专利名称：用于改善衰老不良效应的方法与组合物的制作方法
技术领域：
本发明旨在为改善哺乳动物细胞衰老的不良效应而不提高细胞生长率或总的增殖能力提供方法与组合物。
更准确地说，本发明涉及使用已知化合物-激动素(N6-呋喃甲基腺嘌呤)或其它6-(取代氨基)嘌呤促细胞分裂素，来对抗培养中的或活体哺乳动物细胞(包括人的皮肤细胞)衰老的不良效应的方法，以及用于实施这些方法的组合物。
预防细胞的衰老过程尽管难以捉摸，然而却是生物科学的一个持久的目标。预防衰老过程将取得一些重大的、实际的结果。例如，如果培养中的细胞保持年轻细胞的特性，则可改善从这些细胞制备有用产物的过程。同时，防止人皮肤或其它器官细胞的衰老将是有重要价值的，因为它与保持结构和功能完整有关。对于皮肤，改善细胞衰老的不良效应也将有利于保持美容的完整。
区别年轻和衰老细胞的一些特性现已得到确定，例如，发现处于标准培养中的年轻哺乳动物细胞(包括人成纤维细胞)显得健康和清晰;具有规则的细长纺锤状形态;在培养基质中紧密排列，融合;相互之间并不复盖，很少有一个以上核;在培养基中极少产生碎屑。另一方面，老的成纤维细胞显示很多与年龄有关的症状，例如变得扁平和形态不规则、体积异常大、生长稀疏、每单位面积培养基细胞产率低、多核细胞显著增多、胰蛋白酶作用困难及培养基中碎屑产生率高。年轻细胞区别于老龄细胞的形态学特征以及在老龄细胞上检出的高水平自身荧光反映了区别年轻细胞和衰老细胞的各种生理学和生物化学特性，包括年轻细胞对生长因子的高度反应性及较高的DNA和蛋白合成率。
从哺乳动物(包括人)的培养细胞(常用成纤维细胞)所作的研究，大量地确认了区别年轻与老龄细胞的形态学，生理学和生物化学特性。在这些研究中，以细胞数目倍增数来评估培养细胞的“年龄”，这种细胞倍增出现在从原代培养物(从组织制得)到由原代培养物得到或从原代培养物传代而来的发生关系的培养物中。
在培养细胞的研究中发现的区别年轻和老龄细胞的特性也适合于活哺乳动物体内存在的细胞，这些细胞与培养的成纤维细胞有很多共同的特性，例如相似的生化特性和严格的生长控制(即严格的增殖控制)。皮肤真皮层(即真皮)的成纤维细胞和胃肠道内壁上皮下结缔组织层是显示与培养的成纤维细胞相似老化性质的细胞实例。
活哺乳动物组织中的成纤维细胞在严格的生长控制下周期性地进行正常分裂，这种成纤维细胞的评估“年龄”是以哺乳动物出生时间前后在这些细胞及其亲代之间出现的细胞分裂数来衡量的。由于细胞分裂是周期性出现的，因此在以年月顺序计的哺乳动物年龄与以出生时细胞和其亲代细胞之间的细胞分裂来估测的特定细胞的年龄之间存在着特定的关系。
培养中的成纤维细胞的另一特性是细胞的“总增殖能力”。这是以培养物由于其中“衰老”细胞的死亡(生长和分裂停止)而停止生长前该培养物可经历的细胞数目倍增的总数来估测的。对于人成纤维细胞培养物来说，此总增殖能力典型地为初级培养物经约45-60次倍增。如现有技术中所了解的那样，培养物生长的停止出现得很快，仅仅在几次倍增后，生长速率(以倍增时间的倒数计)即从接近年轻细胞特有的正常值降为零。在正常成纤维细胞的培养物中，即其中细胞不转变为永久的或“癌的”状态，“总增殖能力”作为倍增数的函数而降低，使培养物与得到此培养物的初级培养物分开。与培养中的正常细胞的“总增殖能力”有关的其它术语有细胞的“估计寿命”和“正常生存期”。正常细胞的“估计寿命”或“正常生存期”是从中得到培养物(其中出现细胞)的初级培养物的“总增殖能力”。
正常成纤维细胞，特别是人来源的正常成纤维细胞有一个限定得很窄(在几次倍增中)的培养物总增殖能力，这一事实表明这些细胞处于严格的增殖控制之下。有时，在正常情况下具有有限的总增殖能力的细胞可以发生转化而失去这一限制。这样的细胞的培养物有时可反复传代，在传代数目上没有任何明显的限制。这样的细胞被称作是永久的细胞。永久性是癌细胞的特征。癌细胞很少或几乎不处于增殖控制之下。
活哺乳动物体内细胞(如皮肤真皮层或肠上皮下结缔组织层的成纤维细胞)的总增殖能力不能象培养中的成纤维细胞那样，简单地根据固定的倍增数来估测，此倍增数限于哺乳动物种属特有的狭窄范围(例如，如上所述，人为45-60;鼠为10)。然而，显然活哺乳动物的这些细胞如果是正常的，它们就只有有限的分裂能力，并且处于严格的增殖控制之下。
例如，已知从成人真皮正常细胞得到的初级培养物中的成纤维细胞比从胎儿或新生真皮正常细胞得到的初级培养物中的成纤维细胞具有较低的总增殖能力。事实上，从用大量人供体所作的研究中显示出用正常真皮层细胞得到的初级培养物中的成纤维细胞在培养中具有和供体年龄成反相关的总增殖能力。
培养中的细胞，当转变为永久的或“癌”状态时，它们所特有的有限制的总增殖能力失去限制，这常伴有增殖速率(此处称作生长速率)的异常增长。增殖速率或生长速率是细胞分裂速率的尺度。
同样，在体内成为癌细胞特征的严格增殖控制的丧失，常伴有细胞生长速率的异常增长。
在保持体内衰老细胞的“年轻”表型的早期尝试中，细胞的生长速率总是增长的。然而，现已发现，提高细胞生长速率必然增加细胞分裂速率，从而增加细胞转化为永久的或癌状态的危险性。
同样发现，人为地增加培养细胞的总增殖能力使之超越正常极限，也增加转化为永久的或癌状态的危险性。
通过损害对细胞的严格增殖控制，损害生长速率或损害总增殖能力的限制或损害两者而引起转化的危险，大概是由于这种损害作用于细胞的基因组上或作用于为控制基因表达的生化机制中。
此外，提高生长速率或总增殖能力的处理(至少对培养细胞所作的处理)，如从上皮和血小板而来的生长因子、胰岛素、糖皮质激素、人参提取液和赤霉素植物激素，一般只对“年轻”细胞的保持“年轻”表型有效，对此只需最少量的处理。而“老年”细胞(至少已过其正常生命期的约80-90%)对即使高浓度的这些物质的处理如果有反应的话，反应也是极小的(这些物质的浓度比对处理不到一半生命期的“年轻”细胞有效的浓度高得多)。
必须谨慎地考虑在体内或培养物中用于改善衰老对细胞的不良效应，提高细胞生长速率或总增殖能力的任何组合物，至少在包括正常地处于严格增殖控制之下的细胞的组织(即皮肤、肠壁)上使用该组合物时。
在本发明之前，不能得到这样的组合，它们既改善衰老对细胞形态学、生理学和生物化学特性的不良效应又无潜在有害的细胞生长速率或总增殖能力的提高。
对于本发明，较恰当地是了解成纤维细胞的作用，特别是人皮肤真皮层的成纤维细胞，还有其它哺乳动物皮下相应的结缔组织层及人和其它动物胃肠道内壁上皮的成纤维细胞。成纤维细胞能合成维持皮肤结构、功能和美容完整性和复盖着上皮的其它表面组织的结构和功能完整性所需要的一些成分。这些成分包括胶原和弹性蛋白，它们是与皮肤和其它表面组织三维结构有关的纤维状蛋白;fi-bronectin，是与细胞固定和维持细胞形态有关的一种蛋白质;以及维持上皮和基底细胞层及它们下面的结缔组织层所必需的数个蛋白质类生长因子。由于在维持皮肤和其它表面组织的健康上成纤维细胞蛋白合成的重要作用，也由于已有证据表明成纤维细胞蛋白合成活性明显地随年龄增长而降低(例如，对于培养中的来自胎儿的人成纤维细胞，达到约70%估计寿命的细胞的胶原合成速率只是低于20%估计寿命的成纤维细胞的约50%)，因此改善衰老对体内成纤维蛋白的蛋白质生物合成活性的不良效应而不影响这些成纤维细胞的总增殖能力或生长速率的方法和组合物将是特别有益的。
本发明涉及6-(取代氨基)嘌呤促细胞分裂素，它包括分子式Ⅰ的激动素及其6-氨基嘌呤类似物
其中R1为糠基、苯基、苄基、4，5或6个碳原子的正烷基、(环己基)甲基、3，3-二甲基烯丙基或3-羟甲基-3-烯丙基。
促细胞分裂素是一类植物激素，它是以在含有值物生长素(另一类植物激素)，维生素、矿盐和糖的标准培养基中促进植物组织外植体的细胞分裂能力为定义的。
某些植物和动物细胞的某些tRNA中的核糖核苷酸的碱基部分为促细胞分裂素[特别是激动素(6-糠基-氨基嘌呤)]、玉米素[6-(3-羟甲基-3-甲基烯丙基)-氨基嘌呤]或6-(3，3-二甲基烯丙基)-氨基嘌呤。
据认为，激动素和小麦胚提取物的某些RNA结合蛋白形成复合物，并有人提出，激动素促进植物的蛋白合成。Spirin and A-jtkhozhin，Trends in Biochem.Sci.，April，1989，p.162。
此外，应用便利的培养方法，将激动素加入培养基中，可用激动素生产富含蛋白酵母。东德专利No.148，889(1981)(德温特世界专利索引文摘“Derwent World Patent Index Abstract”)。据报导，激动素也增进微生物培养物的生长。Merck Index，10th Ed.，Entry 5148(Merck and Co.，Rahway，New Jersey，U.S.A.，1983)。
最后，日本专利申请公布No.60-19709(1985)公开了一种组合物，含有不到1%的激动素和不到20%的未经鉴定的紫草属根提取物，后者据认为促进人皮肤的细胞分裂从而预防皮肤衰老。
本发明令人吃惊地发现，将哺乳动物细胞暴露于各种6-(取代氨基)嘌呤促细胞分裂素，可通过延缓与年龄有关的形态学改变(通常随细胞的老化而出现)的发生甚至使之逆转，从而改变衰老对这些细胞的不良效应。这样的暴露有此种改善效应，而不提高细胞的生长速率或总增殖能力。
基于这一发现，提出了新颖的组合物和方法，以改善包括逆转衰老对哺乳动物细胞的不良效应，哺乳动物细胞包括培养的和活体(例如人皮肤)的这样的细胞。
从而，在其它申请中间，本发明的方法和组合物在延缓和逆转通常伴随衰老而出现的人皮肤的结构、功能和美容完整性的退化上是有益的。
如上所述，所有在此之前用于改善衰老对哺乳动物细胞生化、生理和形态特征的不良效应的组合物，也都令人不满地提高细胞的生长速率或总增殖能力。
一方面，本发明限定了改善衰老对哺乳动物细胞不良效应的方法，该方法包括对所述细胞施用一种组合物，该组合物含有改善对这些细胞不良效应有效浓度的促细胞分裂素，6-(取代氨基)嘌呤。
另一方面，本发明限定了用于改善衰老对哺乳动物细胞不良效应的组合物，所述组合物含有改善对这些细胞所述不良效应有效浓度的促细胞分裂素，6-(取代氨基)嘌呤。
在本发明的方法和组合物中，可作为改善衰老不良效应有效化合物而使用的6-(取代氨基)嘌呤促细胞分裂素有激动素、玉米素、6-(3，3-二甲基烯丙基)氨基嘌呤、6-(苄基)氨基嘌呤、6-(苯基)氨基嘌呤、6-(正-烷基)氨基嘌呤(其中正烷基为4、5或6个碳的烷基)和6-(环己基)甲氨基嘌呤，最好的为激动素[6-(糠基)氨基嘌呤]。
可用本发明的方法和组合物处理的哺乳动物细胞包括人的细胞和培养细胞以及活哺乳动物体内细胞。
如果是培养细胞，可从任何组织得到，如果是活体细胞，可以是任何组织的一部分。本发明的方法和组合物以用于人体内组织的成纤维细胞为较好，例如人皮肤真皮层的成纤维细胞或人小肠或胃内壁上皮下结缔组织层的成纤维细胞。最好的应用是用于人皮肤细胞。
因此，本发明进一步涉及一些方法及实施这些方法的组合物，用于延缓(或逆转)通常伴随衰老而出现的皮肤和胃肠道内壁上皮结构和功能完整性和皮肤美容完整性的退化。
在6-(取代氨基)嘌呤促细胞分裂素惊人而有益的低浓度下，本发明的方法和组合物是有效的。在组织培养基中，该浓度典型地为10-6M到5×10-4M之间。在这样的浓度下，促细胞分裂素对哺乳动物细胞显然没有毒性作用。
出人意外地，特别有益地，本发明的方法并不明显地影响按本方法处理的细胞的生长速率或总增殖能力。本发明的组合物和方法不影响受处理细胞DNA合成的速率和合成量。和保持或恢复衰老细胞“年轻”表型的其它组合物不同，本发明的组合物和方法不影响严格的增殖控制，在体内，很多细胞例如成纤维细胞和某些表皮和其它上皮细胞，都必须在这种控制下维持功能正常。
“改善衰老对哺乳动物细胞的不良效应”意味着减慢或逆转如上所述形态学改变的发展，这种形态学改变一般随着“衰老”而出现在培养或体内的正常哺乳动物细胞上。
技术人员可以确定组合物是否包括对改善衰老对细胞不良效应有效的适量6-(取代氨基)嘌呤促细胞分裂素，在实施本发明的方法时，哺乳动物细胞暴露在这种组合物中。通过活组织检查从组织中取出的培养物上得到的细胞，技术人员通过对这些细胞的显微镜检查或类似方法，可以容易地识别伴随衰老而出现的形态学改变。
培养的哺乳动物细胞，它们可不经遗传工程处理而直接从组织培养生长，或者可用各种已知的遗传工程技术进行基因修饰以产生所期望的产物，如已有技术所了解的，它们可被用来制备有用的蛋白质，如淋巴因子或激素，用于诊断、治疗或其它用途。对于这些培养的哺乳动物细胞，用本发明的方法和组合物改善衰老的不良效应，有助于使这些细胞保持比实际情况较年轻的状态。事实上，向哺乳动物细胞的培养基中加入有效量的6-(取代氨基)嘌呤促细胞分裂素，这些细胞已经历了好多代，同时具有衰老细胞所特有的形态学特征，可逆转形态学为较年轻细胞所特有的特征。
本发明的组合物和方法提供的优点是明显的，上面已进行了讨论。其优点在于保持，并在逆转衰老不良效应的情况下改善哺乳动物体内细胞，例如皮肤真皮或人胃肠道内壁上皮下结缔组织层的成纤维细胞的功能完整性，特别是保持人皮肤的美容完整。
根据细胞的本质及其环境，按本发明所述的组合物可取若干形式中的任一种，按照本发明，将能改善衰老不良效应的量的6-(取代氨基)嘌呤促细胞分裂素应用于这些细胞。
对于沉浸或悬浮于培养基中的培养细胞，按本发明所述的组合物是添加约10-6(即1μM)-5×10-4M6-(取代氨基)嘌呤促细胞分裂素的用于哺乳动物细胞的培养基。分子式Ⅰ的优选的促细胞分裂素，其中R1为糠基、苯基、苄基、4、5或6个碳的正-烷基、(环己基)甲基[-CH2(C6H11)]、3-羟甲基-3-甲基烯丙基
或3，3-二甲基烯丙基[-CH2CH＝C(CH3)2]，在培养基中其浓度范围为0.2-100∶1，000，000(0.2-100ppm)。最佳的促细胞分裂素-激动素，在培养基中其优选的浓度范围为约25μM至约250μM(即，约5ppm至约50ppm)。
对于培养细胞，用本发明方法给予改善衰老不良效应量的6-(取代氨基)嘌呤促细胞分裂素，只需将细胞沉浸或种植在培养基中，此培养基即按本发明所述的组合物。
对于哺乳动物体内细胞，优选的为人皮肤真皮层或人胃肠道内壁上皮下结缔组织层的成纤维细胞(或其它活性细胞，如角质细胞)，本发明方法的实施是将这些细胞暴露于改善衰老不良效应量的6-(取代氨基)嘌呤促细胞分裂素。
通常，这样的暴露将在希望按本发明改善衰老对细胞不良效应的一段时间内周期性地重复。暴露的频率将根据涉及的细胞，细胞位于哺乳动物的部位和6-(取代氨基)嘌呤促细胞分裂素的浓度而定，具体地说，细胞的部位，例如胃肠道的细胞，由于反复受不含6-(取代氨基)嘌呤促细胞分裂素的组合物的冲洗，因而需要比皮肤细胞更频繁的暴露;6-(取代氨基)嘌呤促细胞分裂素的浓度，即在有效地改善衰老对活性细胞(如在所述结缔组织层的成纤维细胞)不良效应的浓度下，能有效地渗透到结缔级织层(胃肠道内壁上皮下的结缔组织层)的一定范围内，典型地是在约10ppm和约1000ppm之间的浓度。
对于胃肠道内壁上皮下的结缔组织层，本发明方法的实施是通过摄入按本发明所述的组合物，该组合物是采用口服剂型，是生理学上可接受的溶液剂、悬浮剂或滋补剂，它包括在一定浓度范围内(典型地是在约10ppm和约1000ppm之间)的6-(取代氨基)嘌呤促细胞分裂素，在此浓度下，能有效地渗透到胃肠道内壁上皮下的结缔组织层，以达到有效地改善衰老对所述结缔组织层活性细胞(如成纤维细胞)的不良效应的浓度。
对于人皮肤的成纤维细胞(或其它活性细胞，如角质细胞)，本发明方法的实施是将按本发明所述的组合物施用于皮肤的外表面，该组合物为霜剂、软膏、洗剂、凝胶、溶液剂、香水、固体或类似剂型，它是用于皮肤外表面为生理学上可接受的，它包括在适当的赋形剂中的有效浓度的6-(取代氨基)嘌呤促细胞分裂素，有效浓度即在改善衰老对所述真皮的活性细胞(如成纤维细胞)的不良效应上有效的浓度下能有效地渗透到皮肤真皮的浓度。
用于人皮肤的本发明的组合物是用有效浓度范围内(典型的是在约0.5ppm和约500ppm之间)的6-(取代氨基)嘌呤促细胞分裂素，优选上面限定的分子式Ⅰ的6-(取代氨基)嘌呤促细胞分裂素之一，与霜剂、软膏、洗剂、凝胶、溶液或固体基质或在已有技术中已知无毒并在皮肤病学上可接受的赋形剂配制而成的。溶解、悬浮、分散或类似处理在用于人皮肤的本发明组合物中的6-(取代氨基)嘌呤促细胞分裂素的浓度(或重量分)是这样的，以致于约0.2ppm和约100ppm之间的6-(取代氨基)嘌呤促细胞分裂素被输送到皮肤活性细胞，如成纤维细胞。一般来说，润滑药或润滑剂类赋形剂有助于皮肤的水合作用，比挥发性赋形剂(如乙醇)更可取，后者使皮肤干燥。
用于制备人皮肤上使用的本发明组合物的 基质或赋形剂举例如下凡士林、凡士林+挥发性的硅、羊毛脂、冷霜(USP)和亲水性软膏(USP)。本发明的一个优选的组合物含有约10ppm和100ppm之间的激动素，和合适的软膏或霜剂基质。
选择可接受的赋形剂，在很大程序上取决于6-(取代氨基)嘌呤促细胞分裂素的使用方法。这些方法包括局部施用。药学和皮肤病学上可接受的适合局部使用的赋形剂包括适合用于洗剂、霜剂、溶液剂、凝胶、纱带等的赋形剂。一般说来，赋形剂可以是无然有机物或含水乳剂，可含有分散、悬浮或溶解其中的6-(取代氨基)嘌呤促细胞分裂素。赋形剂可包括药学上可接受的润滑药、皮肤渗透促进剂、着色剂、芳香剂、乳化剂、增稠剂和溶剂。下面详述这些剂型。
1.洗剂洗剂可包括有效量的6-(取代氨基)嘌呤促细胞分裂素(有效地使6-(取代氨基)嘌呤促细胞分裂素输送到皮肤活性细胞，如成纤维细胞，用约0.2ppm和约100ppm之间的量);从1%到50%(优选3%到15%)的润滑剂;平衡液，可为水、C2或C3醇或水和醇的混合物。一些润滑剂是已知的，其实例如下a.烃油和蜡，例子为矿油、凡士林、石蜡、地蜡、微晶蜡、聚乙烯和全氢角鲨烯。
b.硅油，例如，二甲基聚硅氧烷、甲基苯基聚硅氧烷、水溶性和醇溶性硅-乙二醇共聚体。
c.甘油三酯脂肪和油，例如，得自蔬菜、动物和海产品的这类脂肪和油。其实例包括(但不限于)蓖麻油、红花油、棉籽油、玉米油、橄榄油、鳕鱼肝油、杏仁油、鳄梨油、棕榈油、芝麻油和豆油。
d.乙酰甘油酯，例如单乙酰甘油酯。
e.乙氧基化甘油酯，如乙氧基化甘油基-硬脂酸酯。
f.含10-20个碳原子的脂肪酸烷酯。此处常用的为脂肪酸的甲基、异丙基和丁基酯。其实例包括(但不限于) 酸己酯、月桂酸异己酯、棕榈酸异己酯、棕榈酸异丙酯、肉豆蔻酸异丙酯、油酸癸酯、油酸异癸酯、硬脂酸十六烷酯、硬脂酸癸酯、异硬脂酸异丙酯、己二酸二异丙酯、己二酸二异己酯、己二酸己基十六烷基二酯、癸二酸二异丙酯、乳酸月桂酯、乳酸肉豆蔻酯和乳酸十六烷酯。
g.含10-20个碳原子的脂肪酸链烯酯。其实例包括(但不限于)肉豆蔻酸油醇酯、硬脂酸油醇酯的油酸油醇酯。
h.含9-22个碳原子的脂肪酸。合适的例子包括(但不限于)壬酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、异硬脂酸、羟基硬脂酸、油酸、亚油酸、蓖麻酸、花生四烯酸、山萮酸和芥酸。
i.含10-22个碳原子的脂肪醇。月桂醇、肉豆蔻醇、十六烷醇、十八烷醇、异十八烷醇、羟基十八烷醇、油醇、蓖麻油醇、山萮醇、瓢尔菜醇和2-辛基十二烷醇是令人满意的脂肪醇的实例。
j.脂肪醇酯。10-20个碳原子的乙氧基化脂肪醇包括(但不限于)月桂醇、十六烷醇、十八烷醇、异十八烷醇、异十八烷醇、油醇和胆固醇，这些醇上连有1-50个环氧乙烷基或1-50个1，2-环氧丙烷基，或它们的混合物。
k.醚酯，如乙氧基化脂肪醇的脂肪酸酯。
l.羊毛脂及衍生物。羊毛脂、羊毛脂油、羊毛脂蜡、羊毛脂醇、羊毛脂脂肪酸、羊毛脂酸异丙酯、乙氧基化羊毛脂、乙氧基化羊毛脂醇、乙氧基化胆固醇，丙氧基化羊毛脂醇、乙酰基羊毛脂、乙酰基羊毛脂醇、羊毛脂醇亚油酸酯、羊毛脂醇蓖麻醇酸酯、羊毛脂醇蓖麻醇酸酯的乙酸酯、乙氧基化醇酯的乙酸酯、羊毛脂的氢解产物、乙氧基化氢解羊毛脂、乙氧基化山梨醇羊毛脂以及液体和半固体状羊毛脂吸收基，作为从羊毛脂衍生的润滑剂的例证。
m.多元醇和聚醚衍生物。其实例为丙二醇、二丙二醇、聚丙二醇(M.W.2000-4000)、聚氧乙烯聚氧丙烯乙二醇、聚氧丙烯聚氧乙烯乙二醇、甘油、乙氧基化甘油、丙氧基化甘油、 梨醇、乙氧基化山梨醇、羟丙基山梨醇、聚乙烯乙二醇(M.W.200-6000)，甲氧基聚乙烯乙二醇350、550、750、2000、5000聚环氧乙烷均聚物(M.W.100，000-5，000，000)聚烷基二醇及其衍生物，乙二醇(2-甲基-2，4-戊二醇)、1，3-丁二醇、1，2，6-己三醇、乙基己二醇USP(2-乙基-1，3-己二醇)、C15-C18连位乙二醇和三羟甲基丙烷的聚氧化丙烯衍生物。
n.多元醇酯。乙二醇一和二脂肪酸酯、二乙二醇一和二脂肪酸酯、聚乙二醇(M.W.200-6000)一和二脂肪酸酯、丙二醇一和二脂肪酸酯、聚丙二醇2000单油酸酯、聚丙二醇2000单硬脂酸酯、乙氧基化丙二醇单硬脂酸酯、一和二脂肪酸甘油酯、聚甘油聚脂肪酸酯、单硬脂酸乙氧基甘油酯、1，3-丁二醇单硬脂酸酯、1，3-丁二醇二硬脂酸酯、聚氧乙烯多元醇脂肪酸酯、山梨糖醇酐脂肪酸酯和聚氧化乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯，以上这些是令人满意的多元醇酯。
o.蜡酯，例如，蜂蜡、鲸蜡、肉豆蔻酰肉豆蔻酯和硬脂酰硬脂酸酯。
p.蜂蜡衍生物，例如，聚氧乙烯山梨醇峰蜡。它们是蜂蜡和不同环氧乙烷含量的乙氧基化山梨醇的反应产物，形成醚-酯混合物。
q.植物蜡，包括(但不限于)巴西棕榈蜡和小烛树蜡。
r.磷脂，例如卵磷脂及其衍生物。
s.甾醇类，其实例为胆固醇和胆固醇脂肪酸酯。
t.酰胺类，例如，脂肪酸酰胺类，乙氧基化脂肪酸酰胺类和固体脂肪酸链烷醇酰胺类。
洗剂进一步优选地包括从1%-10%(更优地为2%-5%)乳化剂。乳化剂可以是非离子型、阴离子和阳离子型的。符合要求的非离子型乳化剂的实例包括(但不限于)含10-20个碳原子的脂肪醇、含与2-20摩尔环氧乙烷或环氧丙烷缩合的10-20个碳原子的脂肪醇、在与2-20摩尔环氧乙烷缩合的烷 有6-12个碳原子的烷基酚、环氧乙烷的一和二脂肪酸酯、乙二醇的一和二脂肪酸酯(其中脂肪酸基团含有10-20个碳原子、二乙二醇、分子量200-6000的聚乙二醇、分子量200-3000的聚丙二醇、甘油、山梨醇、山梨糖醇酐、聚氧乙烯山梨醇、聚氧乙烯山梨糖醇酐和亲水蜡酯。合适的阴离子型乳化剂包括(但不限于)脂肪酸肥皂，例如，钠、钾和三乙醇氨肥皂，其中脂肪酸基团含10-30个碳原子。其它合适的阴离子型乳化剂包括(但不限于)硫酸碱金属盐、铵盐或取代的烷基硫酸铵盐、芳基磺酸烷基乙氧基醚(在烷基上有10-30个碳原子)。此磺酸烷基乙氧醚含1-50个环氧乙烷单元。在符号要求的阳离子型乳化剂中，有季铵化合物、吗啉化合物和吡啶鎓化合物。前一段所述的某些润滑剂也具有乳化性质。当配制含这样一种润滑剂的洗剂时，就不必再另加乳化剂，尽管它可以包含在组合物中。
洗剂的平衡液是水或-C2或C3醇，或水和醇的混合物。洗剂的配制仅需将所有成分混合在一起。较可取地是将6-(取代氨基)嘌呤促细胞分裂素溶解在混合物中。
洗剂中可包括常规可选用的成分，一种这样的添加物为占组合物1%-10%的增稠剂。合适的增稠剂的实例包括(但不限于)交联的羧基聚甲烯共聚物、乙基纤维素、聚乙二醇、黄蓍树胶、刺梧桐树胶、黄原胶和膨润土、羟乙基纤维素和羟丙基纤维素。
2.霜剂霜剂包含有效量的6-(取代氨基)嘌呤促细胞分裂素(例如，能有效地使到达皮肤活性细胞如成纤维细胞的6-(取代氨基)嘌呤促细胞分裂素量为约0.2ppm和100ppm之间的量)，5%-50%(较佳为10%-25%)的润滑剂，以水为平衡液。上述的润滑剂也可用于霜剂组合物。霜剂可任意选择地含有如前所述的合适的乳化剂。当含有乳化剂时，它在组合物中占3%-50%，以5%-20%为较佳。
3.溶液剂溶液剂包含有效量的6-(取代氨基)嘌呤促细胞分裂素(例如，能有效地使到达皮肤活性细胞如成纤维细胞的6-(取代氨基)嘌呤促细胞分裂素的量为约0.2ppm到约100ppm之间的量)，平衡液为水、合适的有机溶剂或水和这样一种有机溶剂的组合物。用作溶剂或溶剂系统之一部分的合适的有机物质为丙二醇、聚乙二醇(M.W.200-600)、聚丙二醇(M.W.425-2025)、甘油、山梨醇酯、1，2，6-己三醇、乙醇、异丙醇、酒石酸二乙酯、丁二醇及其混合物。这样的溶剂系统也可含有水。
这些溶液剂形式的组合物可直接用于皮肤，也可配在气溶胶中，以喷雾剂的形式用于皮肤。该气溶胶组合物进一步含有25%-80%(优选30%-50%)的合适的推进剂。这样的推进剂的实例为氯化的、氟化的和氯氟化的低分子量烃。氧化亚氮、二氧化碳、丁烷和丙烷也用作推进剂气体。这些推进剂的使用按已有技术中熟悉的方法，按一定量，在适合于排出容器中的内容物的压力下进行。
4.凝胶凝胶的配制仅仅是将适合的增稠剂混合到前面所述的溶液组合物中。合适的增稠剂的例子已在前面关于洗剂部分加以描述。
凝胶状的组合物包含有效量的6-(取代氨基)嘌呤促细胞分裂素(例如，能有效地使到达皮肤活性细胞如成纤维细胞的6-(取代氨基)嘌呤促细胞分裂素的量为约0.2ppm到约100ppm之间的量);5%-75%(优选10%-50%)的如前所述的溶剂;0.5%-20%(优选1-10%)的增稠剂;平衡液为水。
5.固体固体剂型的组合物可以打算用于唇或身体其它部分的棒型组合物的形式使用。这样的组合物包含有效量的6-(取代氨基)嘌呤促细胞分裂素(例如，能有效地使到达皮肤活性细胞 成纤维细胞的6-(取代氨基)嘌呤促细胞分裂素的量为约0.2ppm到约100ppm之间的量)，及50%-98%(优选60%-90%)前述的润滑剂。该组合物可进一步包含1-20%(优选5%-15%)合适的增稠剂，任选的乳化剂和水。前面关于洗剂部分所描述的增稠剂适当地用于固体剂型的组合物。
适用于人面部皮肤的本发明组合物的例子包含在基质中的10ppm-100ppm激动素，基质的制备是按重量将10份甘油单硬脂酸酯、10份鲸蜡醇、30份鲸蜡、10份吐温20(山梨糖醇酐单硬脂酸酯的聚氧化烯衍生物)、10份山梨糖醇酯20(山梨糖醇酐单月桂酸酯)、12.5份甘油和100份水。可取代激动素而使用的改善衰老不良效应活性成分的例子为玉米素、6-(3，3-二甲基烯丙基)氨基嘌呤、6-苄基氨基嘌呤，或激动素和6-(正-己基)氨基嘌呤或6-苄基氨基嘌呤的结合。
其它成分，例如防腐剂(如羟苯甲酸甲酯或羟苯甲酸乙酯)、香料、染料或类似物质，也可用在局部应用的本发明组合物中，这些成分是在已有技术中已知能给用于皮肤的组合物提供合乎需要的稳定性、香味或颜色，或其它合乎需要的性质，如阻挡来自太阳的光化射线。
本发明的组合物还可包括除6-(取代氨基)嘌呤促细胞分裂素以外的具有改善衰老不良效应活性的成分。但是，如果使用其它这样的成分，它们提高受处理细胞的生长速率或总增殖能力或使二者均提高，则单独用6-(取代氨基)嘌呤促细胞分裂素的优点，即不明显影响生长速率或总增殖能力，将有被削弱的趋势。因而，优选的本发明的组合物将包括6-(取代氨基)嘌呤促细胞分裂素作为唯一的改善衰老不良效应的成分。
用于人皮肤的本发明组合物，以每天一次施用于需用本发明方法处理的皮肤部位为好。
本发明的方法可这样应用于人皮肤如上所述，将适用于人皮肤处理的本发明组合物施用于皮肤上，最好每天，经一定的时期，即按个人所需，享受本发明的方法和组合物提供的改善衰老对皮肤效应的作用。按本发明所述的化合物，每天一次施用于皮肤上，需至少约一个月，直至至少约一年，取决于人的年龄，使用该组合物的皮肤的情况和组合物中6-(取代氨基)嘌呤促细胞分裂素的浓度(或重量分)，在皮肤表面的有益效应才开始变得明显，这些有盗效应是在皮肤基底细胞层的成纤维细胞上，延缓蛋白质合成速率的降低，延缓与年龄有关的形态学改变。如果终止使用本发明的方法，过一些时候被本方法所改善的衰老效应又会再出现。
现以下面的实施例阐述本发明。
实施例1激动素对短期细胞生长的作用用已有技术中称作“一步生长曲线”的实验，研究激动素对正常二倍体人胚胎皮肤成纤维细胞(称作KIS的种系)的短期生长的作用。为此目的，在装有添加10%小牛胚胎血清、抗生素和谷氨酰胺的Dulbecco's改良的Eagle's培养剂(DMEM)的几个培养瓶中，加入相等数目的KIS细胞(105)。将不同体积的配制在盐平衡溶液(Hanker's缓冲液)中的激动素贮备液加入瓶中，以获得在培养基中其终浓度为40μM、80μM和200μM。然后在5%CO2氛围中，在37℃温度下将培养物保温。所有实验均以一式三份进行。
为了测定用各种剂量激动素处理的细胞的附着率，在植入细胞6小时后，每一剂量用一批培养瓶来计数附着在培养瓶底表面上的细胞数，方法为第一次经胰蛋白酶作用移出细胞，将它们再悬浮于新鲜培养基中，用Coulter计数器来计数。
为了估测用激动素处理和未用激动素处理的细胞的生长速率或增殖速率，每24小时用一批培养瓶按上面所述 细胞数，一直继续到所有培养物融合，细胞数没有进一步增加(通常为8-10天)，得到如下结果1.在光学显微镜下，经细胞镜检判断，正常细胞显示对各种剂量激动素处理无形态学不良效应。
2.激动素对人细胞无明显毒性作用，因为在细胞附着、培养基中的细胞碎屑和每单位面积培养基质上的细胞数目上，处理和未处理细胞间均无差异。
3.激动素处理的和未经激动素处理的细胞，证实有相同的生长速率，并在同时产生融合。这清楚地表明，激动素不提高培养细胞的生长速率。实施例2提出了支持这一点的进一步证据。
实施例Ⅱ激动素对长期生长速率和总增殖能力的影响采用已有技术中称作“长命曲线”的实验，研究了激动素对KIS细胞长期生长速率和总增殖能力的影响。为此目的，至少16个平行的KIS细胞培养瓶供养在含40μM激动素的培养基中，同时有同等数量的未加处理的对照培养瓶。所有实验是从群体倍增水平(PDL)为6时开始的，这相当于如前面体外实验中测得正常估计寿命的约12%(即细胞的总增殖能力为约PDL＝50)。
细胞培养、胰蛋的酶作用和细胞计数的方法按实施例Ⅰ所描述的。但是，对于长期研究来说，培养物依次通过它们变融合的各个时期。这样的依次通过持续到所有的培养物停止变融合，尽管每周换一次培养基，持续4-5周。为了评定经激动素处理和未经激动素处理的培养物达到的PDL确切数，当细胞年轻时，从16个平行进行培养的培养瓶中，再分出至少4个融合培养瓶的细胞(分的比例为1∶4)，当细胞因衰老而生长速率减慢时，再以1∶2分出。培养物经历植入细胞和变融合之间的PDL数用logN/log2测定，其中N为融合的培养物中的细胞数，被该瓶中原始植入 细胞数去除。最后，在每一培养物体外实验生命期终止时计算它的累积PDL。
按照累积PDL，在培养基中有或没有激动素持续存在下，人细胞生长的生命期无差异。在系列实验中，这两类培养物达到最大PDL，在47至49范围内。这意味着，细胞的总增殖能力不因培养基中激动素的存在而发生明显改变。
但是，按照时间计，经激动素处理的细胞，生存时间(217天)比对照组细胞(196天)长。这是因为，在它们生命期终结时(即当不再达到融合时)用激动素处理的细胞继续显示比对照细胞旺盛，至少达两周之久，而无明显数量的死细胞脱落到培养基中。
至于生长速率，以群体倍增数作为时间的函数所作的曲线，其斜率在经激动素处理和未经激动素处理的细胞之间无实验上可区别的差异。从而，经激动素处理和未经激动素处理(对照)细胞培养物的生长速率无显著差异。激动素并不明显地改变培养中的人体细胞由遗传学上决定的、对正常生命期的固有的限制(即总增殖能力)。
DNA合成和生长速率在植物，已知促细胞分裂素(包括激动素)有助于细胞分裂最后阶段的完成。这提示，促细胞分裂素可能以如下方式影响哺乳动物细胞DNA的合成，即在促细胞分裂素存在下，增加这些细胞转变成癌变状态的危险性。
因此，采用核示踪放射自显影和在酸不溶性介质中的3H-胸腺嘧啶脱氧核苷(3H-胸苷)摄取的方法进行研究，以观察激动素对培养中的人体细胞DNA合成的影响。
在放射自显影中，在不同浓度激动素(40μM-200μM)存在下和无激动素时，KIS细胞在无菌盖玻璃条上生长。经不同处理时间后，在培养物中加入3H-胸苷(1uci/ml)，经短时间(2小时)，为了测定此时周期中细胞的数目，或经较长时间(24-48小时)，以确定能进入细胞周期S相的培养细胞数目。在完成标记阶段后，按标准方法将细胞进行放射自显影。在曝光、显影和染色后，用显微镜计数，每条至少计数500个细胞，从而测定周期中细胞(它们摄取放射性胸苷并掺入其新合成的DNA，在放射自显影图上产生深色核心)和非周期细胞的百分率。在标记2小时和较长时间(24-48小时)后，发现用激动素处理不用激动素处理的细胞具有在实验上不可辨别的周期细胞和非周期细胞百分率。
同样地，在标记90分钟或72小时后，通过用闪烁计数器测定每106个细胞在酸不溶性介质中的dpm来评价用激动素处理和不用激动素处理的KIS细胞对3H-胸苷的摄取，结果显示用激动素处理对DNA的合成无刺激作用。
如实施例Ⅰ所指出的，大量独立实验显示激动素不引起人细胞培养物中的细胞发生外加的增殖。本实施例的实验显示，激动素不刺激DNA合成，也不推动细胞进入新的细胞周期，使之快于对照细胞进入这样的周期。因而，激动素并不改变人细胞的细胞生长速率。
实施例Ⅲ激动素对细胞形态学的影响对于致力于衰老研究的细胞生物学家来说，与年龄有关的顺次经过的细胞形态学上的改变是人所皆知的。培养中的年轻的人成纤维细胞在融合时呈细、长、纺锤形，并紧密集聚在一起。而完成了生命期的90%以上的老细胞，则体积很大，非常扁平，形状不规则，有很多空泡，含有许多所谓“残体”，用紫外光激发，在荧光显微镜下观察到该“残体”显示强烈的自身荧光。
对有40μM激动素和无激动素存在于生长的KIS细胞(PDL＝44)进行形态学 。用激动素处理的细胞不具有老细胞的典型形态，在体积上并不明显大于年轻细胞(例如，PDL＝14)，而未经激动素处理的细胞则相反。与未经激动素处理的细胞相比，经激动素处理的细胞在很大程度上保持纺锤形的外观;它们不是不规则地堆集;也不含有很多空泡和残体。甚至在生命的终端相，某些年轻外观的这种戏刷性的保持，有效地证明了激动素在10-6M-10-4M浓度下能够延缓与衰老有关的症状的发生。
在另一系列实验中发现，在培养基中加激动素至一定浓度，可使早已变老的细胞(例如，PDL大于40)在形态学上回复到更年轻些的外观。回复的程序取决于在暴露于激动素之前早已达到的老龄的程度(较年轻的细胞回复得多一些)，加到培养基中的激动素的浓度和激动素存在时间的长短。例如，完成80%以上生命期的KIS细胞(大于40PDL)，在用培养基中200μM激动素处理2-3周后，开始出现象PDL＝30-35的细胞那样的形态。
在从培养基中除去激动素后，“老的”形态的重新获得率尚未确定，但实验表明，它比将激动素引入培养基所引起的向年轻形态的回复率低得多。
细胞产量和大小培养中细胞衰老的参数之一为当细胞接近老龄时细胞产量(即融合层的细胞数)的降低。这主要是由于细胞随年龄增长而进行性地变大这一事实。因此，如果培养瓶的面积保持不变，当细胞随着周期的迁移而接近其生命期的终端时，每瓶的细胞数减少。将一系列KIS细胞培养物在无激动素的培养基中周期性迁移地进行培养。另一系KIS细胞培养物按同样方法处理，只是培养基中包含40μM激动素。未处理的细胞，其细胞产量几乎恒定地保持在约1.5×106个/25cm2，直至PDL＝43，然后在PDL＝48时降低为约3.5×105个/25cm2，这时生长停止。而处理的细胞，其细胞产量几乎恒定地保持在约1.5×106个/25cm2直至PDL＝48，然后在PDL＝49时降低为约7×105个/25cm2，这时生长停止。用激动素处理的细胞甚至在生命的最后期也能保持“年轻”细胞的细胞产量特性，这在用激动素处理以延缓人细胞某些衰老症状的发生上是极其重要的。
尽管此处描述的本发明带有某些特异性，然而熟悉已有技术的人们能认可在上述的本发明精神下所作的修改和变动。这样的修改和变动被认为也是被下面的权利要求所包括的。
权利要求
1.改善衰老对哺乳动物细胞不良效应的方法，其特征在于，给所述细胞施用包括0.2ppm-200ppm6-(取代氨基)嘌呤促细胞分裂素的组合物。
2.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞为活的人体上的细胞。
3.按权利要求2所述的方法，其特征在于，所述细胞为皮肤成纤维细胞，所述组合物为皮肤洗剂，软膏或霜剂，它们被施用在皮肤表面。
4.按权利要求3所述的方法，其特征在于，其中6-(取代氨基)嘌呤促细胞分裂素为分子式Ⅰ的化合物
其中R1选自由糠基、苯基、苄基、4，5或6个碳原子的正-烷基、(环己基)甲基、(3-羟甲基-3-甲基)烯丙基和3，3-二甲基烯丙基组成的一组。
5.按权利要求4所述的方法，其特征在于，分子式Ⅰ的化合物为激动素。
6.按权利要求5所述的方法，其特征在于，所述皮肤洗剂、软膏或霜剂中激动剂的浓度为10ppm-100ppm之间。
7.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞为细胞培养中的成纤维细胞，所述组合物为培养基。
8.按权利要求7所述的方法，其特征在于，所述细胞为人体细胞。
9.按权利要求8所述的方法，其特征在于，6-(取代氨基)嘌呤促细胞分裂素为分子式Ⅰ的化合物
其中R1选自由糠基、苯基、苄基、4，5或6个碳原子的正-烷基、(环己基)甲基、(3-羟甲基-3-甲基)烯丙基和3，3-二甲基烯丙基组成的一组。
10.按权利要求9所述的方法，其特征在于，分子式Ⅰ为激动素。
11.按权利要求10所述的方法，其特征在于，所述培养基中激动素的浓度为5ppm-50ppm。
12.改善衰老对哺乳动物细胞不良效应的组合物，其特征在于包括0.2ppm和200ppm之间的6-(取代氨基)嘌呤促细胞分裂素。
13.按权利要求12所述的组合物，其特征在于，该组合物为培养成纤维细胞的培养基。
14.按权利要求13所述的组合物，其特征在于适用于人体细胞。
15.按权利要求14所述的组合物，其特征在于，6-(取代氨基)嘌呤促细胞分裂素为分子式Ⅰ的化合物
其中R1选自由糠基、苯基、苄基、4、5或6个碳原子的正-烷基、(环己基)甲基、(3-羟甲基-3-甲基)烯丙基和3，3-二甲基烯丙基组成的一组。
16.按权利要求15所述的组合物，其特征在于其中化合物为激动素。
17.按权利要求16所述的组合物，其特征在于其中激动素的浓度为5ppm和50ppm之间。
18.按权利要求12所述的组合物，其特征在于，可被接受为人体口服或用于人的皮肤。
19.按权利要求18所述的组合物，其特征在于，该组合物为皮肤洗剂、软膏或霜剂。
20.按权利要求18所述的组合物，其特征在于，其中6-(取代氨基)嘌呤促细胞分裂素为分子式Ⅰ的化合物
其中R1选自由糠基、苯基、苄基、4，5或6个碳原子的正-烷基、(环己基)甲基、(3-羟甲基-3-甲基)烯丙基和3，3-二甲基烯丙基组成的一组。
21.按权利要求20所述的组合物，其特征在于，其中分子式Ⅰ的化合物为激动素。
22.按权利要求21所述的组合物，其特征在于，其中激动素的浓度为10ppm和100ppm之间。
全文摘要
本发明提供在培养细胞和活体细胞上抗衰老不良效应的方法，包括对所述细胞施用有效量的激动素或其它6-(取代氨基)嘌呤促细胞分裂素，它们已被揭示能延缓或逆转伴细胞衰老而出现的形态学改变而不明显提高细胞生长速率或总增殖能力，也提供实施该方法的组合物。优选的本发明应用为保持培养细胞的健康，和将含激动素的洗剂、软膏或霜剂用于人皮肤以保持皮肤的健康和年轻外观。
文档编号C07D473/34GK1068033SQ9110447
公开日1993年1月20日 申请日期1991年6月28日 优先权日1991年5月16日
发明者苏雷叙·I·S·拉滕 申请人:塞尼泰克,Plc