专利名称：乳猪胸腺蛋白及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是具有促进细胞增殖效应的动物胸腺蛋白，尤其是具有促进细胞增殖效应的乳猪胸腺蛋白，以及它们的制作方法和用途。
胸腺是一个分泌激素和产生多种细胞因子的免疫器官，由胸腺产生的一族多肽和蛋白质能控制调节着免疫反应的质和量。近年，国外对胸腺提取物的研究已引起重视。受胸腺活性物质能影响角膜及淋巴结上皮细胞增殖研究的启发，我们从乳猪胸腺中提取出一组中分子量水溶性蛋白质，简称胸腺蛋白，并对其进行促细胞增殖活性的研究。
1972年，Goldstein等人成功地从小牛胸腺中分离到一组能调节免疫系统的多肽，命名为胸腺肽F5，生化分析表明，胸腺F5是具有活性的单一肽类，均为小分子肽类成份，分子量均小于15000道尔顿，但Goldstein报道的方法中，需要有超高速离心，丙酮沉淀等过程，工艺复杂，很难推广使用。
1975年，Hooper等人在小牛胸腺肽的制备中第一次采用超滤技术，通过截留分子量小于15000道尔顿的胸腺肽组份来制备制剂，简化了提纯方法。
在这几年中，许多人对小牛胸腺肽的进一步分离有生物活性的单肽类作了大量的工作，从胸腺肽组织中分离的具有免疫活性成分的分子量如下表
从上述内容可以看出，目前已经公开的研究结果，主要集中在小分子胸腺肽，分子量小于15000道尔顿，还有的学者认为，胸腺中具有生物活性的成份均是分子量在6000道尔顿以下的较小的多肽。不难看出，目前所提取的胸腺肽主要是小分子量的，而且工艺条件复杂。有时还需要通过Sephader-150柱层纯化，也有人采用生理盐水浸提，冻融后经透析而成。
本发明的主要目的是利用包括离心分离，透析的方法，从乳猪胸腺中制取一组中分子量的乳猪胸腺蛋白。
本发明的另一目的是提供一种简单的方法，从而能有效的，可满足实际需要的来生产这种中分子量的乳猪胸腺蛋白。
本发明的再一个目的是利用上述中分子量的乳猪胸腺蛋白，并利用这种中分子量的乳猪胸腺蛋白所具有的生物活性，即具有促进细胞增殖的能力，可明显促进内皮细胞，成纤细胞的生长。
本发明还有一个目的，是利用这种中分子量乳猪的胸腺蛋白所具有的促进细胞增殖的能力，作为化状品的主要成份之一，可有效的促进人体表皮细胞的增殖和代谢，从而达到美容或类似的目的。
下面具体描述本发明所述的中分子量的乳猪胸腺蛋白的制备工艺。
首先，选用40-60天猪龄的健康乳猪的胸腺，拔除胸腺上的脂肪组织，将胸腺高速捣碎，所要注意的是，应在尽可能短的时间内完成这些工作，在此期间，匀浆属低温高速捣碎，将捣碎后的匀浆加温，温度保持在80-90℃之间，时间为10-30分钟，然后，离心分离，离心分离后去沉淀，留上清液，进行透析，所述的透析可以采用透析器，透析膜，也可以是其它能达到此目的的透析用具，透析膜或透析器的截留分子量为5万，然后再用截留分子量为3万的透析装置进行第二次透析，将二次透析的液体进行浓缩，再经过常规手段的处理，如除菌、分装，冻干，最后就得到了分子量在3-5万道尔顿的中分子胸腺蛋白。
上述实例是用来说明本发明工艺，而不是用来限制本发明，类似的方法都在本发明的范畴之内。
图1是不同浓度的乳猪胸腺蛋白(TP)对内皮细胞(EC)的增殖状况。
图2是不同浓度的乳猪胸腺蛋白(TP)对小鼠3T3成纤维细胞(FC)的增殖状况。
图3是乳猪胸腺蛋白(TP)、成猪胸腺蛋白(TP)、胸腺肽注射液(TF)、肝细胞生长素注射液(HGF)对内皮细胞的增殖效应。
图4是乳猪胸腺蛋白(TP)、成猪胸腺蛋白(TP)、胸腺肽注射液(TF)、肝细胞生长素注射液(HGF)对成纤维细胞的增殖效应。
图3、图4中1是乳猪胸腺蛋白(TP)、2是成猪胸腺蛋白(TP)、3是胸腺肽注射液(TF)、4是肝细胞生长素注射液(HGF)。
将上述方法制备的中分子胸腺蛋白进行各次试验，具体内容如下。
样品包括本发明中分子量的乳猪胸腺蛋白(TP)，分子量3-5万。胸腺肽注射液(TF)，由广东省生物制品研究所提供。促肝细胞生长素注射液由广东省阳江制药厂提供。内皮细胞(EC)的制备取健康产妇分娩后3小时内的脐带，用D-Hanks′液反复冲洗脐静脉至无血迹，灌入0.25%胰蛋白酶5ML，置37℃水浴内10分钟，收集消化液，用5ml含20%小牛血清的1640培养液冲洗脐静脉，收集冲洗液，将消化液及冲洗液合并收入离心管内，1000rpm，离心10分钟，去上清。加入内皮细胞培养液(内含20%小牛血清，200u/ml青霉素，0.2ug/ml链霉素，200ug/mlECGS)稀释沉淀细胞，将细胞接种于玻璃培养瓶内，置50%CO2，37℃细胞培养箱内培养，每2-3天换液一次。直至细胞单层形成，即进行传代培养。
传代培养时，用D-Hanks′液轻洗细胞单层2-3遍。用0.06%胰蛋白酶在室温下消化1-2分钟，弃消化液，加入内皮细胞培养液，并用吸管吹打20-30次，制成细胞悬液。以1∶2-3比率传代。用于实验的为2-3代细胞，经V因子相关抗原(VR.Ag)的抗体检测，确认为血管内皮细胞后方作为生物效应测定用细胞。
小鼠3T3成纤维细胞(FC)由第一军医大学珠江医院提供(培养基为1640培养基加20%小牛血清)。
本发明的乳猪胸腺蛋白生物效应测定每次取24孔塑料细胞培养板3块，于每个培养孔内(面积2cm)加入2X10个细胞，内皮细胞或成纤维细胞各72孔，将各检测样品(乳猪胸腺蛋白、成年猪胸腺蛋白、胸腺肽注射液(TF)、肝细胞生长素注射液(HGF)，按不同浓度(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/ml)分别加入3孔细胞中平行检测。每份样品设立3孔空白对照(与盐水做对照)。将上述细胞置5%CO2，37℃细胞培养箱内静置培养72小时，收获细胞，台盼蓝染色，计数每孔内活细胞数。计数方法为置显微镜下每孔随机计数5个高倍视野下的细胞数，取其均值，按下列等式换算成每平方厘米培养出的细胞数。
ECs/cm＝细胞计数均值/0.19625x100[ECs内皮细胞数，0.19625为每高倍镜视野(X400)面积，单位mm]，数据经统计学处理。
不同浓度的乳猪胸腺蛋白(TP)对内皮细胞(EC)、小鼠3T3成纤维细胞(FC)增殖状况见图1.图2。
图1、图2提示，本发明的乳猪胸腺蛋白(TP)对内皮细胞(EC)、小鼠3T3成纤维细胞(FC)均有明显的促增殖生物效应，与对照组比较有显著性差异(P＜0.01)，而且增殖效应与乳猪胸腺蛋白(TP)的最佳浓度有关(0.2mg-0.4mg/ml)。
各种不同检测样品对内皮细胞(EC)、小鼠3T3成纤维细胞(FC)增殖效应的影响比较，结果见图3，图4。
图3、图4提示1.本发明的乳猪胸腺蛋白(TP)有明显促进内皮细胞(EC)、小鼠3T3成纤维细胞(FC)增殖的作用。2.成年猪胸腺蛋白、胸腺肽注射液(TF)、促肝细胞生长素注射液(HGF)三种被检样品均无明显促内皮细胞(EC)、小鼠3T3成纤维细胞(FC)增殖活性，与对照组比较无明显差异(P＞0.05)。3.促肝细胞生长素注射液(HGF)对内皮细胞(EC)虽然有低水平的刺激现象，但与乳猪胸腺蛋白(TP)相比仍有显著性差异，与成年猪胸腺蛋白、胸腺肽注射液(TF)结果比较无明显意义。说明乳猪胸腺蛋白(TP)中确存在着一组能提高内皮细胞(EC)、小鼠3T3成纤维细胞(FC)增殖的活性组份。
自1966年Goldstein等首先研究小牛胸腺的丙酮提取物，1975年进一步用硫酸铵划分得到的Fr5以来，大多数学者均集中在小分子Fr5的理化特性，生物活性，作用机理、和开发利用方面的研究。对胸腺中分子及大分子蛋白类研究较少。本发明提取的中分子量乳猪胸腺蛋白(TP)经高效液相色谱分析共有6个组份峰、6条电泳带，紫外扫描在波长280nm中有一主要吸收峰，仍属一组中分子蛋白类混合物。本发明所述的中分子量乳猪胸腺蛋白(TP)提取方法简便，性质稳定，成本低，经用内皮细胞(EC)，小鼠3T3成纤维细胞(FC)连续增殖传代培养研究发现，乳猪胸腺蛋白(TP)中存在着一组能明显促进内皮细胞(EC)，小鼠3T3成纤维细胞(FC)增殖效应的活性组纷，而且出现增殖效应与乳猪胸腺蛋白(TP)的最佳浓度相关的现象。乳猪TP中是否存在着一组与内皮细胞生长因子(EGF)，成纤维细胞生长因子(FGF)相同或类似的或组份和结构不同而功能相同的物质，目前仍未明了。但从乳猪胸腺蛋白(TP)提取材料的来源，提取工艺和物质分子量结果分析推测，本发明的中分子量乳猪胸腺蛋白(TP)与目前国内外报道的小分子(分子量＜1.8万)多肽类物质，内皮细胞生长因子(EGF)，成纤维细胞生长因子(FGF)，胸腺肽注射液(TF)，促肝细胞生长素注射液(HGF)差异较大，而本发明图3，图4结果也表明，乳猪胸腺蛋白(TP)与成年猪胸腺蛋白(TP)、胸腺肽注射液(TF)、促肝细胞生长素注射液(HGF)的作用效应不同。
我们根据KomarovFI胸腺提取物与胃、十二指肠溃疡有关的报道，采用本发明所述的中分子量乳猪胸腺蛋白(TP)外用治疗口腔溃疡(1×1.2cm)，皮肤感染糜烂长期不愈伤口(4×5cm)的患者，乳猪胸腺蛋白(TP)表现出良好的抗感染和明显促进肉芽组织生长效果。研究初步表明本发明乳猪胸腺蛋白(TP)在实验室促内皮细胞(EC)、小鼠3T3成纤维细胞(FC)增殖效应与临床外用治疗促进伤口愈合的结果相吻合。本发明乳猪胸腺蛋白(TP)是一种还末受到重视的中分子蛋白，有明显促进内皮细胞(EC)、小鼠3T3成纤维细胞(FC)增殖的活性物质。至于胸腺蛋白本身的理化特性如何？乳猪胸腺与成年猪胸腺之间的差异，乳猪胸腺蛋白(TP)与目前国内外报道的各种细胞因子有什么内在联系仍需进一步全面的深入研究探索。我们认为开展对乳猪胸腺中分子蛋白类的实验研究有着新的广阔前景，而且对进一步开发应用乳猪胸腺有十分重要的价值。
我们采用中分子乳猪胸腺蛋白初步临床应用于治疗口腔溃疡及皮肤损伤取得了良好效果。用注射用水稀释中分子乳猪胸腺蛋白至浓度为2mg/ml的水溶液。10例口腔溃疡患者应用该液体涂抹溃疡表面，每日2-3次。治疗1-3日，10例患者(2例治疗1天后，6例2天后，2例3天后)溃疡疮面均完全愈合，并无感染现象发生，较同期对照组(治疗4-5天后愈合)疗效显著。另有3例皮肤损伤患者用以该品水溶液浸湿的纱布局部外敷皮肤疮面，每天换药一次，连续敷用4-5日后，发现其中2例感染糜烂伤口有新生的肉芽组织及表皮生成，疮面炎性渗出及红肿明显消除。结果提示胸腺蛋白有良好的抗感染和明显促进肉芽组织生长的效果，这与胸腺蛋白实验室促进内皮细胞(EC)、小鼠3T3成纤维细胞(FC)的增殖效应相吻合。
图3，4方框中空白为试样，阴影为对照。
权利要求
1.一种中分子量乳猪胸腺蛋白，其特征在于本发明所述的中分子量乳猪胸腺蛋白(TP)经高效液相色谱分析共有6个组份峰、6条电泳带，紫外扫描在波长280nm中有一主要吸收峰，本发明所述的中分子量乳猪胸腺蛋白(TP)的分子量在3-5万道尔顿之间。
2.权利要求1所述的中分子量乳猪胸腺蛋白的制备工艺，包括选料、捣碎、离心分离、透析、浓缩、除菌、分装，冻干，其特征在于首先选用40-60天猪龄的健康乳猪的胸腺，拔除胸腺上的脂肪组织，将胸腺高速捣碎，所要注意的是，应在尽可能短的时间内完成这些工作，在此期间，匀浆属低温高速捣碎，将捣碎后的匀浆加温，温度保持在80-90℃之间，时间为10-30分钟，然后，离心分离，离心分离后去沉淀，留上清液，进行透析，，透析的截留分子量为5万，然后再用截留分子量为3万的透析装置进行第二次透析，将二次透析的液体进行浓缩。
3.权利要求2所述的中分子量乳猪胸腺蛋白的制备工艺，其特征在于所述的透析可以采用透析器，透析膜，也可以是其它能达到此目的的透析用具。
4.权利要求1所述的中分子量乳猪胸腺蛋白的用途，其特征在于所述的中分子量的乳猪胸腺蛋白，并利用这种中分子量的乳猪胸腺蛋白所具有的生物活性，即具有促进细胞增殖的能力，可明显促进内皮细胞，成纤细胞的生长。
5.权利要求1所述的中分子量乳猪胸腺蛋白的用途，其特征在于所述的中分子量乳猪的胸腺蛋白具有的促进细胞增殖的能力，作为化状品的主要成份之一，可有效的促进人体表皮细胞的增殖和代谢，从而达到美容或类似的目的。
全文摘要
本发明涉及的是具有促进细胞增殖效应的动物胸腺蛋白，尤其是具有促进细胞增殖效应的乳猪胸腺蛋白，以及它们的制作方法和用途。本发明主要是利用包括离心分离，透析的方法，从乳猪胸腺中制取一组具有促进细胞增殖的能力、可明显促进内皮细胞、成纤细胞生长的中分子量乳猪胸腺蛋白。本发明还有一个目的是利用这种中分子量乳猪胸腺蛋白所具有的促进细胞增殖的能力，作为化妆品的主要成分之一，可有效的促进人体表皮细胞的增殖和代谢，从而达到美容或类似的目的。
文档编号C07K1/14GK1081445SQ9210564
公开日1994年2月2日 申请日期1992年7月18日 优先权日1992年7月18日
发明者陈光明, 杨富强, 谢汝锦, 邵岩, 张宜俊 申请人:中国人民解放军空军广州医院