抗桥梁分子1-s抗体的抗原蛋白及其兔多克隆抗体和用途
【专利摘要】本发明公开了一种抗桥梁分子1-s抗体的抗原蛋白及其兔多克隆抗体和用途，属于含有抗原或抗体的制药配制品。本发明的抗人桥梁分子1-s抗体的特异性抗原蛋白的序列为qpvaissapafgmggias。将抗人桥梁分子1-s抗体的特异性抗原免疫兔子得抗血清，乳化后得制备抗原溶液，注射成年兔后收集含抗体的血液，其上清液即抗血清，经过预冷的TBS缓冲溶液平衡抗原多肽的亲和柱，加入叠氮化钠、离心过滤去脂洗柱，纯化得到抗人桥梁分子1-s兔多克隆抗体。该多克隆抗体在细胞水平上和组织水平上的表达显著优于利用商品化在售的抗体所得效果。解决了目前在售商品抗人ITSN1-S抗体特异性差，效价比低的问题。
【专利说明】抗桥梁分子1-s抗体的抗原蛋白及其兔多克隆抗体和用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医药【技术领域】，具体是一种桥梁分子1-S抗体的抗原蛋白及其兔多克隆抗体和用途。
【背景技术】
[0002]桥梁分子1 (intersectinl或ITSN1)是在进化过程中高度保守的蛋白，在人体内有ITSN1-L和ITSN1-S两种剪切体。在中枢神经系统中，ITSN1-L主要分布在神经元中，而ITSN1-S主要在胶质细胞中表达。两种剪切体拥有多个共同的蛋白结构域。ITSN1-L蛋白与多种神经性退行性疾病相关，例如:先天愚型；阿尔茨海默病(AD)及亨廷顿氏舞蹈症等。先天愚型的发生与ITSN1-L调控的囊泡运输发生紊乱相关，而AD及亨廷顿氏舞蹈症的发生与ITSN1-L促进多聚谷氨酰胺的神经毒性相关。ITSN1-S能够通过其多种结构域参与胞吞，胞吐，细胞增殖等生理活动。
[0003]关于ITSN1-S的研究报道较少，目前在售的ITSN1-S抗体存在特异性差，效价比低的问题，难以应用于细胞水平和组织水平ITSN1-S蛋白质的检测。
[0004]多克隆抗体具有可以识别同一抗原的多个表位，在免疫检测中可以识别更多的抗原，不容易受抗原构象变化的影响等优点。因此在相同条件下，利用多克隆抗体可以提高检测的灵敏度，对一些丰度偏低的蛋白更容易检出。
[0005]
【发明内容】
本发明是为了解决目前在售的ITSN1-S抗体存在特异性差，效价比低，难以应用于细胞水平和组织水平ITSN1-S蛋白质检测的问题，而提供一种抗桥梁分子Ι-s抗体的抗原蛋白及其兔多克隆抗体和用途。
[0006]本发明是按照以下技术方案实现的。
[0007]—种抗桥梁分子Ι-s抗体的抗原蛋白，其特征在于:人源ITSN1-S的特异性抗原片段的氨基酸序列如序列表所示，其合成多肽的纯度大于或等于95%。
[0008]一种抗桥梁分子Ι-s抗体的抗原蛋白兔多克隆抗体，其特征在于:该多克隆抗体是应用人源ITSN1-S蛋白序列进行蛋白免疫片段，得到针对人源ITSN1-S的特异性抗原片段qpvaissapafgmggias,人工合成多肽,并免疫成年兔，获得抗血清，制备抗原溶液，收集上清液即为抗血清；最后应用抗原多肽对抗血清进行纯化而得；该抗体在一定程度的空间结构上识别人桥梁分子1-s，具有对人桥梁分子Ι-s的特异性识别功能。
[0009]一种抗桥梁分子Ι-s抗体的抗原蛋白兔多克隆抗体在制备检测抗人桥梁分子1-S蛋白表达制剂中的应用，用于特异性检测人桥梁分子Ι-s蛋白在细胞和组织中的表达。
[0010]这样设计的本发明其有益效果是，利用本发明所得抗ITSN1-S兔多克隆纯化抗体，具有对抗桥梁分子Ι-s的特异性识别功能，即在一定程度的空间结构上识别人桥梁分子1-S，因此能够特异性精确检测抗人桥梁分子1-S蛋白在细胞和组织中的表达。在细胞水平上和组织水平上的表达显著优于在售的商品化抗体所得效果，用于更加精确的反应细胞水平和组织水平ITSN1-S蛋白的表达水平。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1是本发明ELISA法进行抗体效价比的测定结果对照图；
图2是表达外源性人ITSN1-S蛋白的胶质母细胞瘤细胞株LN-229细胞水平ITSN1-S的检测图；
图3是在售商品化抗体检测表达外源性人ITSN1-S蛋白的胶质母细胞瘤细胞株LN-229中ITSN1-S蛋白的表达图；
图4是本发明检测人乳腺浸润性导管癌样本中ITSN1-S蛋白的表达情况200倍图；
图5是本发明检测人乳腺浸润性导管癌样本中ITSN1-S蛋白的表达情况400倍图；
图6是本发明检测人乳腺浸润性小叶癌样本中ITSN1-S蛋白的表达情况200倍图；
图7是本发明检测人乳腺浸润性小叶癌样本中ITSN1-S蛋白的表达情况400倍图；
图8是本发明检测人乳腺纤维腺瘤样本中ITSN1-S蛋白的表达情况200倍图；
图9是本发明检测人乳腺纤维腺瘤样本中ITSN1-S蛋白的表达情况400倍图。
【具体实施方式】
[0012]下面结合附图及实施例对本发明进行详细的说明。
[0013]一.实验材料:
人源恶性胶质母细胞瘤细胞株LN-229细胞株购自美国ATCC细胞库；
人乳腺癌瘤患者样本组织来源于在本单位乳腺外科实施肿瘤切除手术患者的病理石蜡切块；
抗原:应用人源ITSN1-S蛋白序列(NM_001001132)进行蛋白免疫片段的选取，得到针对人源ITSN1-S的特异性抗原片段，qpvaissapafgmggias,人工合成多肽，合成多肽的纯度大于或等于95%。
[0014]磷酸盐缓冲液(PBS):氯化钠8克，氯化钾0.2克，磷酸氢二纳3.63克，磷酸二氢钾
0.24克，溶于1升纯水，PH值7.4。
[0015]TBS 缓冲溶液:10mmol/L 的 Tris 含 0.9%NaCl，用 HC1 调 pH 至 7.4。
[0016]洗脱缓冲溶液:1.5%的甘氨酸溶液，用盐酸调节至PH1.9。
[0017]中和缓冲溶液:1M的Tris-HCl溶液，用浓盐酸调节PH值至9.0。
[0018]二.方法
1.抗桥梁分子1-s (ITSN1-S)抗体的抗原蛋白序列的设计:
应用人源ITSN1-S蛋白序列(NM_001001132)进行蛋白免疫片段的选取。利用ProteinBlast蛋白序列在线比较搜索工具。选取与ITSN1-S蛋白序列(NM_001001132)相似程度极高的几种变异体进行比对。利用“multalin”软件将查询序列与其各个变异体进行比对，找出特异序列，即免疫片段。将找出的特异序列再次进行“protein blast”，看该序列与数据库中其他相似序列之间是否具有特异性。根据以上操作，得到针对人源ITSN1-S的特异性抗原片段，qpvaissapafgmggias。
[0019]2.根据设计的免疫片段多肽序列，人工合成多肽。由上海吉尔多肽有限公司合成多肽。利用人工合成多肽的FM0C策略:利用Wang Resin树脂，合成保护氨基酸，然后利用缩合试剂(HOBT，HBTU, DIEA)，切割试剂(TFA/TIS/H20)人工合成目的多肽。合成后利用反相HPLC C18进行纯化，合成的多肽纯度利用HPLC进行检测。合成多肽的纯度大于或等于 95%。
[0020]3.利用合成的多肽免疫新西兰兔，获得抗血清。用两只成年新西兰兔，将lOOPg合成的多肽溶入1ml磷酸缓冲溶液中，制备抗原溶液。在福氏不完全佐剂中加入分枝杆菌制成完全佐剂，并加入1ml抗原溶液，充分乳化。注射时在4个不同的部位进行皮下注射，分别是后背两处，大腿处两处。分别各注射约500 μ 1抗原溶液。每4-6周注射抗原，并在注射后的7天-10天从兔耳缘静脉收集血液。将收集的血液与注射前收集的血液进行比较，检查是否有抗体产生。将收集的血液在37° C恒温箱中放置30分钟，再在4° C放置过夜。将血液转移至离心管中，4° C，10，000g离心10分钟，收集上清液即为抗血清。
[0021]4.应用抗原多肽对抗血清进行纯化，得到纯化抗体。准备抗原多肽的亲和柱，利用10倍于亲和柱体积并经过预冷的TBS缓冲溶液平衡柱子。将抗血清置于4° C冰箱中缓慢解冻以避免蛋白质的聚集。加入固体叠氮化钠至浓度为0.05%，4° C，15，000g离心5分钟，移出澄清的抗血清再经过滤器过滤除去多余的脂。将抗血清用TBS缓冲溶液以1:5的比例进行稀释，再用过滤器进行过滤。以每分钟0.5 ml的速度将抗血清上到柱上，为保证抗血清与填料的结合，需连续上柱2次并保留流出液。用TBS缓冲溶液清洗柱子后加pH2.7的洗脱缓冲溶液，以0.5ml/min的速度洗脱至所有蛋白均流下来。用已经加入100 μ 1中和缓冲溶液的1.5 ml EP管分管收集洗脱液，混匀后用pH试纸检查洗脱液的pH，如果pH低于7可利用中和缓冲液调至约pH7.4以防止抗体的变性。在柱中加入10ml，pHl.9洗脱缓冲溶液，按上述方法收集洗脱液。利用分光光度计测定各管中蛋白质的含量。将纯化的抗体分装后在-20° C保存。
[0022]三.结果
1.抗体效价比的测定，图1是应用ELISA法进行本发明抗体效价比的测定结果对照图。以合成的人桥梁分子Ι-s抗原多肽包被ELISA板，每孔加入100 μ 1,4 °C过夜。用洗涤液洗3次，加入BSA室温封闭4 h。甩干后，依次加入倍比稀释的纯化抗体(37 V 30 min,洗5次)、1:10 000的HRP-羊抗兔IgG。最后加TMB底物液显色，终止反应后，读取A450值。结果参见图1。说明利用本发明所得抗ITSN1-S兔多克隆纯化抗体，能够在一定程度的空间结构上识别人桥梁分子1-s，并且随着纯化抗体浓度的增加，这种识别作用就越强。
[0023]2.应用Western Blotting法在细胞水平验证所得纯化抗体的特异性和灵敏性。
[0024]参见图2，图2是利用表达外源性人ITSN1-S蛋白的胶质母细胞瘤细胞株LN-229，在细胞水平进行ITSN1-S的检测(Western Blotting法);利用本发明所得抗人ITSN1-S兔多克隆纯化抗体检测得到分子量精确定位于外源性ITSN1-S和GFP融合表达后的蛋白分子量170KDa指示的位置，几乎无非特异性条带的干扰。充分说明该抗体能够在一定程度的空间结构上识别人桥梁分子1-s，并且能够特异性精确检测桥梁分子1-S蛋白在细胞中的表达。
[0025]培养的胶质瘤细胞株，用细胞裂解液进行裂解，并在95度高温变性，制备上样用样本。制备6%的聚丙烯酰胺凝胶，进行细胞全裂解物的垂直凝胶电泳。电泳后进行蛋白转印，蛋白转移至硝酸纤维素膜上。应用5%牛奶进行膜的封闭以去除非特异性因素的干扰。然后加入本发明所得纯化抗体(1:1000)进行孵育过夜，二抗采用Goat anti rabbit IRDye800cw (1:8000)进行孵育1小时，然后通过红外激光成像装置进行结果的采集。
[0026]证实该抗体具有对抗桥梁分子1-S的特异性，在一定程度的空间结构上能够特异性识别人桥梁分子1-s。
[0027]3.利用本发明所得纯化抗体所得结果显著优于在售商品化的抗体的结果。
[0028]利用在售商品化的抗体(Santa Cruz, CA, USA)所得结果参见图3，图3是利用在售的商品化抗体(抗体商品编号sc-9948)检测表达外源性人ITSN1-S蛋白的胶质母细胞瘤细胞株LN-229中ITSN1-S蛋白的表达情况；(抗体商品编号sc-9948)。结果显示无特异性条带，表明在售的商品化抗体识别能力差，特异性差，不能检测出ITSN1-S蛋白的表达。
[0029]应用免疫组织化学染色方法在组织水平上验证本发明所得纯化抗体的特异性和灵敏性。石蜡切片置于烤片机烘烤2-3h后常规利用二甲苯进行脱蜡，然后进行梯度酒精的复水。利用柠檬酸盐抗原修复液进行抗原修复。切片用凉清水冲洗3次，放入3% H202罐中lOmin，封闭过氧化物酶。捞出后用PBS (磷酸盐缓冲液:氯化钠8克，氯化钾0.2克，磷酸氢二纳3.63克，磷酸二氢钾0.24克，溶于1升纯水，PH值7.4)清洗。下一步用山羊血清进行封闭，然后加入本发明所得抗体进行孵育(1:200)置于4°C冰箱过夜。第二天，切片用PBS冲洗3次，加入二抗(HRP标记的羊抗兔抗体(1:500)，置于室温lh。用PBS冲洗3次，直接加入辣根过氧化物酶，盖过组织，放入37°C孵箱，孵育20min。用PBS冲洗3次，应用DAB显色剂进行显色。在加入DAB液后很快显出浅棕色，显色时间< lOmin。显色后PBS冲洗3次。DAB显色后进行苏木素复染约5-10分钟，然后放入1%盐酸酒精中，最后再用氨水返蓝。最后用树脂封片并干燥。
[0030]4.显微镜观察本发明所检测的蛋白表达情况。为了验证本发明所得抗体的使用效果，我们选取了 3例乳腺疾病患者的组织样本，利用本发明所得纯化抗体进行免疫组织化学染色。3例乳腺疾病患者的组织样本分别是浸润性导管癌，浸润性小叶癌和乳腺纤维瘤。浸润性导管癌由导管内癌进展而来，癌变细胞突破导管基底膜，浸润到间质，称为浸润性导管癌，为乳腺癌中最常见类型。浸润性小叶癌通常由小叶原位癌发展而来，癌变细胞突破导管基底膜，浸润到间质，多呈多个小叶发生，随肿瘤生长彼此融合形成大的肿瘤，体积往往明显大于浸润性导管癌。乳腺纤维瘤，又称纤维腺瘤，是一种结缔组织和上皮组织同时增生,形成的境界清楚的良性肿瘤。
[0031]图4和图5为一例人乳腺浸润性导管癌组织的免疫组织化学染色结果图，其是利用本发明所得纯化抗体检测一例人乳腺浸润性导管癌组织中ITSN1-S蛋白的表达情况，说明ITSN1-S蛋白明确定位于细胞质中。结果表明，利用该抗体所得结果，没有非特异性着色，充分说明该抗体能够在一定程度的空间结构上识别人桥梁分子1-s，并且能够特异性精确检测桥梁分子ι-s蛋白在组织中的表达。
[0032]图6和图7是一例人乳腺浸润性小叶癌组织的免疫组织化学染色结果，其是利用本发明所得纯化抗体检测一例人乳腺浸润性小叶癌组织中ITSN1-S蛋白的表达情况，说明ITSN1-S蛋白明确定位于细胞质中。结果表明，利用该抗体所得结果，没有非特异性着色，充分说明该抗体能够在一定程度的空间结构上识别人桥梁分子1-s，并且能够特异性精确检测桥梁分子ι-s蛋白在组织中的表达。
[0033]图8和图9是一例人乳腺纤维瘤患者组织的免疫组织化学染色结果图(免疫组织化学染色SP法，蓝色苏木素着色为细胞核，棕色DAB着色区域表明ITSN1-S蛋白的表达情况)，其是利用本发明所得纯化抗体检测一例人乳腺纤维瘤组织中ITSN1-S蛋白的表达情况，说明ITSN1-S蛋白明确定位于细胞质中。结果表明，利用该抗体所得结果，没有非特异性着色，充分说明该抗体能够在一定程度的空间结构上识别人桥梁分子1-s，并且能够特异性精确检测桥梁分子1-S蛋白在组织中的表达。以上结果表明:在组织水平上，利用本发明所得抗体能够在一定程度的空间结构上识别人桥梁分子1-s，精确检测出ITSN1-S蛋白在各种乳腺疾病组织中的明确定位和表达情况。
[0034]综上所述，图1-9的结果充分说明利用本发明所得抗桥梁分子Ι-s抗体的抗原蛋白兔多克隆抗体，在组织水平和细胞水平上，都能够在一定程度的空间结构上识别人桥梁分子1-s，用于精确检测ITSN1-S蛋白在细胞和组织中的明确定位及表达情况。
【权利要求】
1.一种抗桥梁分子1-S抗体的抗原蛋白，其特征在于:人源ITSNl-S的特异性抗原片段的氨基酸序列如序列表所示，其合成多肽的纯度大于或等于95%。
2.一种抗桥梁分子Ι-s抗体的抗原蛋白兔多克隆抗体，其特征在于:该多克隆抗体是应用人源ITSNl-S蛋白序列进行蛋白免疫片段，得到针对人源ITSNl-S的特异性抗原片段qpvaissapafgmggias,人工合成多肽,并免疫成年兔，获得抗血清，制备抗原溶液，收集上清液即为抗血清；最后应用抗原多肽对抗血清进行纯化而得；该抗体在一定程度的空间结构上识别人桥梁分子1-s，具有对人桥梁分子Ι-s的特异性识别功能。
3.一种抗桥梁分子Ι-s抗体的抗原蛋白兔多克隆抗体在制备检测抗人桥梁分子1-S蛋白表达制剂中的应用，用于特异性检测人桥梁分子1-S蛋白在细胞和组织中的表达。
【文档编号】C07K16/18GK104402985SQ201410806542
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年12月23日 优先权日:2014年12月23日
【发明者】马勇杰, 应国光, 谷峰, 付丽, 王海龙 申请人:天津医科大学肿瘤医院