专利名称：一种新的嵌合体转化生长因子-β的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种简称为TGF-β1/β2的新的嵌合体转化因子-β，编码TGF-β1/β2的核苷酸顺序和表达载体，以及生产TGF-β1/β2的方法。本发明是通过在用编码嵌合TGF-β1/β2前体基因所转染的CHO细胞中TGF-β1/β2的产生和分泌为例加以描述的。该嵌合体基因产物具有TGF-β的生物学活性。
转化生长因子β(TGFβ)是近年发现的控制细胞分化和增殖的多肽家族的一个成员。该多肽家族中的其他成员包括穆勒氏(Mullerian)抑制物质(Cate等，1986，Cell45∶685-698)、抑制素(Mason等，1985，Nature318∶659-663)及由果蝇十五效性基因复合物(decapentaplegicgenecomplex)之转录本推测的蛋白质(Padgett等，1987，Nature325∶81-84)。
已经识别出四种TGF-β，并分别称为TGF-β1、TGF-β2、TGF-β1.2和TGF-β3。首先描述的TGF-β1是由两个有相同分子量为13，000道尔顿，且以二硫键结合的亚单位组成的(Assoian等，1983，J.Biol.Chem.258∶7160;Frolik等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA80∶3676-3680;Frolik等，1983，1984，J.Biol.Chem.260∶10995-11000)。已经由包括胎盘(Frolik等，1983，Nature325∶81-84)、血小板(Childs等，1982，Proc.Natl.Acad.SciUSA79∶5312-5316;Assoian等，1983，J.Biol.Chem.258∶7155-7160)、肾脏(Roberts等，1983，Biochemistry22∶5692-5698)和去矿物质骨(Seyedin等，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82∶119-123)中纯化了TGF-β1。已分离了编码人(Derynck等，1985，Nature316∶701-705)、小鼠(Derynck等，1986，J.Biol.Chem.261∶4377-4379)和猿猴(Sharples等，1987，DNA6∶239-244)TGF-β1的cDNA克隆。对这些克隆的DNA顺序分析表明，TGF-β1是作一个大的前体多肽合成的，其羧基端被裂解后产生了成熟的TGF-β单体。已发现上述所有来源的TGF-β1前体蛋白质间有着很强的顺序同源性。
当存在10%血清和表皮生长因子时，TGF-β1可促进正常大鼠肾成纤维细胞的锚地依赖性生长(Robert等，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA78∶5339-5343;Robert等，1982，Nature295∶417-419;Twardzik等，1985，J.Cell.Biochem.28∶289-297);当只有10%血清时，它能够诱导AKR-2B成纤维细胞的集落形成(Tucker等，1983，CancerRes.43∶1518-1586)。也已表明，TGF-β可刺激大鼠胎儿肌肉间质细胞分化并继而产生软骨特异性大分子(Seyedin等，1986，J.Biol.Chem.261∶5693-5695)。
与其细胞增殖作用相反，已发现由人血小板中纯化的TGF-β1可抑制某些培养之细胞的生长(Tucker等，1984，Science226∶705-707)。也已表明，TGF-β1能抑制几种人类肿瘤细胞系的生长(Roberts等，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82∶119-123)。TGF-β1的这种抑制/刺激功能，可能与包括细胞类型和细胞生理状态在内的多种因素有关(Sporn等，1986，Science233∶532-534)。
TGF-β2与TGF-β1一样，是一种由两个靠二硫键结合之同样的13，000道尔顿亚单位构成的分子量为26，000道尔顿的多肽(Cheifetz等，1987，Cell48∶409-415;Ikeda等，1987，Biochemistry26∶2406-2410)，并已经从牛脱矿物质骨(Seydin等，1987，J.Biol.Chem.262∶1946-1949)、猪血小板(Cheifetz等，1987，48∶409-415)、人前列腺腺癌细胞系，PC-3(Ikeda等，1987，Biochemistry26∶2406-2410)和人成胶质瘤细胞系(Wrann等，1987，EMBO6∶1633-1636)中分离了TGF-β2。已分离了编码人和猿猴TGF-β2的cDNA克隆(Madisen等，1988，DNA7∶1-8;bebb等，1988，DNA7∶493-497)。可由两个较大的前体多肽之一裂解得到成熟的TGF-β2单体，其mRNA则可通过分化接切而产生(Webb等，1988，DNA7∶493-497)。
TGF-β1和TGF-β2在其成熟区有71%氨基酸顺序相同，而在其前体结构中则有41%完全相同。最近已根据cDNA克隆推断出TGF-β3的氨基酸顺序，其似乎含有与TGF-β1和TGF-β2的成熟单体约有80%同源性的C末端112氨基酸顺序(Dijke等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85∶4715-4719)。TGF-β1.2则是含有由二硫键结合之β1和β2亚单位的异二聚体形式(Chifetz等，1987，Cell48∶409-415)。
人、啮齿动物和猴来源的TGF-β1，在其前体区的氨基部分呈现了高度的同源性(Derynck等，1985，Nature316∶701-705;Derynck等，1986，J.Biol.Chem.261∶4377-4379;Sharples等，1987，DNA6∶239-244)，此提文其重要生物学功能可能与分子的这个部分有关联。最近的研究表明，TGF-β1前体的这个部分是已糖基化和磷酸化了的，因为有一个可能的假定支持这一论点即如果不是针对某一特定功能，细胞将不会为完成这些次要的修饰作用而付出代价(Brunner等，1988，Mol.Cell.Biol.8∶2229-2232)。这些修饰作用对于前体的二聚化或使其进入细胞外可能是很重要的。这一点显然提示前体的糖基化作用参予了TGF-β1向细胞外的运输(Purchio等，1988，J.Biol.Chem.263∶14211-14215)。
已有报导指出，可能存在在参予表达猴TGF-β1基因的CHO细胞内加工及表达人工产品的中间前体复合物(Gentry等，1988，Mol.Cell.Biol.8∶4162-4168，待出版;Gentry等，1987，Mol.Cell.Biol.17∶3118-3427)。这些研究揭示，由转染的CHO细胞合成的TGF-β1前体包含了由二硫键结合的前TGF-β1、成熟TGF-β1以及前体的前区。也已在分离的潜在形式TGF-β1中观察到这种二硫键结合的前体复合物(Miyazano等，1988，J.Cell.Biochem.Suppl.12(A)∶200;Wakefield等，1987，J.Biol.Chem.Suppl.11(A)∶46)。
Gentry等人(1988，Mol.Cell.Biol.8∶4162-4168)提出了在转染的CHO细胞中加工早期前TGF-β1下述方案(所引用的氨基酸位置编号参照了已公开的猴TGF-β1(Sharples等，1987，DNA6∶239-244)的顺序编号)。按照这一方案，第一步涉及在Gly-29/Leu-30肽键上进行信号肽裂解。该裂解过程很可能是当前体通过粗面内质网膜运输时同步发生的(BlobelandDobberstein，1975，J.Cell.Biol.67∶835-851;Walter等，1984，Cell38∶5-8)。随着信号肽的裂解，核心糖基化单元(Robert等，1978，Cell15∶1447-1454)在位于Asn-82、Asn-136和Asn-176处的三个预定的N-糖基化位点被加到前TGF-β1上。然后在通过高尔基体运输时使核心糖基化的前TGF-β1相续被加工，以产生含有复合的、唾液酸化之寡糖的磷酸化糖蛋白。在合成或运输的某些阶段，可发生二元残基上的蛋白水解及二硫化物异构化途径，从而释放出成熟的TGF-β1。
在最近的另一研究中，已在TGF-β1前体中鉴定了6-磷酸甘露糖的存在。6-磷酸甘露糖是一种磷酸化的糖类似物，其可能在溶酶体酶的细胞间交换及针对性运输中起到重要作用(vonFigura，1986，Ann.Rev.Biochem.55∶167-193)。已鉴定了能识别溶酶体酶之6-磷酸甘露糖残基的特异受体，并证明其为运输系统的基本成分。已在含有这些组织培养细胞的培养基中鉴定了已分泌的、含有6-磷酸甘露糖的溶酶体蛋白(GalandGottesmar，1986，J.Biol.Chem.261∶1760-1765;Capony等，1981，J.CellBiol.104∶253-262;Baumbach等，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85∶2985-2989;SahagianandGottesmar，1982，J.Biol.Chem.257∶11145-11150)。可能TGF-β1前体的6-磷酸甘露糖残基指引前TGF-β1进入溶酶体，进行蛋白水解性加工，以产生成熟的TGF-β1。另外，也可能是6-磷酸甘露糖残基使裂解的TGF-β1前体进入溶酶体，以便进一步降解。
本发明涉及由真核细胞大量生产称为TGF-β1/β2的新的嵌合TGF-β的方法，所说的真核细胞是用含有处于表达调节元件控制下之TGF-β1/β2前体编码顺序的重组DNA载体转化的。已修饰了猴TGF-βcDNA(Sharples等，1987，DNA6∶239-244)。使其中编码成熟的TGF-β1顺序之氨基酸残基9-13、17、19、25和26的核苷酸改变为编码成熟TGF-β2结构之相应氨基酸的核苷酸(保留了猴密码子的序号)。
构建了含有处于猿猴病毒40(SV40)表达调节元件控制下之嵌合TGF-β1/β2前体编码顺序的表达载体，并用以转染中国仓鼠卵(CHO)细胞。得到了能高水平合成并分泌成熟TGF-β1/β2的CHO转染体。用氨甲喋呤放大TGF-β1/β2表达，经扩增的转染体可分泌多达1mg/L的成熟TGF-β1/β2。对CHO转染体之条件培养基进行酸化处理，可产生最大水平的生物活性TGF-β1/β2。可以认为，转染的CHO细胞高水平分泌成熟的TGF-β1/β2是对嵌合前体蛋白之蛋白水解加工的不寻常效率而导致的。这种提高的加工效率本身又是因申请人在成熟TGF-β结构的氨基末端区中结合了TGF-β1和TGF-β2氨基酸顺序，进而影响其结构特性而造成的。
图1显示由表达质粒p5β/dhfr编码的TGF-β1/β2嵌合蛋白质的核苷酸编码顺序及由之推断的氨基酸顺序。
图2显示5β41，2.5细胞之条件培养基的生物学活性。该生物学活性是用对CCL-64水貂肺上皮细胞的生长抑制检测法检测的。(A)5β41，2.5细胞的无血清条件培养基对0.2M醋酸透析24小时，并用下文所述方法进行分析;(B)TGF-β1的标准生长抑制曲线。
图3显示对5β41，2.5细胞分泌之蛋白质的免疫印迹分析。使5β41，2.5细胞生长汇合;将培养基对0.2M醋酸透析并使用抗TGF-β1369-381抗血清于非还原(泳道1)或还原(泳道2)条件下按下文所述方法进行免疫印迹分析。
本发明涉及TGF-β1/β2、编码TGF-β1和TGF-β1/β2前体的核苷酸顺序、以及生产TGF-β1/β2的重组DMA方法。新的嵌合转化生长因子-β即TGF-β1/β2，在用于检测TGF-β1生物学活性的标准试验中呈现生物学活性，并对TGF-β1特异性抗体有免疫反应活性。作为结构上结合有TGF-β1和TGF-β2氨基酸顺序的嵌合体，本发明的TGF-β1/β2可能携带新的生物学活性，其中有的可能相似或几乎相同于由其亲代分子所表现的活性，有的则可能是TGF-β1/β2所特有的。就相似或几乎相同于TGF-β1和TGF-β2的这些生物活性来说，这种新的因子为诱导相应的生物学反应提供更为有效的诱导物，因而可在各种能预见的医药学应用中替代TGF-β1和TGF-β2。其应用包括但不仅限于诱导或加速细胞增殖与分化，以及抑制细胞分裂。因此，TGF-β1/β2可用于治疗肿瘤和促进伤口愈合。
为了便于描述，可将本发明的方法分为下列几个步骤(a)产生TGF-β1/β2前体的编码顺序，(b)构建用于指导TGF-β1/β2编码顺序之表达的表达载体;(c)转染能够复制、表达基因并加工基因产物以产生成熟TGF-β1/β2和/或TGF-β1/β2前体的适当宿主细胞;以及(d)鉴定并纯化TGF-β1/β2前体和成熟的有生物学活性的TGF-β1/β2。
一旦鉴定了高水平表达TGF-β1/β2前体和/或成熟TGF-β1/β2的转染体，下一步即可扩增该克隆并分离被表达的基因产物。
本文借助实施例进一步验证本发明的方法，其中猴TGF-β1前体cDNA(Sharples等，1987，DNA6∶239-244)已被修饰，使编码成熟猴TGF-β1顺序之氨基酸残基9-13、17、19、25和26的核苷酸改变为编码成熟TGF-β2结构中相应氨基酸的核苷酸，其中保留了猴密码子的惯用符号。然后即可用所得嵌合TGF-β1/β2前体编码顺序构建能够指导成熟TGF-β1/β2产物合成的表达载体。
下列实施例旨在进一步详细描述本发明方法的各个方面。
图1中显示了嵌合TGF-β1/β2的核苷酸编码顺序。在本发明方法的实施中，可用该核苷酸顺序或其功能等同物产生能指导TGF-β1/β2产物表达的重组分子。由于核苷酸编码顺序的简併性，也可用图1中所示的其他DNA顺序实现本发明。图1之核苷酸顺序的这类改变包括不同核苷酸残基的缺失、加入或取代，从而产生编码相同或功能上等同之基因产物的顺序。所得基因产物可包括顺序内氨基酸残基的缺失、加入或取代，从而能产生生物学活性产物的沉默改变。这样的氨基酸取代可基于有关残基之极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性性质的相类而达到。例如，带负电荷氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸;带正电荷氨基酸包括赖氨酸和精氨酸;具有不带电荷极性头部基团或有相似亲水值之非极性头部基团的氨基酸包括亮氨酸、异容氨酸、缬氨酸;甘氨酸、丙氨酸;天冬酰胺、谷氨酰胺;丝氨酸、苏氨酸;苯丙氨酸，酪氨酸。
可由猴细胞来源得到编码猴TGF-β1的核苷酸顺序(Sharples等，1989，DNA6∶239-244)，并可按已知方法制备如图1所示嵌合TGF-β1/β2的核苷酸顺序，其中包括但不仅限于使用DNA限制酶、合成的寡核苷酸以及DNA连接酶。另外，可以使用本领域已知的方法全部或部分合成如图1所示的编码顺序。
在本发明的一个特定实施例中，可由得自非洲绿猴细胞系BSC-40(Sharples等，1987，上述文献)的全长cDNA克隆得到猴TGF-β1的编码顺序。然后使用基因构建技术，用成熟TGF-β2分子(Madisen等，1988，DNA7∶1-8)之氨基酸残基9、10、11、12、13、17、19、25和26的编码顺序取代成熟TGF-β1分子之氨基酸残基9、10、11、12、13、17、19、25和26的编码顺序，由猴TGF-β2cDNA衍生出图1所示的嵌合TGF-β1/β2的编码顺序。
为了表达有生物学活性的成熟TGF-β1/β2，应选择即可高水平转录和转译，又可正确加工基因产物的表达载体/宿主系统。当在表达构建物中使用嵌合TGF-β1/β2前体的完整编码顺序时，这一点特别重要，因为据信同TGF-β1和TGF-β2一样，成熟嵌合TGF-β1/β2也是通过细胞加工过程由前体分子或分子的复合物衍生的。另外，可望有一个能够为产物的分泌提供条件的表达/宿主细胞系统。
具体地说，成熟TGF-β1/β2是通过细胞内加工过程形成的每单位有112个氨基酸之二硫键合的同聚物，据信各亚单位均相似于形成TGF-β1和TGF-β2的亚单位。TGF-β1/β2前体在其前区内有三个潜在的N-糖基化位点(Sharples等，1987，DNA6∶239-244)。涉及TGF-β1的研究已经认定，TGF-β1之前区中的N-糖基化和磷酸化作用发生在被转染的CHO细胞内，其在成熟分子的细胞合成及释放或分泌中，对前体起着重要的功能性作用(Brunner等，1988，Mol.Cell.Biol.8∶2229-2232)。TGF-β1前体中6-磷酸甘露糖的存在也支持这样的推测，即前体分子具有独立的功能活性(Purchio等，1988，J.Biol.Chem.263∶14211-14215)。因为嵌合TGF-β1/β2前体含有猴TGF-β1前区，故申请人相信TGF-β1/β2前体是有功能活性的，并且对于正确加工成熟的TGF-β1/β2分子是很重要的。因此，用于表达系统中的宿主细胞正确表达和加工嵌合TGF-β1/β2的能力，对于成熟的，生物学活性产物的产生是很重要的。
本发明的一个具体实例中，在中国仓鼠卵(CHO)宿主细胞系统中使用猿猴病毒40(SV40)表达控制元件已成功地产生了成熟的生物活性TGF-β1/β2。但也可以使用多种其他动物宿主/表达载体系统(即含有适于在适当宿主细胞中复制、转录和转译TGF-β1/β2编码顺序之必要元件的载体)。它们包括但不仅限于病毒表达载体/哺乳动物宿主细胞系统(如细胞巨化病毒、牛痘病毒、腺病毒等);昆虫病毒表达载体/昆虫细胞系统(如杆状病毒);或得自哺乳动物细胞基因组的非病毒启动子表达系统(如小鼠金属硫因启动子)。
这些载体的表达元件在其强度和特异性上有所差异。根据所使用的宿主/载体系统，可使用任何一个适当的转录和转译元件。例如，当在哺乳动物细胞系统内克隆时，可使用由哺乳动物细胞基因组中分离的启动子(如小鼠金属硫因启动子)，或由生长于这些细胞内的病毒中分离的启动子(如牛痘病毒7.5K启动子)。也可以使用以重组DNA或合成技术产生的启动子，以确保被插入顺序的转录。
为了充分转译被插入的蛋白质编码顺序，还需要有特异的起始信号。这些信号包括ATG起始密码子及相邻顺序。例如，当只有TGF-β1/β2编码顺序的一部分被插入时，就必须提供包括ATG起始密码子的外源转译控制信号。此外，起始信号必须与TGF-β2编码顺序的读码同时协调存在，以确保整个插入段的转译。这些外源转译控制信号和起始密码子可以是有不同来源的，且可以是天然的或合成的。可通过加入转录衰减顺序、增强子元件等来提高表达的效率。
可使用以前介绍的任何将DNA片段插入载体内的方法来构建包含TGF-β1/β2基因及适当转录/转译控制信号的表达载体。这些方法可包括体外DNA重组技术、合成技术及体内重组(遗传重组)方法。
当使用腺病毒作表达载体时，可将TGF-β1/β2编码顺序连接到腺病毒转录/转译控制复合体如晚期启动子和三联体先导顺序上。然后用体外或体内重组法将该嵌合基因插入腺病毒基因组内。在病毒基因组的非必需区域(如E1或E3区域)将会产生存活的，能在被感染的宿主内表达嵌合TGF-β1/β2的重组病毒。同样地，可使用牛痘病毒7.5K启动子。
可用于表达TGF-β1/β2的另一个表达系统是昆虫系统。在该系统中，使用了Autographacalifornica核多角体病毒(AcNPV)作为表达外来基因的载体。该病毒生长于Spodopterafrugiperda细胞中。可将TGF-β1/β2编码顺序克隆到病毒的非必需区域(例如多角体基因)中并置于AcNPV启动子(例如，多角体启动子)的控制下。成功地插入TGF-β1/β2编码顺序将导致多角体基因的失活及未包裹之重组病毒(即缺乏由多角体基因编码之蛋白质被膜的病毒)的产生。然后用这些重组病毒感染Spodopterafrugiperda细胞，以在其中表达插入的基因。
另外，可选择能调节被插入顺序之表达或以特定方式修饰与加工基因产生的宿主细胞株。可在某些诱导剂(如用于诱导金属硫因启动子的锌或镉离子)存在下提高由某些启动子开始的表达。因此，基因工程化TGF-β2的表达是可以控制的。如果外来基因的蛋白质产物对宿主细胞是致死性的，这一点便尤为重要。再者，蛋白质产物的修饰(如糖基化)和加工过程(如对蛋白质产物的水解作用)对于蛋白质的功能可能是很重要的。就蛋白质的转译后加工和修饰来说，不同的宿主细胞有不同特征和特异性机制。可选择适当的细胞系或宿主系统以确保正确地修饰并加工被表达的外源蛋白质。
在本发明的一个特定实例中，构建了含有处于SV40调节顺序控制下并与小鼠二氢叶酸还原酶基因(dhfr)串联之TGF-β1/β2编码顺序的表达载体，并用于转染dhfr缺陷性CHO细胞。通过在选择的培养基中增殖，分离出可表达dhfr表型的CHO转染体。为了提高TGF-β1/β2的表达水平，可将转染体暴露于渐增浓度的氨甲喋呤中，以分离出能转录放大了TGF-β1/β2的mRNA水平的克隆。可用溶液杂交法(Uhler等，1986，Proc.Natl.Acad.SciUSA83∶1300-1304)在放大的不同阶段检测TGF-β1/β2mRNA水平。
至少可用下述四种通用方法鉴定含有TGF-β1/β2编码顺序并表达生物学活性成熟产物的宿主细胞(a)DNA-DNA杂交;(b)存在或不存在“标志”基因功能;(c)检测TGF-β1/β2mRNA转录本在宿主细胞内的表达，以估计转录的水平;以及(d)进行免疫分析及最后的生物学活性检测以鉴定成熟的基因产物。
在第一种方法中，可使用含有基本上与图1所示TGF-β1/β2编码顺序或其部分或衍生物同源之核苷酸顺序的探针，以DNA-DNA杂交法确定是否存在已插入到表达载体内的TGF-β1/β2编码顺序。
在第二种方法中，可基于存在或不存在某些“标志”基因功能(如胸苷激酶活性、抗生素抗性、氨甲喋呤抗性、转化表型、杆状病毒中包涵体的形成等)来鉴定和选择重组表达载体/宿主系统。例如，如果TGF-β1/β2编码顺序已插入到载体的标志基因顺序中，即可根据不存在标志基因功能来鉴定含有TGF-β1/β2编码顺序的重组体。另外，也可使标志基因与TGF-β1/β2顺序串联并置于用来控制TGF-β1/β2编码顺序之表达的相同或不同启动子的控制下。在对诱导或选择作用的反应中表达该标志，即可证明TGF-β1/β2编码顺序的表达。
在第三种方法中，可用杂交法估计TGF-β1/β2编码区的转录活性。例如，可分离聚腺苷酸化RNA并使用与TGF-β1/β2编码顺序或其特定部分同源的探针，以Northern印迹法分析之。另外，可提取宿主细胞的总核酸，并与上述探针进行杂交分析。
在第四种方法中，可用免疫学手段，如Western印迹法、免疫印迹法、放射免疫沉淀法、酶联免疫法等来检测成熟蛋白质产物的表达。但有关表达系统是否成功的最终试验，应包括对生物学活性TGF-β1/β2基因产物的检定。当宿主细胞能分泌基团产物时，可检测得自培养之转化体宿主细胞的无细胞培养基中是否有TGF-β1/β2活性。如基因产物未被分泌时，则可检测溶胞产物中有无TGF-β1/β2活性。在两种情况下，均可使用如本文所述的生长抑制法及类似方法进行生物学检测。
一旦鉴定了产生高水平成熟TGF-β1/β2的克隆，即可扩增该克隆并使用本领域已知的技术纯化TGF-β1/β2。这类方法包括免疫亲和纯化法，及包括高效液相层析法在内的各种层析法等。
实施例在中国仓鼠卵细胞中表达以生产TGF-β1/β2构建编码TGF-β1前体的重组质粒，但其中成熟TGF-β1顺序的氨基酸9、10、11、12、13、17、19、25和26被成熟TGF-β2顺序的相应氨基酸所取代。具体地说，即成熟TGF-β1的氨基酸9(丝氨酸)被精氨酸取代、氨基酸10(丝氨基)被天冬酰胺取代、氨基酸11(苏氨酸)被缬氨酸取代，氨基酸12(谷氨酸)被谷氨酰胺取代，氨基酸13(赖氨酸)被天冬氨酸取代，氨基酸17(缬氨酸)被亮氨酸取代，氨基酸19(谷氨酰胺)被脯氨酸取代、氨基酸25(天冬酰胺)被赖氨酸取代，氨基酸26(赖氨酸)被天冬酰胺取代。用该构建物转染CHO细胞，然后分离可产生并分泌成熟的生物学活性嵌合TGF-β1/β1的转染体。
材料和方法DNA转染在100mm平皿上接种106个dhfr缺陷性CHO细胞，约24小时后用1μg经NdeⅠ切成线性的p5β/dhfr质粒(以其磷酸钙沉淀物)转染培养物，且转染时加入19μg小牛胸腺DNA作为载体(Wigler，M.等，1979，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76∶1373-1376)。简单地说，即将加有载体DNA的20μg质粒加到1 ml 250mM无菌CaCl2中伴随鼓泡将DNA溶液(1ml)逐滴加到1ml 2×HEPES溶液(280mM NaCl，50mMHEPES，1.5mM磷酸钠，pH7.1)中，并将混合物在冰上放置30分钟。然后将沉淀物逐滴散布于含10ml F12′培养基(Gibco)的细胞上。37℃保温4小时后，除去培养基并换成含25%甘油的F12培养基，继续于室温下保温90秒钟。用20ml F12培养基冲洗细胞并在非选择性F12培养基(20ml)中保温48小时。将培养基换成添加了10%已透析之FBS(Gibco)及15μg/ml L-脯氨酸的DMEM培养基，以选择表达dhfr的转染体。在选择培养基中培养10-14天后观察细胞集落。
氨甲喋呤抗性细胞的选择基本上按已述方法(Gasser，C.S.and Schimke，R.T.，1986，J.Biol.Chem.261∶6938-6946)由初级转染体得到二氢叶酸还原酶(dhfr)扩增的细胞。扩充后，将105个细胞接种在100mm平皿上并用渐增浓度的氨甲喋呤(100nM;500nM;2，500nM;10，000nM;20，000nM)驯化之。氨甲喋呤的初始浓度为100nM。用胰蛋白酶消化含可见集落的平皿并驯化至氨甲喋呤浓度至少可再作两次1∶5细胞传代。然后将细胞(105)接种在含下一最高浓度氨甲喋呤的100mm平皿上。再次用胰蛋白酶消化含可见集落的平皿并在含氨甲喋呤的培养基中驯化之。在含有40%FBS、10%二甲亚砜和50%DMEM的培养基中，于扩增的不同阶段冷冻细胞。冷冻培养基中不包含氨甲喋呤。
生长抑制试验利用对TGF-β极其敏感的水貂肺上皮细胞Mv 1 Lu(美国典型培养物保藏中心，登记号CCL-64)进行生长抑制试验。使用胸苷类似物5′-〔125Ⅰ〕-碘代-2′脱氧尿苷(125ⅠdU)进行检测以估计DNA合成量。将与未处理的CCL-64细胞相比，可抑制50%125ⅠdU掺入所需要的量定为一个活性单位。
为检测转染的细胞是否分泌活性TGF-β1/β2，由细胞的24小时汇合培养物中收集无血清上清液，并对0.2M醋酸广泛透析。将样品稀释到无菌的完全培养基中以备检测。
肽合成及抗体的产生在Beckman990型自动合成仪上，用固相技术合成肽链并按已知方法(Gentry等，1983，J.Biol.Chem.258∶11219-11228;GentryL.E.andLawton，A.，1986，Virology152∶421-431)由树脂上裂解之。用高效液相层析法纯化。并经氨基酸分析确定肽的组成。
基本上按已述方法(GentryandLawton，1986，上述文献)使合成的肽通过半胱氨酸残基偶联到牛r球蛋白上。肽结合的效率为每分子r球蛋白共价连接8至26分子肽。
使用在完全弗氏佐剂中乳化的肽结合物(相当于100μg肽)，于3至6个部位经皮下和皮内注射免疫新西兰白兔。然后以2-3周间隔进行加强免疫。加强免疫后7-14天采血。
使用合成肽作免疫原在兔体内产生抗TGF-β1分子内肽顺序的抗肽抗体(Gentry等，1987，Mol.Gell.Biol.7∶3418-3427)。抗体之一(抗TGF-β1369-381)是针对成熟TGF-β生长因子内抗原决定基的。另外两种抗体(抗TGF-β181-84和抗TGF-β1225-236)是前体特异的并且是只针对TGF-β1前体分子内肽顺序的。
免疫印迹分析在7.5-17.5%梯度SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分级分离蛋白质，并转移到未改性的硝酸纤维素滤膜(0.45μm，SchleicherandSchuell)上，于4℃24伏电压下保持1小时(Burnette，W.N.，1981，Anal.Biochem112∶195-203)。加入溶于含0.2%NP-40之磷酸缓冲盐水(PBS)的2.5%BLOTTO(Johnson，D.A.等，1984，Gene.Anal.Techn.1∶3-8)进行保温，以阻断硝酸纤维素的过度结合能力。在2.5%BLOTTO中稀释兔抗血清(1∶75)并于室温下与封闭的硝酸纤维素膜保温2小时。在2.5%TLOTTO中洗涤5次每次5分钟，洗去硝酸纤维素膜上的过量抗体，然后与在2.5%BLOTTO中1∶500稀释的碱性磷酸酶结合的蛋白A一起保温。保温2小时后，在含有0.2%NP-40的PBS中将硝酸纤维素膜洗5次(每次5分钟)，并显色(Leary等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA80∶4045-4049)。
指导TGF-β1/β2合成之质粒的构建按下述方法构建指导嵌合TGF-β1/β2蛋白合成的质粒p5β/dhfr。用BamHI和EcoRI消化衍生于pAc373(Miyamoto等，1985，Mol.Cell.Biol5∶2860-2865;Madisen等，1987，Virology158∶248-250)的杆状病毒载体pAcβTGF-1-该载体包含克隆到pAc611(Miyamoto等，1985，Mol.Cell.Biol.5∶2860-2865;Madison等，1987，Virology158∶248-250)之PstⅠ-EcoRⅠ位点中的TGF-β1(Sharples等，1987，DNA6∶239-244)1.4KbTstⅠ-EcoRⅠ编码顺序，并分离TGF-β1编码顺序的375bp片段(片段1)。用ApaⅠ和EcoRI消化PSV2-βTGF(Gentry等，1987，Mol.Cell.Biol.7∶3418-3427)并分离3.5Kb片段(片段2)。
使用Applied Biosystems寡核苷酸合成仪合成有下示顺序的互补寡核苷酸，并使用丙烯酰胺凝胶纯化之。用T4激酶使之磷酸化并与等摩尔量经激酶处理的寡核苷酸退火。然后将退火的双股合成DNA连接到上述片段1和2上。用此连接混合物转化大肠杆菌并分离5βPSV2(Hpa-Eco+)。
用EcoRⅠ消化5βPSV2(Hpa-Eco+)、用Klenow酶充填末端，再用HindⅢ消化并分离含嵌合TGF-β1/β2编码顺序的1.4Kb片段(片段3)。将片段3连接到事先已用HindⅢ和HpaⅠ消化过除去了neo基因的PSV2，neo中，得到5βPSV2。
用EcoRⅠ消化5βPSV2，用Klenow酶充填末端、用NdeⅠ消化，分离2.6KbNdeⅠ-EcoRⅠ(平头)片段并连接到已用NdeⅠ和PvuⅡ消化过的PSV2/dhfr(Gentry等，1987，Mol.Cell.Biol.7∶3718-3727)中。用连接混合物转化大肠杆菌并分离P5β/dhfr。图1中显示了由P5β/dhfr编码之嵌合TGF-β1/β2分子的核苷酸和由之推断的氨基酸顺序。
TGF-β1/β2在CHO细胞中的表达将P5β/dhfr转染到CHO细胞中，并按上文所述用氨甲喋呤扩增单个克隆。选择一个如此扩增的克隆CHO-5β41，2.5，用于进一步检测分析。
使CHO-5β41，2.5细胞在2.5μM氨甲喋呤中生长汇合。将培养基换成无血清培养基，24小时后收集之并对0.2M醋酸透析48小时。按上文所述方法，根据对CCL-64细胞DNA合成的抑制，检测经透析之条件上清液的生物学活性。CHO-5β45β41，2.5细胞约分泌2mg/L生物学活性嵌合TGF-β1/β2(图2)。
按上文所述，使用针对成熟TGF-β1的抗肽抗体，以免疫印迹法分析这些细胞分泌的TGF-β相关蛋白质。图3显示当于非还原条件下在SDS-PAGE上分析时，CHO-5β41，2.5细胞分泌相当于90-100千道尔顿和24千道尔顿的免疫反应性蛋白质(图3，泳道1)。24千道尔顿带代表成熟TGF-β1/β2二聚体，90-100千道尔顿蛋白质则可能代表通过二硫键与前体顺序结合的成熟TGF-β1/β2(Gentry等，1987，Mol，Cell，Biol.7∶34118-3427)。
于还原条件下(图3，泳道2)，大部分蛋白质在24千道尔顿带处，其代表了成熟的TGF-β1/β2单体。用相似方法分析由编码猴TGF-β1基因之质粒转染的CHO细胞表达的重组蛋白质，结果在45至55千道尔顿范围内没有见到免疫反应性材料(Gentry等，1987Mol.Cell.Biol.7∶3418-3427)，此提示嵌合TGF-β1/β2比亲代分子TGF-β1更有效地受到蛋白水解性加工处理。另外，CHO-5β41，2.5细胞约比表达TGF-β1的细胞(Gentry等，1987，上述文献)多分泌2.5倍的生物活性成熟产物。虽然有关这些观察结果的基础目前尚不清楚，但是嵌合TGF-β1/β2前体的二级结构可能明显地不同于TGF-β1的二级结构，这种差异即可使得嵌合TGF-β1/β2经受到不同强度或性质的分子加工过程。例如，TGF-β1/β2前体对于参予TGF-β加工的因子来说可能是更为有利的底物。另外，TGF-β1/β2的二级结构特征可使之得以与其他不易影响TGF-β1的加工因子或途径相互作用。
下列微生物转染株已寄存在美国典型培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollectionRockville，MD)(转染体)/(CHO-5β41，2.5CL5) (质粒)/(p5β/dhfr) (登记号)/()本发明不仅限于已保藏的细胞系及本文所公开的实施方案这些不过是作为举例来说明本发明的一个方面，它的功能上的等同物也应包括在本发明的范围内。事实上，除本文所描述者1外，根据本说明书所作的各种改动对本领域技术人员来说，均应是显而易见的。这些改动也将落入本发明待批权利要求的范围内。
还应说明的是，本文给出的碱基对和氨基酸数目及核苷酸和肽的大小都是近似数值，并且只是为了便于描述而给出的。
权利要求
1.一种包含基本上如图1所示之约从氨基酸279至氨基酸390之氨基酸顺序的嵌合转化生长因子-β1/β2。
2.含有基本上如图1所示约从核苷酸残基836至核苷酸残基1170之编码嵌合转化生长因子-β1/β2的核苷酸编码顺序。
3.含有基本上如图1所示约从核苷酸残基1至核苷酸残基1170之编码嵌合转化生长因子-β1/β2的核苷酸编码顺序。
4.含有基本上如图1所示约从核苷酸836至核苷酸1170之嵌合转化生长因子-β1/β2编码顺序的细胞。
5.含有基本上如图1所示约从核苷酸1至核苷酸1170之嵌合转化生长因子-β1/β2编码顺序的细胞。
6.含有基本上如图1所示约从核苷酸836至核苷酸1170之嵌合转化生长因子-β1/β2编码顺序的细胞，其中编码顺序处于能调节基因表达的第二个核苷酸顺序的控制之下，从而细胞可产生嵌合转化生长因子-β1/β2。
7.含有基本上如图1所示约从核苷酸1至核苷酸1170之嵌合转化生长因子编码顺序的细胞，其中编码顺序处于能调节基团表达的第二个核苷酸顺序的控制之下，从而细胞可产生嵌合转化生长因子-β1/β2。
8.根据权利要求6或7的细胞，其包括中国仓鼠卵细胞。
9.根据权利要求6或7的细胞，其中调节基因表达的第二个核苷酸顺序包括SV40启动子。
10.根据权利要求6或7的细胞，其中第二个顺序包括启动子和可选择标志的编码顺序。
11.根据权利要求10的细胞，其中可选择标志包括二氢叶酸还原酶。
12.包括寄存于美国典型培养物保藏中心登记号为_之CHO-5β41，2.5CL5的细胞系。
13.生产嵌合转化生长因子-β1/β2的方法，其包括(a)培养包含基本上如图1所示约从核苷酸836至核苷酸1170之嵌合转化生长因子-β1/β2编码顺序的宿主细胞，其中所说的核苷酸编码顺序处于第二个能调节基因表达之核苷酸顺序的控制下，从而由该宿主细胞产生具有嵌合转化生长因子-β1/β2活性的肽或蛋白质;(b)由培养物中回收嵌合转化生长因子-β1/β2。
14.制备嵌合转化生长因子-β1/β2的方法，其包括(a)培养含有基本上如图1所示约从核苷酸1至核苷酸1170之嵌合转化生长因子-β1/β2编码顺序的宿主细胞，其中所说的核苷酸编码顺序处于第二个能调节基因表达之核苷酸顺序的控制下，从而由该宿主细胞产生具有嵌合转化生长因子-β1/β2活性的肽或蛋白质;(b)由培养物中回收嵌合转化生长因子-β1/β2。
15.根据权利要求13或14的方法，其中宿主细胞包括中国仓鼠卵细胞。
16.根据权利要求13或14的方法，其中调节基因表达的第二个核苷酸顺序包括SV40启动子。
17.根据权利要求13或14的方法，其中第二个核苷酸顺序包括启动子和编码该宿主缺乏之可选择标志的编码顺序，从而可鉴定含有嵌合转化生长因子-β1/β2编码顺序的宿主细胞。
18.根据权利要求17的方法，其中可选择标志包括二氢叶酸还原酶。
19.根据权利要求18的方法，其进一步包括使宿主细胞与氨甲喋呤接触，从而可选择出含有放大水平之二氢叶酸还原酶和嵌合转化生长因子-β1/β2编码顺序的抗性集落。
20.生产嵌合转化生长因子-β1/β2的方法，其包括(a)培养已寄存于美国典型培养物保藏中心且登记号为_的转染株CHO-5β41，2.5CL5;(b)由培养物中回收嵌合转化生长因子-β1/β2。
21.根据权利要求20的方法，其中转化体是在氨甲喋呤存在下培养的。
全文摘要
本发明涉及一种称为TGF-β1/β2的新的嵌合体转化因子-β，编码TGF-β1/β2的核苷酸顺序和表达载体，以及生产TGF-β1/β2的方法。本发明是通过构建含有编码嵌合TGF-β1/β2前体基因的表达载体，转染真核细胞—CHO细胞，得能高水平合成并分泌成熟TGF-β1/β2的CHO转染体。该嵌合体基因产物具有TGF-β的生物学活性。
文档编号C07K19/00GK1045994SQ8910935
公开日1990年10月10日 申请日期1989年12月15日 优先权日1988年12月15日
发明者安东尼·F·珀切尔, 琳达·麦迪逊 申请人:安柯金两合公司