtide3.1对肿瘤的生长具有显著的抑制作用，其效果与顺钼相当。(B)皮下注射肿瘤后每天记录荷瘤小鼠的体重。对照组、Mibtide3.1处理组与顺钼处理组的裸鼠初始体重无明显差异。连续给药后，对照组与Mibtide3.1处理组小鼠体重无明显变化；而顺钼处理组小鼠体重明显降低。实验结果发现，相对于对照组，顺钼和Mibtide 3.1对肿瘤生长都有明显的的抑制作用。在体重变化方面，顺钼造成小鼠体重明显下降，而Mibtide
3.1处理组小鼠体重无明显变化。在实验过程中亦可发现顺钼组小鼠的进食与进水量相对于其他两组减半，说明Mibtide 3.1对肿瘤生长起明显的抑制作用，而同时造成的副作用明显小于顺钼。
[0026]实施例五:比较Mibtide 3.1与临床抗癌药物顺钼对小鼠实体瘤内血管形成的作用:
经以上处理的小鼠皮下种植生长的HT-29肿瘤于接种两周后取出，经PBS清洗，4%中性甲醛固定，然后制做蜡切片并进行CD31免疫组化检测。参见图5，(A)结果显示，无药物处理对照组与顺钼处理组肿瘤内有明显的血管的生成；虽然Mibtide3.1处理组的肿瘤内有CD31阳性细胞，但大多不能形成血管样结构。红色箭头所指为血管，图示标尺为100 μ m。(B)相对于无药物处理对照组，Mibtide3.1处理对肿瘤内血管的形成具有明显的抑制作用；而顺钼处理组肿瘤内血管的数目与对照组类似。(** P < 0.01)。(C)进一步统计肿瘤组织中⑶31阳性染色分值(组织内相对阳性面积)可发现顺钼处理组和Mibtide3.1处理组肿瘤内CD31阳性染色分值显著低于无药物处理组，这可能是由于无药物处理的肿瘤内含有更多小血管或血管内皮细胞的缘故^MMibtide3.1处理组相对于顺钼处理组显示更弱的⑶31阳性染色，说明Mibtide3.1处理可以更显著的降低肿瘤组织中血管的含量(** P <
0.01)。这些实验结果证明Mibtide 3.1对肿瘤内新生血管的形成有着特异的抑制作用。
【权利要求】
1.一种具有阻断新生血管形成的多肽化合物，其特征在于该多肽化合物为SEQ IDN0.1所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的具有阻断新生血管形成的多肽化合物或任何其他含有SEQID N0.1中所包含的核心氨基酸序列(ATSTFTNITYRG)的化合物在制备抑制新生血管形成药物中的应用。
3.根据权利要求1所述的具有阻断新生血管形成的多肽化合物或任何其他含有SEQID N0.1中包含的核心氨基酸序列(ATSTFTNITYRG)的化合物在制备抑制实体瘤生长药物中的应用。
【文档编号】C07K19/00GK104231087SQ201410473491
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年9月17日 优先权日:2014年9月17日
【发明者】马衍青, 许祯, 苗春晓, 张莹莹, 杨超, 高娟, 邓文锋 申请人:上海大学