在人中具有降低的免疫原性的抗体的制作方法
【专利摘要】本发明涉及在人中具有降低的免疫原性的抗体。本发明涉及工程化抗体，当施用于人时，该工程化抗体在人中表现出低水平的免疫原性。本公开还涉及用于产生抗体的方法。工程化抗体可以源自例如非人(例如鼠)供体抗体、或源自嵌合的或人源化的抗体，当长期施用于人时，所述抗体已知、预测或预期在人中引起中和性抗-抗体反应。
【专利说明】在人中具有降低的免疫原性的抗体
[0001] 相关申请 本申请是国际申请日为2011年4月29日的国际申请PCT/US2011/034598进入中国、 申请号为201180031672. 3的题为"在人中具有降低的免疫原性的抗体"的发明专利申请的 分案申请。本申请要求2010年4月30日提交的美国临时申请号61/330,261的权益。上 述引用的申请的全部教导都在此处引入作为参考。
[0002] 序列表 本申请包含已经通过EFS-Web提交的序列表，该序列表在此处被完整地引入作为参 考。所述ASCII拷贝在2011年4月29日生成，名为ALXN155W.txt，大小为29, 908字节。
【技术领域】
[0003] 本发明的领域是医学、免疫学、分子生物学和蛋白质化学。
[0004] 背景抟术 将啮齿动物抗体（例如，小鼠、大鼠或兔）施用于人通常导致人中抗啮齿动物免疫球 蛋白抗体的产生。抗啮齿动物抗体可以中和治疗性抗体的任何可能的治疗作用。对于施 用于人的其它类型的非人抗体（例如，猿类抗体），发生同样的过程。为了克服这个问题， 可以将非人抗体再工程化（re-engineered)为，例如，嵌合人抗体或CDR-嫁接（grafted) 的人抗体。在人嵌合抗体中，可变区是非人来源的（例如，小鼠来源），恒定区是人来源的。 通常被称为人源化抗体的CDR-嫁接的抗体的产生是更复杂的过程，其中，用非人供体抗体 的⑶R替换完全人受体抗体的⑶R。然而，对于这些再工程化抗体变体中的每一种，仍然 报道了人抗人抗体（HAHA)反应。例如，Welt 等.[(2003) Gflcer Tfest 1338-1346] 描述了人源化的抗-A33抗体，当施用于人结肠癌患者时，在73%的患者中引起了 HAHA反 应。在另一个例子中，已经显示，嵌合的抗-TNF抗体Remicade? (Johnson & Johnson)在 单一治疗的最高达53%的类风湿关节炎患者中和当与甲氨喋呤联合治疗的高达15%的患 者中引起了 HAHA 反应。（见，例如，Aarden 等.（2008) Ci/rr φ?/7 Lmuno 12。: 431-435。) 发现高达26%的强直性脊柱炎患者在重复施用药物后产生针对Remicade?的抗体。 Anderson [(2005) Semin Arthritis热<?腫迟:19-22]报道，在接受完全人源化抗体阿达 木单抗（adalimumab，HUMIRA?)的患者中，人抗阿达木单抗抗体的发生率约为6%。如同 Remicade?，当阿达木单抗与甲氨碟呤联合施用时，观察到了针对阿达木单抗的较低发生率 的HAHA反应（见Aarden等（2008)，同上）。然而，Aarden等发现，近20%的针对阿达木单 抗的HAHA反应是中和的。因此，对于人源化治疗性抗体以降低人类患者中的免疫原性、尤 其对于要长期施用的治疗性抗体的改进的方法显然仍然有需要。
[0005]
【发明内容】
本公开至少部分基于发明人的发现，即人源化抗-C5抗体依库丽单抗（eculizumab)在 人中表现出非常低水平的免疫原性。正如随附的工作实施例中所详述的，在数年期间，超 过130个治疗剂量的依库丽单抗施用于患有阵发性睡眠性血红蛋白尿（PNH)的个体患者。 患者没有同时施用免疫抑制剂如甲氨喋呤。从患者获得血液样品，并分析以确定样品是否 包含结合于依库丽单抗的抗体。这种抗体的存在表明针对依库丽单抗的人抗-人抗体反 应。结果发现，仅有1.2%的患者（2/161)具有低、但可检测水平的结合于依库丽单抗的抗 体。然而，进一步的分析验证了两份血液样品都不包含能够中和依库丽单抗的治疗作用的 抗体。因此，发明人推测，可以将依库丽单抗用作产生额外的治疗性抗体的支架，该额外的 治疗性抗体在人中也表现出低水平的免疫原性。因此，本公开的特征在于工程化的抗体，其 包含嫁接于免疫原性降低的受体抗体支架上的供体抗体的CDR，与供体抗体在人中的免疫 原性相比，其在人中的免疫原性更低。工程化的抗体可以源自已知、预测或预期在人中，尤 其当它们长期施用时，引起中和性抗-抗体反应的供体抗体。如此处所述，供体抗体可以 是，例如，非人抗体（例如，啮齿动物抗体或非人类灵长类抗体）或者被发现产生人抗-人 抗体（HAHA)反应（例如，在人中中和供体抗体的治疗作用的HAHA反应）的人源化的或完 全的人抗体。供体抗体和/或获得的工程化抗体可以是用于治疗或诊断人受试者中任何各 种疾病的抗体，所述疾病包括但不限于，癌症、感染、代谢紊乱、炎症状况、自身免疫性疾病、 神经病症、血液病症和心血管病症。
[0006] 正如工作实施例中所讨论的，依库丽单抗是人源化的抗体，其具有一组源自 1.23 Ig轻链分子的轻链框架区域和一组源自H20C3 Ig重链分子的重链框架区域。Weng 等.（1992) / J遞149 (7) :2518-2529提供了 H20C3重链多肽的氨基酸序列，该序列也 可根据NCBI登录号AAA52985获得。编码H20C3的核酸序列与对应的人种系重链免疫球 蛋白基因约 98%相似。Klein 等·（1993)及/r / J遞23 (12) : 3248-3262 部分描沭了 I. 23轻链多肽的氨基酸序列，其完整序列也可根据NCBI登录号CAA51145. 1而公开获得。 1.23编码序列源自人种系Vk和Jk基因，但是在第38位包含来自种系序列的单一氨基 酸改变。因此，来自依库丽单抗的框架区（依库丽单抗的轻链或重链可变区），I. 23和/或 H20C3可用于产生在人中表现出低水平免疫原性的工程化抗体。工作实施例描述了额外的 功能性的人源化抗体的构建，该抗体包括来自依库丽单抗的轻链框架区1-3和重链框架区 1-3。在一些实施方案中，一个或多个但不是所有的依库丽单抗的⑶R，1.23和/或H20C3 也可用于产生工程化抗体。
[0007] 在一个方面，本公开的特征在于多肽（例如，轻链多肽），其包含下列顺序的氨基 酸序列区段：LFR1-LCDR1-LFR2-LCDR2-LFR3-LCDR3-LFR4。从具有 SEQ ID N0:2 或 SEQ ID N0:8所述的氨基酸序列的轻链可变区获得一个或多个轻链框架区LFRULFR2和LFR3,从供 体抗体获得一个或多个轻链互补决定区IXDRl、IXDR2和IXDR3,条件是该多肽不包含SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:8所述的完整氨基酸序列。在一些实施方案中，可以从具有SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:8所述的氨基酸序列的轻链可变区获得LFR4。
[0008] 在一些实施方案中，可以从具有SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:8所述的氨基酸序列 的轻链可变区获得一个⑶R。在一些实施方案中，可以从具有SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:8 所述的氨基酸序列的轻链可变区获得两个CDR。在一些实施方案中，至少两个CDR可以来自 同样的供体抗体。在一些实施方案中，所有的CDR可以来自同样的供体抗体。
[0009] 在一些实施方案中，根据Kabat定义框架区和⑶R。在一些实施方案中，根据 Chothia定义框架区和⑶R。在一些实施方案中，根据组合的Kabat-Chothia定义来定义框 架区和⑶R。
[0010] 在一些实施方案中，LFRl包含或组成为SEQ ID NO:9所述的氨基酸序列。在一些 实施方案中，LFR2包含或组成为SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 18所述的氨基酸序列。在一 些实施方案中，LFR3包含或组成为SEQ ID NO: 11所述的氨基酸序列。在一些实施方案中， LFR4包含或组成为SEQ ID NO: 12所述的氨基酸序列。
[0011] 在一些实施方案中，LFRl包含或组成为SEQ ID NO:9所述的氨基酸序列；LFR2包 含或组成为SEQ ID NO: 10所述的氨基酸序列；LFR3包含或组成为SEQ ID NO: 11所述的氨 基酸序列；以及LFR4包含或组成为SEQ ID NO: 12所述的氨基酸序列。
[0012] 在一些实施方案中，LFRl包含或组成为SEQ ID NO:9所述的氨基酸序列；LFR2包 含或组成为SEQ ID NO: 18所述的氨基酸序列；LFR3包含或组成为SEQ ID NO: 11所述的氨 基酸序列；以及LFR4包含或组成为SEQ ID NO: 12所述的氨基酸序列。
[0013] 在一些实施方案中，LFRl包含或组成为SEQ ID NO: 20或SEQ ID NO: 24所述的氨 基酸序列。在一些实施方案中，LFR2包含或组成为SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:25所述的 氨基酸序列。在一些实施方案中，LFR3包含或组成为SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:26所述 的氨基酸序列。在一些实施方案中，LFR4包含或组成为SEQ ID N0:23所述的氨基酸序列。
[0014] 在一些实施方案中，LFRl包含或组成为SEQ ID NO: 20所述的氨基酸序列；LFR2包 含或组成为SEQ ID NO: 21所述的氨基酸序列；LFR3包含或组成为SEQ ID NO: 22所述的氨 基酸序列；以及LFR4包含或组成为SEQ ID NO: 23所述的氨基酸序列。
[0015] 在一些实施方案中，LFRl包含或组成为SEQ ID NO: 24所述的氨基酸序列；LFR2包 含或组成为SEQ ID NO: 25所述的氨基酸序列；LFR3包含或组成为SEQ ID NO: 26所述的氨 基酸序列；以及LFR4包含或组成为SEQ ID NO: 23所述的氨基酸序列。
[0016] 在一些实施方案中，多肽（例如，轻链多肽）包含全部或部分的免疫球蛋白轻链多 肽恒定区，例如多肽可以包含SEQ ID N0:3所述的氨基酸序列。在一些实施方案中，轻链多 肽恒定区包含人氨基酸序列。在一些实施方案中，轻链恒定区是λ轻链恒定区或 K轻链 恒定区。
[0017] 在另一个方面，本公开的特征在于多肽（例如，重链多肽），其包含或组成为下列 顺序的氨基酸序列区段：HFR1-HCDR1-HFR2-HCDR2-HFR3-HCDR3-HFR4。可以从具有SEQ ID N0:5或SEQIDN0:7所述的氨基酸序列的重链可变区获得重链框架区HFR1、HFR2和HFR3 中的一个或多个，从供体抗体获得重链互补决定区HCDRl、HCDR2和HCDR3中的一个或多个， 条件是该多肽不包含SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 7所述的完整氨基酸序列。在一些实施方 案中，可以从具有SEQ ID N0:5或SEQ ID N0:7所述的氨基酸序列的重链可变区获得LFR4。
[0018] 在一些实施方案中，可以从具有SEQ ID N0:5或SEQ ID N0:7所述的氨基酸序列 的重链可变区获得一个⑶R。在一些实施方案中，可以从具有SEQ ID N0:5或SEQ ID N0:7 所述的氨基酸序列的重链可变区获得两个⑶R。在一些实施方案中，至少两个⑶R可以来自 同样的供体抗体。在一些实施方案中，所有的CDR可以来自同样的供体抗体。
[0019] 在一些实施方案中，根据Kabat定义框架区和⑶R。在一些实施方案中，根据 Chothia定义框架区和⑶R。在一些实施方案中，根据组合的Kabat-Chothia定义来定义框 架区和⑶R。
[0020] 在一些实施方案中，HFRl包含或组成为SEQ ID NO: 13、17或19中任一个所述的 氨基酸序列。在一些实施方案中，HFR2包含或组成为SEQ ID NO: 14所述的氨基酸序列。在 一些实施方案中，HFR3包含或组成为SEQ ID NO: 15所述的氨基酸序列。在一些实施方案 中，HFR4包含或组成为SEQ ID NO: 16所述的氨基酸序列。
[0021] 在一些实施方案中，HFRl包含或组成为SEQ ID NO: 13所述的氨基酸序列；HFR2包 含或组成为SEQ ID NO: 14所述的氨基酸序列；HFR3包含或组成为SEQ ID NO: 15所述的氨 基酸序列；以及HFR4包含或组成为SEQ ID NO: 16所述的氨基酸序列。
[0022] 在一些实施方案中，HFRl包含或组成为SEQ ID NO: 17所述的氨基酸序列；HFR2包 含或组成为SEQ ID NO: 14所述的氨基酸序列；HFR3包含或组成为SEQ ID NO: 15所述的氨 基酸序列；以及HFR4包含或组成为SEQ ID NO: 16所述的氨基酸序列。
[0023] 在一些实施方案中，HFRl包含或组成为SEQ ID NO: 19所述的氨基酸序列；HFR2包 含或组成为SEQ ID NO: 14所述的氨基酸序列；HFR3包含或组成为SEQ ID NO: 15所述的氨 基酸序列；以及HFR4包含或组成为SEQ ID NO: 16所述的氨基酸序列。
[0024] 在一些实施方案中，HFRl包含或组成为SEQ ID NO: 17所述的氨基酸序列。在一些 实施方案中，HFR2包含或组成为SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:30所述的氨基酸序列。在一 些实施方案中，HFR3包含或组成为SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:31所述的氨基酸序列。在 一些实施方案中，HFR4包含或组成为SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:32所述的氨基酸序列。
[0025] 在一些实施方案中，HFRl包含或组成为SEQ ID NO: 17所述的氨基酸序列；HFR2包 含或组成为SEQ ID NO: 27所述的氨基酸序列；HFR3包含或组成为SEQ ID NO: 28所述的氨 基酸序列；以及HFR4包含或组成为SEQ ID NO: 29所述的氨基酸序列。
[0026] 在一些实施方案中，HFRl包含或组成为SEQ ID NO: 17所述的氨基酸序列；HFR2包 含或组成为SEQ ID NO: 30所述的氨基酸序列；HFR3包含或组成为SEQ ID NO: 31所述的氨 基酸序列；以及HFR4包含或组成为SEQ ID NO: 32所述的氨基酸序列。
[0027] 在一些实施方案中，多肽（例如，重链多肽）包含全部或部分的免疫球蛋白重链多 肽恒定区，例如多肽可以包含SEQ ID N0:6所述的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽 (例如，重链多肽）可以包含免疫球蛋白分子的Fc部分。在一些实施方案中，免疫球蛋白重 链多肽恒定区是IgG、IgA、IgE、IgD或IgM重链多肽恒定区。
[0028] 在另一个方面，本公开的特征在于工程化抗体，其包含：（i)轻链多肽和（ii)重链 多肽，其中所述轻链多肽包含下列顺序的氨基酸序列区段：LFR1-LCDR1-LFR2-LCDR2-LFR3-LCDR3-LFR4,其中从具有SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:8所述的氨基酸序列的轻链可变区获 得轻链框架区LFR1、LFR2和LFR3,其中从供体抗体获得轻链互补决定区IXDR1、IXDR2和 IXDR3中的一个或多个，条件是该轻链多肽不包含SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 8所述的完 整氨基酸序列。重链多肽包含下列顺序的氨基酸序列区段：HFR1-HCDR1-HFR2-HCDR2-HFR3 -HCDR3-HFR4,其中可以从具有SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 7所述的氨基酸序列的重链可变 区获得重链框架区HFR1、HFR2和HFR3,其中从供体抗体获得重链互补决定区HCDR1、HCDR2 和HCDR3中的一个或多个，条件是该重链多肽不包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7所述的 完整氨基酸序列。
[0029] 在一些实施方案中，根据Kabat定义来定义轻链框架区、重链框架区、轻链⑶R和 重链⑶R。在一些实施方案中，根据Chothia定义来定义轻链框架区、重链框架区、轻链⑶R 和重链⑶R。在一些实施方案中，根据组合的Kabat-Chothia定义来定义轻链框架区、重链 框架区、轻链⑶R和重链⑶R。
[0030] 在一些实施方案中，LFRl包含SEQ ID NO:9所述的氨基酸序列；LFR2包含SEQ ID NO: 10所述的氨基酸序列；LFR3包含SEQ ID NO: 11所述的氨基酸序列；LFR4包含SEQ ID NO: 12所述的氨基酸序列，HFRl包含SEQ ID NO: 13所述的氨基酸序列；HFR2包含SEQ ID NO: 14所述的氨基酸序列；HFR3包含SEQ ID NO: 15所述的氨基酸序列；以及HFR4包含SEQ ID NO: 16所述的氨基酸序列。
[0031] 在一些实施方案中，LFRl包含SEQ ID NO:9所述的氨基酸序列；LFR2包含SEQ ID NO: 18所述的氨基酸序列；LFR3包含SEQ ID NO: 11所述的氨基酸序列；LFR4包含SEQ ID NO: 12所述的氨基酸序列，HFRl包含SEQ ID NO: 19所述的氨基酸序列；HFR2包含SEQ ID NO: 14所述的氨基酸序列；HFR3包含SEQ ID NO: 15所述的氨基酸序列；以及HFR4包含SEQ ID NO: 16所述的氨基酸序列。
[0032] 在一些实施方案中，LFRl包含SEQ ID NO:9所述的氨基酸序列；LFR2包含SEQ ID NO: 18所述的氨基酸序列；LFR3包含SEQ ID NO: 11所述的氨基酸序列；LFR4包含SEQ ID NO: 12所述的氨基酸序列，HFRl包含SEQ ID NO: 13所述的氨基酸序列；HFR2包含SEQ ID NO: 14所述的氨基酸序列；HFR3包含SEQ ID NO: 15所述的氨基酸序列；以及HFR4包含SEQ ID NO: 16所述的氨基酸序列。
[0033] 在一些实施方案中，LFRl包含SEQ ID NO:9所述的氨基酸序列；LFR2包含SEQ ID NO: 10所述的氨基酸序列；LFR3包含SEQ ID NO: 11所述的氨基酸序列；LFR4包含SEQ ID NO: 12所述的氨基酸序列，HFRl包含SEQ ID NO: 19所述的氨基酸序列；HFR2包含SEQ ID NO: 14所述的氨基酸序列；HFR3包含SEQ ID NO: 15所述的氨基酸序列；以及HFR4包含SEQ ID NO: 16所述的氨基酸序列。
[0034] 在一些实施方案中，LFRl包含SEQ ID NO:9所述的氨基酸序列；LFR2包含SEQ ID NO: 10所述的氨基酸序列；LFR3包含SEQ ID NO: 11所述的氨基酸序列；LFR4包含SEQ ID NO: 12所述的氨基酸序列，HFRl包含SEQ ID NO: 17所述的氨基酸序列；HFR2包含SEQ ID NO: 14所述的氨基酸序列；HFR3包含SEQ ID NO: 15所述的氨基酸序列；以及HFR4包含SEQ ID NO: 16所述的氨基酸序列。
[0035] 在一些实施方案中，LFRl包含SEQ ID NO:9所述的氨基酸序列；LFR2包含SEQ ID NO: 18所述的氨基酸序列；LFR3包含SEQ ID NO: 11所述的氨基酸序列；LFR4包含SEQ ID NO: 12所述的氨基酸序列，HFRl包含SEQ ID NO: 17所述的氨基酸序列；HFR2包含SEQ ID NO: 14所述的氨基酸序列；HFR3包含SEQ ID NO: 15所述的氨基酸序列；以及HFR4包含SEQ ID NO: 16所述的氨基酸序列。
[0036] 在一些实施方案中，LFRl包含SEQ ID N0:20所述的氨基酸序列；LFR2包含SEQ ID NO: 21所述的氨基酸序列；LFR3包含SEQ ID NO: 22所述的氨基酸序列；LFR4包含SEQ ID N0:23所述的氨基酸序列，HFRl包含SEQ ID NO: 17所述的氨基酸序列；HFR2包含SEQ ID NO: 27所述的氨基酸序列；HFR3包含SEQ ID NO: 28所述的氨基酸序列；以及HFR4包含SEQ ID NO:29所述的氨基酸序列。
[0037] 在一些实施方案中，LFRl包含SEQ ID N0:20所述的氨基酸序列；LFR2包含SEQ ID NO:21所述的氨基酸序列；LFR3包含SEQ ID NO:22所述的氨基酸序列；LFR4包含SEQ ID N0:23所述的氨基酸序列，HFRl包含SEQ ID NO: 17所述的氨基酸序列；HFR2包含SEQ ID NO: 30所述的氨基酸序列；HFR3包含SEQ ID NO: 31所述的氨基酸序列；以及HFR4包含SEQ ID NO:32所述的氨基酸序列。
[0038] 在一些实施方案中，LFRl包含SEQ ID N0:24所述的氨基酸序列；LFR2包含SEQ ID NO: 25所述的氨基酸序列；LFR3包含SEQ ID NO: 26所述的氨基酸序列；LFR4包含SEQ ID N0:23所述的氨基酸序列，HFRl包含SEQ ID NO: 17所述的氨基酸序列；HFR2包含SEQ ID NO: 27所述的氨基酸序列；HFR3包含SEQ ID NO: 28所述的氨基酸序列；以及HFR4包含SEQ ID NO:29所述的氨基酸序列。
[0039] 在一些实施方案中，LFRl包含SEQ ID N0:24所述的氨基酸序列；LFR2包含SEQ ID NO: 25所述的氨基酸序列；LFR3包含SEQ ID NO: 26所述的氨基酸序列；LFR4包含SEQ ID N0:23所述的氨基酸序列，HFRl包含SEQ ID NO: 17所述的氨基酸序列；HFR2包含SEQ ID NO: 30所述的氨基酸序列；HFR3包含SEQ ID NO: 31所述的氨基酸序列；以及HFR4包含SEQ ID NO:32所述的氨基酸序列。
[0040] 在一些实施方案中，工程化抗体包含表5中所述的配对的一组重链框架区和轻链 框架区。
[0041] 在一些实施方案中，工程化抗体可以是，例如，抗体片段，例如，选自Fd片段、Fab 片段、Fab'片段和F(ab'）2片段的抗体片段。
[0042] 在此处所述的任一工程化抗体的一些实施方案中，重链多肽和轻链多肽可以彼此 共价结合。
[0043] 在一些实施方案中，工程化抗体结合于补体组分蛋白。补体组分蛋白可以是选自 Clq、Clr、Cls、C4、C4a、C4b、C3、C3a、C3b、C2、C2a、C2b、C5、C5a、C5b、C6、C7、C8、C9、备解 素、补体因子〇、补体因子8、]\^1^、嫩5?1、嫩5?2和嫩5?3的一种。
[0044] 在一些实施方案中，工程化抗体结合细胞表面受体，例如，G蛋白偶联受体、趋化因 子受体、细胞因子受体或受体酪氨酸激酶。
[0045] 在一些实施方案中，工程化抗体结合于：（i)死亡受体或（ii)死亡受体的配体。在 一些实施方案中，工程化抗体结合生长因子、趋化因子或细胞因子。在一些实施方案中，工 程化抗体结合免疫球蛋白分子，例如，IgE分子。
[0046] 在又一个方面中，本公开的特征在于核酸，其编码：（i)任意一种此处所述的多肽 (例如，轻链多肽或重链多肽），或（ii)任意此处所述的工程化抗体。其特征还在于包含该 核酸的载体。载体可以是表达载体。此外，本公开的特征在于，包含所述核酸或载体的细胞。 在另一个方面中，本公开的特征在于用于产生多肽或工程化抗体的方法。该方法包括在适 合允许上述包含载体的细胞表达由载体中包含的核酸编码的多肽或工程化抗体的条件下 培养所述细胞。该方法还包括从培养的细胞或其中培养细胞的培养基中分离多肽或工程化 抗体。其特征还在于通过上述方法产生的分离的多肽或分离的工程化抗体。
[0047] 在另一个方面，本公开的特征在于用于产生工程化的轻链抗体可变区的方法，与 供体轻链可变区的免疫原性相比，该抗体轻链抗体可变区在人中免疫原性更低。该方法包 括：提供信息，该信息包括：（i)包含SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:8所述的氨基酸序列的受 体轻链抗体可变区氨基酸序列或（ii)编码受体轻链抗体可变区氨基酸序列的核酸序列； 提供信息，该信息包括至少一种供体抗体轻链可变区氨基酸序列或（iv)编码供体 抗体轻链可变区氨基酸序列的核酸序列；以来自供体抗体轻链可变区的一个或多个CDR替 换受体轻链抗体可变区的一个或多个CDR，从而产生工程化的轻链抗体可变区，与供体抗体 轻链可变区的免疫原性相比，该工程化的轻链抗体可变区在人中免疫原性更低，条件是该 工程化的轻链可变区不包含含有SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 8所述的完整氨基酸序列的轻 链多肽。该方法可以包括获得重链抗体可变区，或编码重链抗体可变区的核酸，该重链抗体 可变区与工程化的轻链抗体可变区互补，从而产生工程化抗体。
[0048] 在上述方法的一些实施方案中，使用定向选择获得重链抗体可变区。
[0049] 在上述方法的一些实施方案中，重链抗体可变区是工程化的重链抗体可变区。
[0050] 在上述方法的一些实施方案中，工程化的重链抗体可变区的产生包括：提供信息， 该信息包括：（i)包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7所述的氨基酸序列的受体重链抗体可 变区氨基酸序列或（ii)编码受体重链抗体可变区氨基酸序列的核酸序列；提供信息，该信 息包括至少一种供体抗体重链可变区氨基酸序列或（iv)编码供体抗体重链可变区 氨基酸序列的核酸序列；以来自供体抗体重链可变区的一个或多个CDR替换受体重链抗体 可变区的一个或多个CDR，从而产生工程化的重链抗体可变区，与供体抗体重链可变区的免 疫原性相比，该工程化的重链抗体可变区在人中免疫原性更低，条件是该工程化的抗体可 变区不包含含有SEQ ID N0:5或SEQ ID N0:7所述的完整氨基酸序列的重链多肽可变区。
[0051] 在另一个方面，本公开的特征在于用于产生工程化的重链抗体可变区的方法，与 供体重链可变区的免疫原性相比，该抗体重链抗体可变区在人中免疫原性更低。该方法包 括：提供信息，该信息包括：（i)包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7所述的氨基酸序列的受 体重链抗体可变区氨基酸序列或（ii)编码受体轻链抗体可变区氨基酸序列的核酸序列； 提供信息，该信息包括至少一种供体抗体重链可变区氨基酸序列或（iv)编码供体 抗体重链可变区氨基酸序列的核酸序列；以来自供体抗体重链可变区的一个或多个CDR替 换受体重链抗体可变区的一个或多个CDR，从而产生工程化的重链抗体可变区，与供体抗体 重链可变区的免疫原性相比，该工程化的重链抗体可变区在人中免疫原性更低，条件是该 工程化的重链可变区不包含含有SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 7所述的完整氨基酸序列的重 链多肽可变区。该方法可以包括获得与工程化的重链抗体可变区互补的轻链抗体可变区， 从而产生工程化抗体。
[0052] 在上述方法的一些实施方案中，使用定向选择获得工程化的轻链抗体可变区。
[0053] 在上述方法的一些实施方案中，轻链抗体可变区是工程化的轻链抗体可变区。
[0054] 在上述方法的一些实施方案中，工程化的轻链抗体可变区的产生包括：提供信息， 该信息包括：（i)包含SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:8所述的氨基酸序列的受体轻链抗体可 变区氨基酸序列或（ii)编码受体轻链抗体可变区氨基酸序列的核酸序列；提供信息，该信 息包括至少一种供体抗体轻链可变区氨基酸序列或（iv)编码供体抗体轻链可变区 氨基酸序列的核酸序列；以来自供体抗体轻链可变区的一个或多个CDR替换受体轻链抗体 可变区的一个或多个CDR，从而产生工程化的轻链可变区，与供体抗体轻链可变区的免疫原 性相比，该工程化的轻链可变区在人中免疫原性更低，条件是该工程化的轻链可变区不包 含含有SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:8所述的完整氨基酸序列的轻链多肽。
[0055] 在一些实施方案中，该方法包括产生工程化的抗体轻链可变区和/或工程化的抗 体重链可变区（在一些实施方案中，轻链和重链可变区可以包含此处所述的恒定区）。在一 些实施方案中，在细胞中或使用无细胞系统产生工程化的抗体轻链可变区。
[0056] 在一些实施方案中，该方法包括从细胞或其中培养细胞的培养基中分离工程化的 抗体轻链可变区和/或工程化的重链可变区。
[0057] 在一些实施方案中，该方法包括产生工程化抗体。可以在细胞中或使用无细胞系 统产生工程化的抗体。在一些实施方案中，该方法包括从细胞或其中培养细胞的培养基中 分离工程化抗体。
[0058] 在一些实施方案中，该方法包括确定工程化抗体是否结合与供体抗体相同的抗 原。在一些实施方案中，工程化抗体对于目标抗原可以具有与供体抗体对于相同抗原的亲 和力相比更大的亲和力。
[0059] 在一些实施方案中，该方法包括在工程化抗体施用于人后确定是否产生结合工程 化抗体的抗体。
[0060] 在一些实施方案中，该方法包括改造（reshaping)工程化抗体。在一些实施方案 中，改造包括取代框架区域的至少一个氨基酸。在一些实施方案中，改造包括取代框架区域 的至少两个氨基酸。在一些实施方案中，改造包括取代至少两个不同的框架区域中的至少 一个氨基酸。在一些实施方案中，改造不包括取代框架区域中的一个或多个氨基酸。
[0061] 在一些实施方案中，改造包括取代至少一个⑶R中的至少一个氨基酸。在一些实 施方案中，改造包括取代至少一个CDR中的至少两个氨基酸。在一些实施方案中，改造包 括取代⑶R的至少一个氨基酸位置，其中根据Kabat或组合的Kabat-Chothia定义来定义 CDR。
[0062] 在一些实施方案中，改造包括取代重链可变区的第28和30位（根据Kabat编号） 的一个或两个位置处的氨基酸。在一些实施方案中，改造包括取代至少两个不同的CDS中 的至少一个氨基酸。在一些实施方案中，改造包括取代重链可变区的第27、28、30、71或78 位（根据Kabat编号）处的至少一个氨基酸。
[0063] 在一些实施方案中，改造包括将至少一个间隔子氨基酸序列引入工程化抗体的轻 链可变区和重链可变区的一个或全部两个。
[0064] 在上述方法的一些实施方案中，框架或CDR的一个或多个氨基酸在替换之前被取 代。在一些实施方案中，框架或CDR的一个或多个氨基酸在替换之后被取代。
[0065] 在一些实施方案中，受体抗体轻链可变区包含此处所述的轻链多肽的任一个的氨 基酸序列。在一些实施方案中，受体抗体重链可变区氨基酸序列包含此处所述的重链多肽 的任一个的氨基酸序列。在上述方法的一些实施方案中，受体抗体轻链可变区氨基酸序列 包含此处所述的轻链多肽的任一个的氨基酸序列，受体抗体重链可变区氨基酸序列包含此 处所述的重链多肽的任一个的氨基酸序列。
[0066] 在另一个方面，本公开的特征在于工程化抗体，其包含（i)轻链多肽和（ii)重链 多肽，其中轻链多肽包含下列顺序的氨基酸序列区段：LFR1-LCDR1-LFR2-LCDR2-LFR3-LCDR 3-LFR4。在一些实施方案中，LFRl包含SEQ ID N0:9所述的氨基酸序列，但是具有0-3个氨 基酸取代；LFR2包含SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 18所述的氨基酸序列，但是具有0-3个 氨基酸取代；LFR3包含SEQ ID NO: 11所述的氨基酸序列，但是具有0-3个氨基酸取代；以 及LFR4包含SEQ ID NO: 12所述的氨基酸序列，但是具有0-3个氨基酸取代；IXDRl包含供 体抗体的轻链CDRl的氨基酸序列，LCDR2包含供体抗体的轻链CDR2的氨基酸序列，以及 IXDR3包含供体抗体的轻链⑶R3的氨基酸序列。轻链多肽不包含SEQ ID NO:2或SEQ ID N0:8所述的氨基酸序列。在一些实施方案中，重链多肽包含下列顺序的氨基酸序列区段：H FR1-HCDR1-HFR2-HCDR2-HFR3-HCDR3-HFR4,其中 HFRl 包含 SEQ ID NO: 13、17 或 19 所述的 氨基酸序列，但是具有0-3个氨基酸取代；HFR2包含SEQ ID NO: 14所述的氨基酸序列，但 是具有0-3个氨基酸取代；HFR3包含SEQ ID NO: 15所述的氨基酸序列，但是具有0-3个 氨基酸取代；以及HFR4包含SEQ ID NO: 16所述的氨基酸序列，但是具有0-3个氨基酸取 代；其中HCDRl包含来自供体抗体的重链⑶Rl的氨基酸序列，HCDR2包含来自供体抗体的 重链CDR2的氨基酸序列，HCDR3包含来自供体抗体的重链CDR3的氨基酸序列。重链多肽 不包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7所述的氨基酸序列。与一种或多种供体抗体相比，工 程化抗体在人中的免疫原性更低，工程化抗体结合与一种或多种供体抗体相同的抗原。
[0067] 在一些实施方案中，符合以下中的一个或两个：（a)IXDRl、IXDR2和IXDR3来自单 一的供体抗体，（b)HCDRl、HCDR2和HCDR3来自单一的供体抗体。在一些实施方案中，所有 轻链⑶R和重链⑶R来自相同的供体抗体。
[0068] 除非另有定义，此处所用的所有技术和科学术语和本公开所属领域普通技术人员 通常理解的含义具有相同含义。在冲突的情况下，以本文件、包括定义为准。下面描述了优 选的方法和材料，尽管与此处所述的那些相同或相等的方法或材料也可以用于本发明的方 法和组合物的操作或测试中。此处提到的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献被完 整地引入作为参考。
[0069] 本公开的其它特征和优势，例如，用于产生在人中具有降低的免疫原性的治疗性 抗体的方法从下列描述、实施例以及权利要求来看将是显而易见的。
[0070]
【专利附图】
【附图说明】 图1表示依库丽单抗（"Ecu"）的轻链可变区的氨基酸序列（SEQ ID N0:2)和I. 23免 疫球蛋白轻链可变区（"1.23"）的氨基酸序列（SEQ ID N0:8)的比对。三个互补决定区 (⑶R) - IXDR1、IXDR2和IXDR3(根据Kabat和Chothia)定义用括号表示。还标明轻链可 变区框架区域。在比对的序列的上面标明关于依库丽单抗序列的氨基酸位置（通过Kabat 编号定义）。
[0071] 图2表示依库丽单抗（"Ecu"）的重链可变区的氨基酸序列（SEQ ID N0:5)和 H20C3免疫球蛋白重链可变区（"H20C3"）的氨基酸序列（SEQ ID N0:7)的比对。三个互 补决定区（CDR) - HCDRl、HCDR2和HCDR3 (根据Kabat和Chothia定义）用括号表示。还 标明重链可变区框架区域。在比对的序列的上面标明关于依库丽单抗序列的氨基酸位置 (通过 Kabat 编号定义）。还具体标明 了位置 52a、82a、82b、82c、100a、100b、100c、IOOd 和 100e〇
[0072]
【具体实施方式】 本公开提供了工程化抗体，与该工程化抗体来源的各自的供体抗体的免疫原性相比， 该工程化抗体在人中表现出更低的免疫原性。虽然绝不旨在限制，下面详细说明示例性的 组合物以及用于它们的制备方法和用途。
[0073] 工稈化抗体 此处所用的"工程化抗体"是包含嫁接于受体抗体支架的可变区上的供体抗体的一个 或更多个（例如，两个、三个、四个、五个或六个）CDR，其中与人中供体抗体的免疫原性相 t匕，该工程化抗体在人中免疫原性更低。工程化抗体的结构如下。
[0074] 工程化抗体包含轻链多肽，该轻链多肽具有包含或组成为下列顺序的氨基酸区 段：LFR1-LCDR1-LFR2-LCDR2-LFR3-LCDR3-LFR4 的序列。LFRl 对应轻链可变区的框架 I(FRl)的氨基酸序列；LFR2对应轻链可变区的框架2 (FR2)的氨基酸序列；LFR3对应轻链 可变区的框架3 (FR3)的氨基酸序列；以及LFR4对应轻链可变区的框架4 (FR4)的氨基酸序 列。LCDRl对应轻链可变区的互补决定区I(CDRl)的氨基酸序列；LCDR2对应轻链可变区的 互补决定区2(CDR2)的氨基酸序列；LCDR3对应轻链可变区的互补决定区3(CDR3)的氨基 酸序列。工程化抗体的LFR1、LFR2、LFR3和LFR4氨基酸序列中的一个或多个（例如，一个、 两个、三个或所有四个）由受体抗体所提供。在一些实施方案中，仅仅LFRULFR2或LFR3 由受体抗体提供。在一些实施方案中，LFRl和LFR2由受体抗体提供。在一些实施方案中， LFR2和LFR3由受体抗体提供。在一些实施方案中，LFRl和LFR3由受体抗体提供。在一些 实施方案中，LFR4不是由受体抗体提供。IXDRUIXDR2和IXDR3氨基酸序列中的一个或更 多个由至少一种（例如，一种、两种或三种）供体抗体提供。例如，可以从单一的供体抗体 获得轻链CDR，或者，在一些实施方案中，可以从两种或更多种不同的供体抗体（例如，结合 相同的抗原但具有不同的轻链CDR序列的两种抗体）获得轻链CDR。在一些实施方案中，从 受体抗体获得至少一个（例如，一个、两个或者甚至所有三个）LCDR。例如，工程化抗体可以 具有来自供体抗体的LCDR3和来自受体抗体的LCDRl和LCDR2。在一些实施方案中，工程化 抗体可以具有来自供体抗体的LCDR2和来自受体抗体的LCDRl和LCDR3。此处详细描述了 合适的受体抗体和供体抗体。
[0075] 已经根据不同的方法不同地定义了⑶R和框架区的准确边界。在一些实 施方案中，可以如 Kabat 等· [(1991) "Sequences of Proteins of Immunological Interest.，'NIH Publication No. 91-3242，U. S. Department of Health and Human Services, Bethesda, MD]定义轻或重链可变结构域内的⑶R或框架区的位置。在这种情 况下，CDR可以被称为"Kabat CDR"（例如，"Kabat LCDR2"或"Kabat HCDR1"），框架区可 以被称为"Kabat框架区"（例如，"Kabat LFR1"或"Kabat HFR3"）。在一些实施方案中， 可以如Chothia等.（1989) 877-883定义轻或重链可变区的⑶R或框架区的位 置。因此，这些区域可以分别被称为"Chothia⑶R"（例如"Chothia IXDR2"或"Chothia HCDR3"）或"Chothia 框架区域"（例如，"Chothia LFR1" 或"Chothia LFR3"）。在一些实 施方案中，可以由Kabat-Chothia组合的定义来定义轻和重链可变区的⑶R或框架区的位 置。在这种实施方案中，这些区域可以分别被称为"组合的Kabat-Chothia⑶R"或"组合 的 Kabat-Chothia 框架区"。Thomas 等·[ (1996) #0/ Immuno!?>?> (17/18) : 1389-14011 例举 了根据Kabat和Chothia定义的⑶R和框架区边界的鉴定。图1和2中也显示了用上述三 种定义中的每一种鉴定⑶R和框架。
[0076] 在一些实施方案中，可以如 Honnegger 和 PlUckthun [ (2001) / ^iW309:657-670]定义具有轻或重链可变结构域的⑶R和/或框架区的位置。
[0077] 如此处所述以及工作实施例中所例举的，通过将鼠抗-C5抗体的IXDR嫁接到I. 23 Ig κ轻链分子的框架区支架上而产生依库丽单抗的轻链可变区。依库丽单抗的轻链可变 区的氨基酸序列如下：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCGASENIYGALNWYQQKPGKAPKLLIYGATNLADGV PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQNVLNTPLTFGQGTKVEIK(SEQIDN0:2)。I·23的轻链可 变区的氨基酸序列如下：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNYLNWYQRKPGKAPKLLIYAASSLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYNTPWTFGQGTKVEIK (SEQ ID N0:8)。依库丽单抗 的LFR2氨基酸序列与对应的I. 23 LFR2的氨基酸序列不同在于一个氨基酸：第38位的谷 氨酰胺代替了精氨酸。
[0078] 不被任何具体理论或作用机制所束缚，据信来自依库丽单抗或I. 23的轻链框架 区序列（即，LFR1、LFR2、LFR3和/或LFR4)可用于制备工程化抗体，与供体抗体的免疫原 性相比，该工程化抗体在人中表现出降低水平的免疫原性。因此，在一些实施方案中，LFRl、 LFR2、LFR3和/或LFR4可以是源自依库丽单抗和/或I. 23的对应的轻链框架区。由Kabat、 Chothia或Kabat-Chothia定义的用于依库丽单抗和L 23轻链框架区的氨基酸序列如表1 中所述。
【权利要求】
1. 抗体或其抗原结合部分，其结合人C5a，其中所述抗体包含： (a) 重链，所述重链包含（i)SEQ ID NO: 38所述的CDR1序列；（ii)SEQ ID NO: 44所 述的CDR2序列；和（iii) SEQ ID NO: 40所述的CDR3序列；和 (b) 轻链，所述轻链包含（i)SEQ ID NO: 34所述的CDR1序列；（ii)SEQ ID NO: 35所 述的CDR2序列；和（iii) SEQ ID NO: 36所述的CDR3序列。
2. 权利要求1的抗体或其抗原结合部分，其中： (a) 所述重链进一步包含（i)SEQ ID NO: 17所述的FR1序列；（ii)SEQ ID NO: 14所 述的FR2序列；SEQ ID NO: 15所述的FR3序列；和SEQ ID NO: 45所述的FR4序列； (b) 所述轻链进一步包含（i) SEQ ID NO: 9所述的FR1序列；（ii) SEQ ID NO: 10所 述的FR2序列；SEQ ID NO: 11所述的FR3序列；和SEQ ID NO: 42所述的FR4序列。
3. 权利要求1的抗体或其抗原结合部分，其中所述重链包含SEQ ID NO: 43所述的氨 基酸序列，且所述轻链包含SEQ ID NO: 41所述的氨基酸序列。
4. 权利要求1-3中任一项的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分 以至少109 M4的Ka结合人C5a。
5. 权利要求1-4中任一项的抗体，其中所述抗体的Fc部分选自IgGl、IgG2、IgG3、 IgG4、IgA、IgM、IgE 或 IgD。
6. 权利要求1-5中任一项的抗体，其中所述抗原结合片段选自单链抗体、单链Fv片段、 Fd片段、Fab片段、Fab'片段和F(ab'）2片段。
7. 权利要求1-6中任一项的抗体，其中所述重链包含G2/G4杂合恒定区。
8. 权利要求1-7中任一项的抗体，其中所述重链包含恒定区，所述恒定区包含SEQ ID NO: 6所述的氨基酸序列。
【文档编号】C07K16/18GK104402997SQ201410537722
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2011年4月29日 优先权日:2010年4月30日
【发明者】R.P.罗瑟, P.P.坦伯里尼 申请人:阿雷克森制药公司