一种合成的噬菌体展示纳米抗体文库及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于纳米抗体保守框架cAbBCII10的CDR3区氨基酸序列随机化但不含半胱氨酸及终止密码子的噬菌体展示纳米抗体文库，并利用该文库筛选获得具有特异性和检测功能的前白蛋白纳米抗体，公布了该前白蛋白纳米抗体VHH链的氨基酸序列以及编码该纳米抗体的基因序列，此外，还提供了一种能够表达该纳米抗体的宿主细胞，并介绍了前白蛋白纳米抗体在检测前白蛋白方面的用途。
【专利说明】一种合成的噬菌体展示纳米抗体文库及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医学与分子生物学领域，涉及一种噬菌体展示纳米抗体文库以及 基于该文库筛选获得的针对前白蛋白PA的纳米抗体。
【背景技术】
[0002] 噬菌体展示是目前纳米抗体文库构建最为广用的方法。由免疫过的骆驼产生的纳 米抗体文库能够保持完整的多样性。尽管高亲和力的纳米抗体可以在短时间内筛选获得， 但在某些情况下，无法实现骆驼免疫，例如免疫原具有高毒性或致病性，蛋白错误折叠形成 包涵体而无法得到可溶性抗原，抗原自免疫性以及当一些抗原是不具有免疫性的小分子化 合物等等。为解决这些问题，天然文库或合成文库成为获得特异性好、亲和力强的纳米抗体 的选择。本发明基于一种纳米抗体保守框架cAbBCIIlO,通过重叠延伸PCR，在保持FR1区 至FR3区固定不变的情况下，利用三碱基密码子为原料，使CDR3区的具有16个氨基酸并且 这些氨基酸的顺序随机自由组合排序，同时排除半胱氨酸出现。通过这种新技术，我们得到 的纳米抗体文库库容为3 X 109,并且质量很好，多样性丰富。
[0003] 前白蛋白（Prealbumin，PA)，又称转甲状腺素蛋白，分子量5. 4万，由肝细胞合 成，在电泳分离时，常显示在白蛋白的前方，其半衰期很短，仅约1.9天。因此，测定其在血 浆中的浓度对于了解蛋白质的营养不良、肝功能不全、比之白蛋白和转铁蛋白具有更高的 敏感性。目前市场上用于检测前白蛋白的试剂盒的工作原理主要通过一种针对于前白蛋白 的抗体来实现的，但是这种传统意义上的抗体稳定性差、灵敏度低、生产成本高，所有因素 均限制了对于前白蛋白的检测。比利时科学家在骆驼血液中发现纳米抗体能像正常抗体一 样与抗原等靶标紧密结合，具有很好的结构稳定性与抗原结合活性。
【发明内容】
[0004] 本发明所解决的技术问题是：构建一种基于纳米抗体保守框架cAbBCIIlO的⑶R3 区氨基酸序列随机自由排布但排除半胱氨酸及终止密码子的噬菌体展示纳米抗体文库，同 时利用该文库筛选获得针对前白蛋白PA的纳米抗体及其在制备检测试剂中的用途。
[0005] 为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：提供一种噬菌体展示纳米 抗体文库，该文库包括纳米抗体保守框架cAbBCIIlO的FR1区至FR3区对应的整段DNA序 列、FR4区对应的DNA序列、以及利用三碱基密码子使CDR3区含16个氨基酸且氨基酸随机 任意排布但排除半胱氨酸及终止密码子的相应的DNA序列，通过重叠延伸PCR获得包含上 述序列的DNA片段，将该DNA片段与噬菌粒载体重组构建重组质粒转化大肠杆菌从而构建 成噬菌体展示纳米抗体文库。
[0006] 此外还提供了一种前白蛋白纳米抗体，其VHH链包括框架区FR和互补决定区⑶R， 其特征在于，所述框架区FR包括FR1、FR2、FR3、FR4的氨基酸序列，其氨基酸序列分别为SEQ ID N0:1 所示 FR1，SEQ ID N0:2 所示 FR2, SEQ ID N0:3 所示的 FR3, SEQ ID N0:4 所示的 FR4 ;所述互补决定区⑶R包括⑶Rl、⑶R2、⑶R3的氨基酸序列，其氨基酸序列分别为SEQ ID N0:5 所示的 CDR1，SEQ ID N0:6 所示的 CDR2,以及 SEQ ID N0:7 或 SEQ ID N0:8 或 SEQ IDN0:9或SEQIDN0:10或SEQIDN0:11或SEQIDN0:12所示的CDR3。
[0007] 优选的，所述前白蛋白纳米抗体的VHH链具有以下任意一组氨基酸序列：SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO:4 和 SEQ ID NO:7 所示氨基酸序列；或 SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO:4 和 SEQ ID NO:8所示氨基酸序列；或SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:9所示氨基酸 序列；或SEQ ID NO: 13、SEQ ID N0:4 和SEQ ID NO: 10所示氨基酸序列；或SEQ ID NO: 13、 SEQ ID NO: 4 和 SEQ ID NO: 11 所示氨基酸序列；或 SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 4 和 SEQ ID NO: 12所示氨基酸序列。
[0008] 此外，还采用一种DNA分子，它用以编码本发明所述的前白蛋白纳米抗体的VHH 链。
[0009] 优选的，所述的DNA分子，具有以下任意一组核苷酸序列：SEQ ID N0:14、SEQ ID NO: 15 和SEQ ID NO: 16所示核苷酸序列；或SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15 和SEQ ID NO: 17 所示核苷酸序列；或SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15和SEQ ID NO: 18所示核苷酸序列；或 SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15 和 SEQ ID NO: 19 所示核苷酸序列；或 SEQ ID NO: 14、SEQ ID N0:15 和SEQ ID N0:20所示核苷酸序列；或SEQ ID N0:14、SEQ ID N0:15 和SEQ ID N0:21 所示核苷酸序列。
[0010] 本发明还提供一种表达载体，它包含编码本发明所述的前白蛋白纳米抗体DNA分 子的核昔酸序列，一种宿主细胞，它可以表达如白蛋白的纳米抗体。
[0011] 最后本发明还提供了本发明所述前白蛋白纳米抗体在检测前白蛋白方面的用途。
[0012] 本发明的有益效果是：与现有技术相比，本发明的优点如下：本发明基于一种纳 米抗体保守框架cAbBCII 10，通过重叠延伸PCR，在保持FR1区至FR3区固定不变的情况下， 利用三碱基密码子为原料，使⑶R3区具有16个氨基酸并且这些氨基酸的顺序随机自由组 合排序，同时排除半胱氨酸及终止密码子出现，利用重叠延伸PCR获得的基因片段和噬菌 粒载体构建重组质粒从而建立噬菌体纳米抗体基因库，将上述重组质粒转化大肠杆菌构建 成噬菌体展示纳米抗体文库，同时，试验中将前白蛋白PA偶联在酶标板上，以此形式的前 白蛋白PA利用噬菌体展示技术筛选构建纳米抗体基因库，从而获得了针对前白蛋白PA特 异性纳米抗体基因，将此基因转至大肠杆菌中，从而建立了能在大肠杆菌中高效表达的纳 米抗体株。本发明采用构建的新型噬菌体展示纳米抗体文库能够筛选获得具有特异性和检 测功能的纳米抗体，可以解决由于抗原因素造成无法免疫骆驼导致无法构建相应噬菌体展 示纳米抗体文库而无法得到纳米抗体的问题，这样的噬菌体展示纳米抗体文库将作为生物 研究和医学诊断的有力资源。
【专利附图】
【附图说明】
[0013] 图1是噬菌体展示纳米抗体文库构建和前白蛋白纳米抗体筛选流程的模式图； 图2是重叠延伸PCR三阶段的DNA电泳图； 图3是对于所构建的噬菌体展示纳米抗体文库进行插入率检测的菌落PCR电泳图，其 中泳道1是DNA分子标准，泳道2-24是所构建的前白蛋白纳米抗体文库中随机挑取的克隆 PCR检测电泳图； 图4是对所建文库的库容大小进行鉴定的梯度稀释涂板图； 图5是用噬菌体的酶联免疫方法（ELISA)筛选特异性单个阳性克隆的模式图； 图6是表达的针对前白蛋白PA的纳米抗体，经镍柱亲和层析纯化后的SDS-PAGE的电 泳图；其中泳道1含50毫摩尔咪唑洗脱液所洗脱的样品，泳道2是含100毫摩尔咪唑洗脱 液所洗脱的样品，泳道3是250毫摩尔咪唑洗脱液所洗脱的样品，泳道4是500毫摩尔咪唑 洗脱液所洗脱的样品； 图7是表达的针对前白蛋白的纳米抗体用于检测前白蛋白PA的ELISA实验结果柱状 图，横坐标是前白蛋白PA的浓度(微克/毫升)，纵坐标是不同前白蛋白PA浓度对应的实验 组与对照组波长405 nm读值的比值。
【具体实施方式】
[0014] 下面将结合说明书附图，对本发明作进一步的说明。
[0015] 本发明首先请生物公司合成纳米抗体保守框架cAbBCIIlO的FR1区至FR3区对应 的整段DNA序列以及利用三碱基密码子使CDR3区含16个氨基酸且氨基酸随机任意排布但 排除半胱氨酸及终止密码子的相应的DNA序列和PCR搭桥所需的相应引物，通过重叠延伸 PCR获得DNA片段，再与噬菌粒载体重组并转化大肠杆菌构建纳米抗体基因文库。另外，将 前白蛋白PA偶联在NUNC酶标板上，以此形式的抗原利用噬菌体展示技术从构建的文库中 筛选能在大肠杆菌中高效表达的针对前白蛋白PA的纳米抗体株，并利用该纳米抗体对前 白蛋白PA进行检测试验。
[0016] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
[0017] 实施例1 :基于纳米抗体保守框架cAbBCIIlO的⑶R3区氨基酸序列随机自由化 但排除半胱氨酸的噬菌体展示纳米抗体文库的构建： (1)请生物公司合成纳米抗体保守框架cAbBCII 10的FR1区至FR3区对应的整段DNA序 列，即 SEQ ID N0:15，5，-CAA GTT CAA TTG GTT GAA TCT GGT GGT GGT TCT GTT CAA GCT GG TGG TTC TTT GAG ATT GTC TTG TAC TGC TTC TGG TGG TTC TGA ATAT TCT TAT TCT ACT TTT TCT TTG GGT TGG TTT AGA CAA GCT CCA GGT CM GAA AGA GAA GCT GTT GCT GCT ATT GCT TCT ATG GGT GGT TTG ACT TAT TAT GCT GAT TCT GTT AM GGT AGA TTT ACT ATT TCT AGA GAT MT GCT AAA MT ACT GTT ACT TTG CM ATG AAT AAT TTG AM CCA GAA GAT ACT GCT ATT TAT TAT TGT GCT GCT-3'，作为PCR模版1使用；合成利用三碱基密码子使⑶R3区 含16个氨基酸且氨基酸随机任意排布但排除半胱氨酸及终止密码子的相应的DNA序列，即 SEQ ID N0:22,5，-ACT GCT ATT TAT TAT TGT GCT GCT [N]16TGG GGT CM GGT ACT CAA-3，， 同时作为上游引物2使用；合成其余引物：上游引物1 (SEQ ID NO :23)，5' -CAT ATG CAA GTT CAA TTG GTT GAA-3，，下游引物 1(SEQ ID NO :24), 5' - AGC AGC ACA ΑΤΑ ATA AAT -3'，下游引物2(SEQIDN0:25)，5'-GAATTCCTAAGAAGAAACAGTAACTTGAGTACC TTG ACC CCA-3'。（2)将上述模版或引物进行重叠 PCR延伸获得FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3 区和FR4区恒定，CDR3区含16个氨基酸且氨基酸随机任意排布但不含半胱氨酸及终止密 码子的对应的DNA片段，结果如图2显示，该片段的大小约为381碱基数。图2从左到右分 别是：左边为以cAbBCIIlO的FR1区至FR3区对应的整段DNA序列为模版，上游引物1和下 游引物1为延伸引物获得的DNA片段；中间是用CDR3区氨基酸随机任意排布但排除半胱氨 酸及终止密码子的相应的DNA序列为模版同时为引物和下游引物2扩增产生的DNA片段； 右边是重叠延伸PCR产生的最终的DNA片段（3)使用限制性的内切酶Pst I及Not I酶切 96微克pMECS噬菌体展示载体（Biovector供应）及32微克VHH并连接两个片段。（5)将 连接产物电转化至感受态细胞TG1 (北京神州红叶科技有限公司）中，构建基于纳米抗体保 守框架cAbBCIIlO的CDR3区氨基酸序列随机化但排除半胱氨酸及终止密码子的噬菌体展 示纳米抗体文库并测定库容，库容的大小为3 X 109，图4显示当稀释倍数为106时，克隆数 量约为32颗；与此同时，随机挑取24颗克隆，通过菌落PCR检测所建文库的插入率检测结 果插入率为100%，图3显示菌落PCR结果。文库构建完成后，随机挑取6颗克隆测序，检测 CDR3区正确性和多样性，结果表明该文库CDR3区的确含有16个氨基酸且不含半胱氨酸及 终止密码子，同时6颗克隆有5种不同的CDR3区DNA序列，且编码5种不同氨基酸序列，表 明多样性很好。
[0018] 实施例2 :针对前白蛋白PA的纳米抗体的筛选过程： (1)取200微升转化TG1细胞加入到100毫升2XTY培养基中，37°C培养3小时。（2) 加入40微升VCSM13辅助噬菌体，室温静置30分钟。（3)离心10分钟，将离心沉淀下来的 细胞重悬接入250毫升2 XTY培养基，37°C培养过夜；（4)将培养液8000 rpm离心30分 钟，取上清液，用PEG/NaCl沉淀扩增后的噬菌体，并将沉淀后的噬菌体溶解在PBS溶液中。 (5)将溶解在100毫摩尔pH 8. 2 NaHC03中的前白蛋白PA共10微克偶联在NUNC酶标板 上，4°C放置过夜，同时设立负对照。（26)第二天两个孔中分别加入100微升0.1%酪蛋白， 室温封闭2小时。（7) 2小时后，加入100微升采用上述步骤4所述方法收集的噬菌体，在 室温下作用1小时。（8)用PBST (PBS中含有0. 05%吐温20)洗5遍，洗去不结合的噬菌 体。（9)用三乙基胺（100毫摩尔）将与前白蛋白PA特异性结合的噬菌体解离下，并感染 处于对数期生长的大肠杆菌TG1，产生并纯化噬菌体用于下一轮的筛选，相同筛选过程重复 6轮。在不断地筛选的过程中，阳性的克隆将不断的被富集，从而达到了利用噬菌体展示技 术筛取阳性克隆的目的。该实验的原理模式图如图5所示。
[0019] 实施例3 :用噬菌体的酶联免疫方法（ELISA)筛选特异性单个阳性克隆： (1)从上述6轮筛选后含有噬菌体的细胞培养皿中，挑选96个单个菌落并接种于含有 100微克氨苄青霉素每毫升的TB培养基（1升TB培养基中含有2. 3克磷酸二氢钾，12. 52克 磷酸氢二钾，12克蛋白胨，24克酵母提取物，4毫升甘油）中，生长至对数期后，加入终浓度 为1毫摩尔的IPTG，28°C培养过夜。（2)利用渗透法获得粗提抗体，并将抗体转移到经抗原 包被的ELISA板中，在室温下放置1小时。（3)用PBST洗去未结合的抗体，加入一抗mouse anti-HA tag antibody (鼠抗HA抗体，购自北京康为世纪生物科技有限公司），在室温下放 置1小时。
[0020] (4)用 PBST 洗去未结合的抗体，加入 anti-mouse alkaline phosphatase conjugate (山羊抗小鼠碱性磷酸酶标记抗体，购自艾美捷科技有限公司），在室温下放置1 小时。（5)用PBST洗去未结合的抗体，加入碱性磷酸酶显色液，于ELISA仪上，在405 nm波 长读取吸收值。（6)当样品孔0D值大于对照孔0D值2倍以上时，判为阳性克隆孔。（7)将 阳性克隆接种至5毫升含100微克氨苄青霉素每毫升的LB液体中以便提取质粒并进行测 序。 根据序列比对软件Vector NTI分析各个克隆株的基因序列，把⑶R1，⑶R2,⑶R3序列 相同的株视为同一克隆株，而其序列不同的株视为不同克隆株，最终共有1株抗体。其抗 体的氨基酸序列为SEQ ID NO :13、14和20所示的FR1-CDR1-FR2-CDR2- FR3区、FR4区和 CDR3区，构成整个VHH。
[0021] 实施例4 :纳米抗体在宿主菌大肠杆菌中表达、纯化： (1)将前面测序分析所获得不同克隆株的质粒电转化到大肠杆菌WK6中，并将其涂布 在含有100微克每毫升氨苄青霉素和2%葡萄糖LB固体培养基的板上，37°C过夜，（2)挑选 单个菌落接种在15毫升含有氨苄青霉素的LB培养液中，37°C摇床培养过夜，（3)接种1毫 升的过夜菌种至330毫升TB培养基中，37°C摇床培养，培养到0D值达到0.6-1. 0时，加入 IPTG，28°C摇床培养过夜，（4)第二天，离心收菌，（5)将菌体利用渗透法使菌体蛋白释放出 来以获得抗体粗提液，（6)经镍柱亲和层析纯化抗体蛋白，为获得高纯度的抗体，采用咪唑 梯度洗脱法，低浓度咪唑洗脱液（50毫摩尔，100毫摩尔）用于洗去杂带，高浓度咪唑洗脱液 (250毫摩尔，500毫摩尔)最终可制备纯度达85%以上的蛋白。图6是表达的针对前白蛋白 PA的纳米抗体，经镍柱亲和层析纯化后的SDS-PAGE的电泳图；其中泳道1是含50毫摩尔 咪唑洗脱液所洗脱的样品，泳道2是含100毫摩尔咪唑洗脱液所洗脱的样品，泳道3是250 毫摩尔咪唑洗脱液所洗脱的样品，泳道4是500毫摩尔咪唑洗脱液所洗脱的样品。
[0022] 实施例5 :筛选获得的如白蛋白PA纳米抗体对如白蛋白PA的检测： (1)将前白蛋白PA稀释成不同浓度(微克/毫升）：100，50，20，10，5，1，0.5， 0.1，0.05，0, 01，0.005，0. 001，包被在NUNC酶标板上，4°C放置过夜，同时设立负对照。 (2)用PBST洗去未结合的抗体，加入前白蛋白PA纳米抗体（10微克/毫升)，室温孵育1小 时。（3)用PBST洗去未结合的抗体，加入一抗mouse anti-HA tag antibody (鼠抗HA抗 体，购自北京康为世纪生物科技有限公司），在室温下放置1小时。（4)用PBST洗去未结合 的抗体，加入anti-mouse alkaline phosphatase conjugate(山羊抗小鼠碱性磷酸酶标记 抗体，购自艾美捷科技有限公司），在室温下放置1小时。（5)用PBST洗去未结合的抗体，力口 入碱性磷酸酶显色液，于ELISA仪上，在405 nm波长读取吸收值。（6)计算每个前白蛋白 PA浓度的实验组读值与对照组读值的比值，进行3个独立的实验重复，统计误差，绘制成柱 状图，如图7所示。
[0023] 以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术 人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本 发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变 化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其 等效物界定。
【权利要求】
1. 一种合成的噬菌体展示纳米抗体文库，其特征在于，该文库包括纳米抗体保守框架 cAbBCIIlO的FR1区至FR3区对应的整段DNA序列、FR4区对应的DNA序列、以及利用三碱 基密码子使CDR3区含16个氨基酸且氨基酸随机任意排布但排除半胱氨酸及终止密码子的 相应的DNA序列，采用重叠延伸PCR获得包含上述序列的DNA片段，并将该DNA片段与噬菌 粒载体重组构建重组质粒转化大肠杆菌从而构建成噬菌体展示纳米抗体文库。
2. -种基于权利要求1所述噬菌体展示纳米抗体文库筛选出的前白蛋白纳米抗体，其 特征在于该前白蛋白纳米抗体的VHH链包括框架区FR和互补决定区CDR，所述框架区FR 包括FR1、FR2、FR3、FR4的氨基酸序列，其氨基酸序列分别为SEQIDN0:1所示FR1，SEQID N0:2所示FR2，SEQIDN0:3所示的FR3，SEQIDN0:4所示的FR4 ;所述互补决定区CDR包 括CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列，其氨基酸序列分别为SEQIDN0:5所示的CDR1，SEQID N0:6所示的CDR2，以及SEQIDN0:7或SEQIDN0:8或SEQIDN0:9或SEQIDN0:10或 SEQIDN0:11或SEQIDN0:12所示的CDR3。
3. 根据权利要求2所述的前白蛋白纳米抗体，其特征在于所述前白蛋白纳米抗体的 VHH链具有以下任意一组氨基酸序列：SEQ ID N0:13、SEQ ID N0:4和SEQ ID N0:7所示 氨基酸序列；或SEQ ID N0:13、SEQ ID N0:4和SEQ ID N0:8所示氨基酸序列；或SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO:4 和 SEQ ID NO:9 所示氨基酸序列；或 SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO:4 和 SEQ ID N0:10 所示氨基酸序列；或 SEQ ID N0:13、SEQ ID N0:4 和 SEQ ID N0:11 所示氨基 酸序列；或SEQ ID NO: 13、SEQ ID N0:4和SEQ ID NO: 12所示氨基酸序列。
4. 一种DNA分子，其特征在于，它编码权利要求2或权利要求3所述的前白蛋白纳米抗 体的VHH链。
5. 根据权利要求4所述的DNA分子，其特征在于，它具有以下任意一组核苷酸序列：SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15 和SEQ ID NO: 16所示核苷酸序列；或SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15 和 SEQ ID NO: 17 所示核苷酸序列；或 SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15 和 SEQ ID NO: 18 所示 核苷酸序列；或SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15和SEQ ID NO: 19所示核苷酸序列；或SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO:15 和 SEQ ID NO:20 所示核苷酸序列；或 SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO:15 和SEQ ID N0:21所示核苷酸序列。
6. -种表达载体，其特征在于，它包含权利要求4所述DNA分子的核苷酸序列。
7. -种宿主细胞，其特征在于，它可以表达上述前白蛋白的纳米抗体。
8. 权利要求2或3所述的前白蛋白纳米抗体在检测前白蛋白方面的用途。
【文档编号】C07K16/18GK104233474SQ201410476943
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年9月17日 优先权日:2014年9月17日
【发明者】万亚坤, 严俊荣, 孙燕燕 申请人:东南大学