专利名称：转导醛脱氢酶-1基因的反转录病毒载体及其应用的制作方法
本申请是1993年4月1日申请的美国申请系列号08/041,722的部分继续，该申请的内容引入本文作为参考。
在本申请书中所参考的文献均在括号注明了作者姓名和发表年份，在说明书的末尾部分及权利要求书之前列出了这些文献的引文全称。这些文献的所有研究结果经授权在此合并于本申请书中，以便更详细地介绍本发明所涉及的工艺过程。
背景技术：
自体骨髓移植疗法近来的研究进展表明，用骨髓毒性因子(药物或放射线)治疗的病人经自体末梢血液(CD34+)“干细胞”再注射后其造血功能可迅速恢复正常(Gianni，el al.，Lancet 2580，1989)。此外，最近已有报道用表达特定基因的反转录病毒载体可使CD34+细胞在体外高效转导(Bregni，et al.，Blood 801418，1992)。在体外将特定基因转导到病人自体CD34+细胞中，然后再移植到病人体内，可用来转导具有治疗意义的基因，上述技术为这些方法开辟了新的途径。这种基因疗法包括抗药物毒性造血细胞的重建，可用更高剂量的骨髓毒性化疗继续治疗癌症病人。
发明概述本发明提供了含有编码人类细胞溶质醛脱氢酶的核酸分子的载体。
此外，本发明提供了含有编码人类谷氨酰半胱氨酸合成酶的核酸分子的载体。
此外，本发明提供了含有编码人类细胞溶质醛脱氢酶的核酸分子的反转录病毒载体。
此外，本发明提供了含有编码人类谷氨酰半胱氨酸合成酶的核酸分子的反转录病毒载体。
此外，本发明提供了含有编码人类细胞溶质醛脱氢酶和谷氨酰半胱氨酸合成酶的核酸分子的载体。
此外，本发明提供了降低环磷酰胺对病人毒性作用的方法，该方法包括用含有反转录病毒载体的造血细胞来替换病人的造血细胞，所述载体中含有编码人类细胞溶质醛脱氢酶的核酸分子以便降低环磷酰胺对病人的毒性作用。
此外，本发明提供了将选择性标记导入哺乳动物细胞的方法，该方法包括用编码人类细胞溶质醛脱氢酶的核酸分子来转染细胞。
此外，本发明提供了表达所需蛋白质的哺乳动物细胞的选择方法，该方法包括(a)将核酸分子导入细胞，包括编码所需蛋白质的核酸分子和编码人类细胞溶质醛脱氢酶的核酸分子；(b)培养由此转染的细胞；(c)选择表达人类细胞溶质醛脱氢酶的细胞，由此获得表达所需蛋白质的细胞。
此外，本发明提供了降低环磷酰胺对病人毒性作用的方法，该方法包括用含有反转录病毒载体的造血细胞来替换病人造血细胞，所述载体中含有编码人类谷氨酰半胱氨酸合成酶的核酸分子，以便降低环磷酰胺对病人的毒性作用。
此外，本发明提供了将选择性标记导入哺乳动物细胞的方法，该方法包括用编码人类谷氨酰半胱氨酸合成酶的核酸分子来转染细胞。
此外，本发明提供了表达所需蛋白质的哺乳动物细胞的选择方法，该方法包括(a)将核酸分子导入细胞，包括编码所需蛋白质的核酸分子和编码人类谷氨酰半胱氨酸合成酶的核酸分子；(b)培养由此转染的细胞；(c)选择表达人类谷氨酰半胱氨酸合成酶的细胞，由此获得表达所需蛋白质的细胞。
此外，本发明提供了分离的编码细胞溶质醛脱氢酶的哺乳动物核酸分子，该分离的哺乳动物核酸分子与图4所示的序列(SEQ ID No.1)基本相同。
此外，本发明提供了分离的编码谷氨酰半胱氨酸合成酶的哺乳动物核酸分子，该分离的哺乳动物核酸分子与图6所示的序列(SEQ IDNo.3)基本相同。
此外，本发明提供了由至少15个核苷酸组成的核酸分子，它可以与分离的编码细胞溶质醛脱氢酶或谷氨酰半胱氨酸合成酶的哺乳动物核酸分子中核酸分子序列进行特异性杂交。
此外，本发明提供了检测细胞中醛脱氢酶表达的方法，该方法包括提取细胞中的全部mRNA，在杂交条件下将由此提取的mRNA与分离的编码细胞溶质醛脱氢酶的哺乳动物核酸分子中标记的核酸分子相接触，测定与所述分子杂交的mRNA的存在，由此来检测细胞中细胞溶质醛脱氢酶的表达。
此外，本发明提供了生产具有哺乳动物细胞溶质醛脱氢酶生物活性多肽的方法，该方法包括在适宜于多肽生产及回收的条件下使宿主载体系统的宿主细胞生长。
此外，本发明提供了检测细胞中谷氨酰半胱氨酸合成酶表达的方法，该方法包括提取细胞中的全部mRNA，在杂交条件下将由此提取的mRNA与分离的编码谷氨酰半胱氨酸合成酶的哺乳动物核酸分子中标记的核酸分子相接触，测定与所述分子杂交的mRNA的存在，由此来检测细胞中谷氨酰半胱氨酸合成酶的表达。
此外，本发明提供了生产具有哺乳动物谷氨酰半胱氨酸合成酶生物活性多肽的方法，该方法包括在适于多肽生产和回收条件下使宿主载体系统的宿主细胞生长。
此外，本发明提供了抗氨基酸分子，即细胞溶质醛脱氢酶的抗体。
此外，本发明提供了抗氨基酸分子，即谷氨酰半胱氨酸合成酶的抗体。
此外，本发明提供了测定生物样本中哺乳动物细胞溶质醛脱氢酶含量的免疫检验法，其步骤为(a)使生物样本与至少一种抗体，或是单克隆抗体，或是多克隆抗体相作用，形成该抗体与细胞溶质醛脱氢酶的复合物，(b)测定该复合物的含量便得到该生物样本中细胞溶质醛脱氢酶的含量。
此外，本发明提供了含有分离的编码细胞溶质醛脱氢酶或谷氨酰半胱氨酸合成酶的哺乳动物核酸分子的非人类转基因哺乳动物。
此外，本发明提供了非人类转基因哺乳动物，其基因组中含有与编码细胞溶质醛脱氢酶DNA互补的反义DNA，如此设计的目的是将其转录成与编码细胞溶质醛脱氢酶mRNA互补的反义mRNA，并其与编码哺乳动物细胞溶质中醛脱氢酶的mRNA杂交，由此降低其翻译功能。
此外，本发明提供了非人类转基因哺乳动物，其基因组中含有与编码谷氨酰半胱氨酸合成酶DNA互补的反义DNA，如此设计的目的是将其转录成与编码谷氨酰半胱氨酸合成酶mRNA互补的反义mRNA，使其与编码哺乳动物谷氨酰半胱氨酸合成酶的mRNA杂交，由此降低其翻译功能。
此外，本发明提供了测定生物样本中哺乳动物谷氨酰半胱氨酸合成酶含量的免疫检验法，其步骤为(a)将生物样本与至少一种抗体，或者单克隆抗体，或者多克隆抗体相作用，形成该抗体与谷氨酰半胱氨酸合成酶的复合物，(b)测定该复合物含量便得到该生物样本中谷氨酰半胱氨酸合成酶的含量。
图的简介
图1 pLAldo-SN质粒的构建，其中ALDH1＝人类细胞溶质中醛脱氢酶1，pG＝pGEM，B＝BamHl，Bg＝BglII，S＝SalI，E＝EcoRI，X＝XbaI，Xh＝Xhol，H＝HpaI。图2 pLAldo-X质粒的构建。图3 吗磷酰胺抗性的pLAldo-SN转录的K562细胞(Lozzio andLozzio，1975)。MPA是吗磷酰胺。图表示三次不同实验均值±标准差。图4 全长1842bp的醛脱氢酶(Aldh-1)cDNA序列的核苷酸序列(SEQ ID NO.1)。框架内翻译终止密码子，tag(下划线)位于翻译起始密码子(ATG)之前。图5 醛脱氢酶(Aldh-1)氨基酸序列(SEQ ID No.2)。图6 全长2904bp的谷氨酰半胱氨酸合成酶(r-GCS)cDNA序列的核苷酸序列(SEQ ID No.3)。框架内翻译终止密码子，tag(下划线)位于翻译起始密码子(ATG)之前。图7 谷氨酰半胱氨酸合成酶(r-GCS)氨基酸序列(SEQ ID No.4)。图8 pLGCS-X质粒的构建。
发明详细介绍在本申请书中所提到的特定的核苷酸是指存在于核酸分子编码链中的核苷酸。在本发明书中用下列标准缩写来表示特定的核苷酸C＝胞嘧啶 A＝腺苷T＝脱氧胸苷 G＝鸟苷“基因”是指核酸分子，其序列包含正常调控特定蛋白质合成所需的全部信息，其中包括结构编码序列，启动子和增强子。
本发明的DNA分子也包括编码多肽类似物和抗原性多肽的片段或衍生物的DNA分子，所述多肽类似物和抗原性多肽片段或衍生物在一个或多个氨基酸残基的标志或位置方面与天然形式不同(缺失类似物所含残基少于该蛋白质所需的全部特定残基，替代类似物中一个或多个特定残基被其它残基所替换，添加类似物中有一个或多个氨基酸残基添加到该多肽的末端或中间部分)，但是具有天然多肽的某些或全部特性。这些分子包括掺入对于所选的非哺乳动物宿主的表达“优选的”密码子；提供限制性内切核酸酶的切割位点；提供有利于表达载体构建的额外的起始、末端或中间DNA序列。
在此描述和要求的DNA分子之所以适用，是由于它们可提供关于多肽氨基酸序列的信息，而且作为用多种重组技术大规模多肽合成的产物。这种分子适用于产生新的克隆和表达载体、转化和转染的原核和真核宿主细胞，以及新的有用的培养生长能够表达多肽和有关产物的宿主细胞的方法。
本发明提供了含有编码人类细胞溶质醛脱氢酶核酸分子的载体，该核酸分子是插入到其复制非必需载体区域内的某一位点。载体可以是病毒载体，而且病毒载体可以是双链DNA载体。
在一个实施方案中上述核酸分子是RNA，在另一个实施方案中核酸分子是DNA，在进而的实施方案中DNA分子是基因组DNA，在再后面的实施例中DNA分子是cDNA。此外，编码细胞溶质醛脱氢酶的核酸分子与图4所示的序列(SEQ ID No.1)基本相同。
此外，本发明提供了含有编码人类细胞溶质醛脱氢酶核酸分子的反转录病毒载体，该核酸分子是插入其复制非必需载体区域内的某一位点。载体可以是反转录病毒载体，而且反转录病毒载体可以是双链DNA反转录病毒载体。
在本发明中所用的人类细胞溶质醛脱氢酶可与人类醛脱氢酶1交换使用，此外，人类细胞溶质醛脱氢酶是指全长的人类细胞溶质醛脱氢酶。
本发明提供了上述反转录病毒载体，其中载体包括相当于两个长末端重复片段的小鼠病毒DNA和包装信号。在一个实施方案中小鼠病毒是Moloney小鼠白血病病毒，在另一个实施方案中小鼠病毒是Moloney小鼠肉瘤病毒，在另一实施方案中3′长末端重复片段与Moloney小鼠白血病病毒出现的重复片段一致，5′长末端重复片段与Moloney小鼠肉瘤病毒出现的重复片段一致。
载体包括，但并不局限于腺病毒、猴病毒40(SV40)、巨细胞病毒(CMV)、小鼠乳腺癌病毒(MMTV)、Moloney小鼠白血病病毒、小鼠肉瘤病毒、Rous肉瘤病毒、DNA传递系统，即脂质体、表达质粒传递系统。
本领域熟知包装信号可以含有对于基因表达很重要的剪接供体和剪接受体。
反转录病毒载体还可以含有相当于第二种哺乳动物基因的DNA序列。第二种哺乳动物基因是从哺乳动物细胞中获得的，它能编码哺乳动物细胞正常表达的蛋白质。第二种哺乳动物基因可以是与DNA表达的启动子或基因组DNA序列可操作相连的cDNA序列。在本发明的一个实施方案中第二种哺乳动物基因是编码非选择性表型的基因，这里所说的非选择性表型“是指不能用药物、加热或其它常规应用的选择加压等常规方法来选择基因表达。非选择性表型意味着系统含有细胞混合物，其中某些含有非选择性表型阳性细胞，其中某些则含有阴性细胞，这种系统不能用常规方法来处理，诸如处理后只保留非选择性表型阳性细胞的常规方法。根据本发明的实践根据本发明用于编码非选择性表型的基因包括胰岛素基因、β-珠蛋白基因和主要的组织相容性基因。然而，本发明的实践并不局限于在反转录病毒载体中仅插入这些基因。适合于包含在反转录病毒载体中和适合子插入哺乳动物细胞的其它哺乳动物基因也包括在本发明的实践中。
第二种哺乳动物基因可用反转录病毒包装细胞借助反转录病毒载体的携带将其包装进反转录病毒颗粒中。选择能够产生足够高滴度的反转录病毒颗粒的反转录病毒包装细胞可使该细胞能够用于将所需基因转导给受体细胞的方法中(Banket et al.U.S.专利号5,278,056，1994年1月11日发行)。
此外，本发明提供了含有编码人类谷氨酰半胱氨酸合成酶核酸分子的载体，该核酸分子插入在载体中其复制非必需区域内的位点。该载体可以是病毒载体。而该病毒载体可以是双链DNA病毒载体。
在一个实施方案中上述核酸分子是RNA，在另一实施方案中核酸分子是DNA，在另一实施方案中DNA分子是基因组DNA，在再后面的实施方案中DNA分子是cDNA。此外，编码谷氨酰半胱氨酸合成酶的核酸分子与图6所示的序列(SEQ ID NO.3)基本相同。
此外，本发明提供了反转录病毒载体，它含有编码人类谷氨酰半胱氨酸合成酶核酸分子，该核酸分子是插入在载体中其复制非必需区域内的某一位点。该载体可以是反转录病毒载体。此外，该反转录病毒载体可以是双链DNA反转录病毒载体。
在一个实施方案中本发明提供了含有双链DNA反转录病毒载体的质粒，该载体含有编码人类细胞溶质醛脱氢酶的cDNA，所述cDNA是插入在载体中其复制非必需区域内的某一位点。
此外，本发明提供了含有醛脱氢酶或谷氨酰半胱氨酸合成酶病毒载体或反转录病毒载体的质粒。在实施方案中该质粒被命名为pLAldo-SN(ATCC注册号69238)。质粒pLAldo-SN导入E.coliHB101，并按照国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约的规定于1993年2月10日保存于美国典型培养物收集中心(ATCC)，12301 Parklawn DriveRockville，Maryland 20852，U.S.A。含有pLAldo-SN的E.coliHB101的ATTC注册号为69238。在另一个实施方案中质粒被命名为pLAldoX。
此外，本发明提供了命名为pLGCS-X的质粒(ATCC注册号＿＿＿)。将质粒pLGCS-X导入E.coliDH5α，并按照国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约的规定于1994年3月24日保存于美国典型培养物收集中心(ATCC)，12301 Parklawn Drive，Rockyille，Maryland 20852，U.S.A。
本发明还提供了含有双链DNA反转录病毒载体的哺乳动物反转录病毒生产细胞，该载体中含有编码人类细胞溶质醛脱氢酶的cDNA，所述cDNA是插入在载体中其复制非必需区域内某一位点，即pLAldo-SN质粒或pLAldoX质粒。
在一个实施方案中将pLAldo-SN导入PA317细胞，形成的生产细胞命名为pLAldo-SN PA317cl.6。按照国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约的规定，这一细胞系，pLAldo-SN PA317cl.6于1993年2月10日保存于美国典型培养物收集中心(ATCC)，12301Parklawn Drive，Rockyille，Maryland 20852，U.S.A。含有pLAldo-SN的PA317细胞ATCC注册号为CRL 11265。
本发明还提供了含有双链DNA反转录病毒载体的人类细胞，该载体载有编码人类细胞溶质醛脱氢酶的cDNA，所述cDNA是插入在载体中其复制非必需区域内的某一位点即pLAldo-SN质粒或pLAldo质粒。在一个实施方案中人类细胞是人造血细胞。在另一个实施方案中人类细胞是骨髓细胞。
此外，本发明提供了能够生产具有细胞溶质醛脱氢酶生物活性的多肽的宿主载体系统，该系统包括质粒和适当的宿主。宿主载体系统可以是细菌细胞、昆虫细胞、病毒寄生细胞或哺乳动物细胞。质粒可以是以上讨论的pLAldo-SN或pLAldo。
核酸分子可以是DNA、RNA、cDNA。而且编码人类细胞溶质醛脱氢酶的核酸分子与图4所示序列(SEQ ID No.1)基本相同。
此外，本发明提供了能够生产具有谷氨酰半胱氨酸合成酶生物活性的多肽的宿主载体系统，该系统包括质粒和适当的宿主。
此外，本发明提供了将选择性标记导入哺乳动物细胞的方法，该方法包括用编码人类谷氨酰半胱氨酸合成酶的核酸分子转染细胞。核酸分子可以是DNA分子、RNA分子或cDNA分子。
核酸分子可以是DNA、RNA、cDNA，而且编码人类谷氨酰半胱氨酸合成酶的核酸分子与图6所示序列(SEQ ID No.1)基本相同。
本发明提供了降低环磷酰胺对病人毒性作用的方法，该方法是用载有细胞溶质醛脱氢酶基因的造血细胞来替换病人造血细胞，以便降低环磷酰胺对病人的毒性作用。
在此所用的环磷酰胺是环磷酰胺、或其衍生物、或其类似物，都是有效的癌症化疗制剂，其作用机理或方式与环磷酰胺相同。这种衍生物的实例之一便是吗磷酰胺。
制备带有细胞溶质醛脱氢酶(Aldh1)基因的造血细胞的方法是将双链DNA反转录病毒载体导入造血细胞，该载体含有编码人类细胞溶质醛脱氢酶的cDNA，而且cDNA是插入于该载体中其复制非必需区域内的某一位点。可以将载有Aldh1基因的反转录病毒载体导入包装细胞来获得生产病毒的细胞系，然后可用获得的病毒来感染造血细胞。本领域专业人员所熟悉的其它导入Aldh1基因的方法也包括在本发明中。根据本发明可以使用的方法之一是电穿孔法，及其它方法，包括但不限于磷酸钙沉淀技术、其它病毒载体系统诸如腺病毒有关的病毒系统，脂染法和显微注射法。
本发明还提供了将选择性标记导入哺乳动物细胞的方法，包括用编码人类细胞溶质醛脱氢酶的DNA来转染细胞。
此外，本发明提供了选择表达所需蛋白质的哺乳动物细胞的方法，该方法包括(a)将包括编码所需蛋白质的DNA和编码人类细胞溶质醛脱氢酶的DNA的DNA分子导入细胞；(b)培养由此转导的细胞；(c)选择表达人类细胞溶质醛脱氢酶的细胞，以便获得表达所需蛋白质的细胞。在实施方案中上述方法步骤(a)中的DNA分子是反转录病毒载体的一部分。
此外，本发明提供了选择表达所需蛋白质的哺乳动物细胞的方法，该方法包括(a)将包括编码所需蛋白质的核酸分子和编码人类谷氨酰半胱氨酸合成酶的核酸分子的核酸分子导入细胞；(b)培养由此转录的细胞；(c)选择表达人类谷氨酰半胱氨酸合成酶的细胞，以便获得表达所需蛋白质的细胞。核酸分子可以是DNA分子、RNA分子或cDNA分子。
核酸分子可以是DNA、RNA、cDNA，而且编码人类谷氨酰半胱氨酸合成酶的核酸分子与图6所示的序列(SEQ ID No.3)基本相同。
此外，末发明提供了分离的编码细胞溶质醛脱氢酶的哺乳动物核酸分子。分离的哺乳动物核酸分子与图4所示的序列(SEQ ID No.1)基本相同。分离的核酸分子可以是DNA、RNA或cDNA，而且可以从人类分离的核酸分子。
此外，本发明提供了分离的编码谷氨酰半胱氨酸合成酶的哺乳动物核酸分子。分离的哺乳动物核酸分子与图4所示的序列(SEQ IDNo.1)基本相同。分离的核酸分子可以是DNA、RNA或cDNA，而且可以从人类分离的核酸分子。
此外，本发明提供了能够与分离编码细胞溶质醛脱氢酶或谷氨酰半胱氨酸合成酶的哺乳动物核酸分子中核酸分子序列进行特异性杂交的含有至少15个核苷酸的核酸分子。该核酸分子可以是DNA、RNA或cDNA。
这种生成的核酸分子既可以是DNA也可以是RNA。这里所用的术语“特异性杂交”是指核酸分子识别与其互补的核酸序列并且通过互补碱基对之间的氢键形成双螺旋片段的能力。
本领域专业人员都很熟悉核酸探针技术并且很了解这些探针在长度上可以大不相同，而且可以用可检测标记来标记，例如放射性同位素或荧光染色，以便检测探针DNA探针分子可用下述方法制得将编码醛脱氢酶的DNA分子插入到适当的载体中，例如质粒或噬菌体，然后将其转化到适当的细菌宿主细胞中使其在转化的细菌宿主细胞中复制，再用本领域熟知的方法收获DNA探针。除此之外，还可以用DNA合成仪用化学法合成探针。
此外，一发明提供了检测醛脱氢酶在细胞中表达的方法，该方法包括提取细胞中的全部mRNA，在杂交条件下，将由此获得的mRNA与分离的编码细胞溶质醛脱氢酶的哺乳动物核酸分子中标记的核酸分子相作用，确定与分子杂交的mRNA的存在，由此检测细胞中细胞溶质醛脱氢酶的表达。
此外，本发明提供了生产具有哺乳动物细胞溶质醛脱氢酶生物活性的多肽的方法，该方法包括在多肽产生及回收由此产生的多肽的适当条件下使宿主载体系统中宿主细胞的培养生长。
此外，本发明提供了检测谷氨酰半胱氨酸合成酶在细胞中表达的方法，该方法包括提取细胞中的全部mRNA，在杂交条件下将由此获得的mRNA与分离的编码谷氨酰半胱氨酸合成酶的哺乳动物核酸分子中的标记核酸分子相作用，确定与分子杂交的mRNA的存在，由此检测细胞中谷氨酰半胱氨酸合成酶的表达。
此外，本发明提供了生产具有哺乳动物谷氨酰半胱氨酸合成酶生物活性的多肽的方法，该方法包括在多肽产生和回收由此产生的多肽的适当条件下，使宿主载体系统中宿主细胞的培养生长。
许多哺乳动物细胞均可作为宿主，包括但不限于小鼠成纤维细胞NIH 3T3、CHO细胞、HeLa细胞、Ltk细胞、Cos细胞等。像已介绍的supra一类的表达质粒可用本领域熟知的方法如磷酸钙沉淀法、电穿孔法等用上文描述的表达质粒来转染哺乳动物细胞，或者用例如用显微注射法将编码哺乳动物醛脱氢酶的DNA导入哺乳动物细胞，由此获得含有编码哺乳动物醛脱氢酶的DNA(例如cDNA或质粒)的哺乳动物细胞。
此外，本发明提供了抗氨基酸分子，即细胞溶质醛脱氢酶的抗体。其氨基酸序列与图5所示的序列(SEQ ID No.2)基本相同。所述抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。
用选择的肽经免疫动物可生产抗这些肽的多克隆抗体。单克隆抗体用杂交瘤技术来制备，即用能产生抗体的免疫动物B细胞与骨髓瘤细胞融合，然后选择由此建立的能够产生所需抗体的杂交瘤细胞系。除此之外，可用本领域专业人员熟知的体外技术来制备单克隆抗体。可用这些抗体检测活体动物中、人体中、或从动物或人体分离的生物组织或体液中，哺乳动物醛脱氢酶的表达。
此外，本发明提供了抗氨基酸分子，即谷氨酰半胱氨酸合成酶的抗体。其氨基酸序列与图7所示顺序(SEQ ID No.4)基本相同。所述抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。
此外，本发明提供了测定生物样本中哺乳动物细胞溶质醛脱氢酶含量的免疫检验法，其步骤包括(a)使生物样本与至少一种抗体，或是单克隆抗体，或是多克隆抗体相接触，形成该抗体与细胞溶质醛脱氢酶的复合物，(b)测定该复合物含量便可测得该生物样本中细胞溶质醛脱氢酶的含量。
此外，本发明提供了含有分离的编码细胞溶质醛脱氢酶的哺乳动物核酸分子的转基因非人类哺乳动物。
此外，本发明提供了转基因非人类哺乳动物，其基因组中含有与编码细胞溶质醛脱氢酶DNA相互补的反义DNA，如此设计目的是使其转录成与编码细胞溶质醛脱氢酶的mRNA相互补的反义mRNA，并与编码哺乳动物细胞溶质醛脱氢酶的mRNA杂交，由此可降低其翻译功能。此外，分离的编码人类细胞溶质醛脱氢酶核酸分子与图4所示的序列(SEQID No.1)基本相同。
此外，本发明提供了测定生物样本中哺乳动物谷氨酰半胱氨酸合成酶含量的免疫检验法，其步骤包括(a)将生物样本与至少一种抗体，或者单克隆抗体，或者多克隆抗体相接触，形成该抗体与谷氨酰半胱氨酸合成酶的复合物，(b)测定该复合物的含量便可测得该生物样本中谷氨酰半胱氨酸合成酶的含量。
此外，末发明提供了含有分离的编码谷氨酰半胱氨酸合成酶的哺乳动物核酸分子的转基因非人类哺乳动物。
此外，本发明提供了转基因非人类哺乳动物，其基因组中含有与编码谷氨酰半胱氨酸含成酶的DNA相互补的反义DNA，如此设计目的是使其转录成与编码谷氨酰半胱氨酸合成酶的mRNA相互补的反义mRNA，并与编码哺乳动物谷氨酰半胱氨酸合成酶的mRNA杂交，由此可降低其翻译功能。此外，分离的编码人类谷氨酰半胱氨酸合成酶的核酸分子与图6所示序列(SEQ ID No.3)基本相同。
本发明的目的如下采用特异的抗癌药物进行化疗对于人类多种癌症都是一种应用广泛而且十分有效的治疗方法，然而，多数化疗都具有副作用，因而极大地限制了其疗效而且导致应用的危险。尤其是化疗引起的血细胞减少，即正常造血功能的抑制(骨髓抑制)导致的白细胞和血小板的生成减少已成为癌症治疗中发病、死亡和剂量不足的主要因素。可以认为如果能够避免化疗引起的血细胞减少将会降低癌症化疗的危险，最为可观的是有可能使用更高的剂量来治疗，以达到更高的治愈率。
本发明的目的在于解决由广泛应用的化疗药物环磷酰胺(CP)及其类似物而引起的血细胞减少的问题。CP是一种对于多种人类肿瘤疗效显著的抗癌药物，其疗效取决于剂量，具有明显的剂量-效应关系，其剂量-极限毒性是骨髓抑制。治疗CP引起的血细胞减少目前采用的是间接策略，主要是应用能够刺激骨髓再生的特异性生长因子来加速恢复被抑制的造血功能。本发明的目的在于通过提供对药物毒性作用具有抗性的造血细胞来直接克服由环磷酰胺引起的血细胞减少症。
本发明的策略是通过基因的导入和表达来生产对环磷酰胺(CP)及其类似物有抗性的造血细胞，所述基因蛋白质产物可将环磷酰胺(CP)代谢成无毒性的失活化合物。对几个细胞系的研究表明醛脱氢酶(Aldh)与CP代谢及CP抗性有关(i)CP的细胞毒性代谢产物是通过含有醛的中间产物而产生的，而这种中间产物可由Aldh来灭活(Struck et al.，1975；Colvin et al.，1976；Cox et al.，1975；Hill et al.，1972)；(ii)已经多次观察到Aldh的活性水平与各种不同细胞系的抗CP毒性的能力相关(Cox et al.，1975；Hilton1984；Lin et al.，1988)；(iii)Aldh活性抑制剂可提高对CP毒性的敏感性(Sladek and Landkamer，1985；Kohn and Sladek，1987；Sahovic et al.，1988)。此外，已经证实多数未成熟造血细胞可表达Aldh1，而在其功能成熟的子代细胞，包括白细胞、血小板和红细胞中这种功能却是进行性减退的(Kastan et al.，1990)，这种功能减退与血细胞对CP的敏感性相关。因此，如果在造血细胞前体中适当表达Aldh1，则可使其本身和其子代细胞具有CP抗性。
基于这些观察结果，便设计了携带并能表达人类Aldh1基因的反转录病毒载体。反转录病毒载体可将基因转导入人类造血细胞前体中(Bregni et al.，1992)，化疗后通过自体骨髓移植，使所述造血细胞前体用于骨髓重新增殖(Gianni et al.，1989)。
本发明的目的是建立能够提供对抗癌药物环磷酰胺抗性的反转录病毒载体。通过使用人类醛脱氢酶基因来达到该目的。已经证明这种基因能提供对环磷酰胺及其抗癌类似物的抗性。人类Aldh1全长cDNA现在已经被分离并用来建立了第一个载体，该载体已证明能够在体外将特异的抗药表型转导入多种靶细胞，包括人类CD34+细胞(图4，SEQID No.1)(参见实验细节I)。
化疗制剂包括，但并不局限于烷化剂、即氮芥、氮丙啶和甲密胺、烷基磺酸盐、亚硝基脲和三氮烯。此外，化疗制剂还包括抗代谢药物，即叶酸类似物、嘧啶类似物、嘌呤类似物及有关抑制剂。
此外，化疗制剂还包括天然产物，即长春花生物碱、表鬼臼毒素、抗生素、酶、生物效应修正因子。化疗制剂还包括各种制剂，即氯氨铂配位复合物、蒽二酮、脲取代物、甲基肼衍生物和肾上腺皮质抑制剂。最后，化疗制剂还包括激素和拮抗剂，即肾上腺皮质类固醇、孕激素、雌激素、抗雌激素、雄激素、抗雄激素和促性腺激素释放激素类似物。
除用于抗癌治疗方案之外，许多研究均提出用CP作为选择剂，ALDH基因在体内和体外还可用作通用的选择性标记以选择转导细胞(i)CP在体外对于多种真核细胞均表现出明显的细胞毒性作用；(ii)烷化剂抗药性的出现较为罕见而出现较晚，尤其在体外；(iii)用药后短期内CP即可杀死敏感细胞，而在很短的时间内其毒性作用就变得很明显。因此，载有可被表达的Aldh基因及有关的第二种基因的反转录病毒载体不仅可用于在体内从多种靶组织中选择转导细胞，而且在体外也可用于转导细胞的选择。在需要大量连续选择转导细胞的情况下，这种载体的体外应用可能对于多种基因治疗方案的设计都是适用的。CP已证实是对人类疗效可靠的药物，这一点说明了本发明策略的另一优势。
Aldh1基因可用作显性选择性标记使得能够在体外和体内选择用所需的第二种基因转化的细胞。在基因转移实验中需要选择性标记基因是因为通常的转移方法效率低而且突变和重排的频率高，导致转导基因功能很快失活。用通常方法，含有所需基因并能长时间以功能形式表达该基因的细胞比例很小，而选择性标记基因则可提供增加这种细胞比例的方法。建立选择系统使其应用于靶细胞的范围尽可能的广泛，这已成为基因转移研究的主要目标，各种大量的项目申请而且数量在不断增长就清楚地说明了这一点。
与不相关的非选择性所需基因共同转导入环磷酰胺敏感性细胞后，Aldh1基因有希望成为很有价值的显性选择性标记。要治疗像ADA缺陷型或β-地中海贫血这样的遗传病，必需研制一种使用有关缺陷基因(即ADA或β-珠蛋白基因，调节序列可有可无)转导的少量造血干细胞在体内优先增殖的方法。实际上，得到的少量的用于体外实验的干细胞即使其转导率假设为100％，这也只是占宿主骨髓中未改变的总的驻留干细胞库的小部分。为了利于转导细胞的移植而采用离子放射和/或骨髓腐蚀剂来破坏受体骨髓对于像ADA缺陷和β-地中海贫血这样的非肿瘤疾病是不太可取的。环磷酰胺是一种烷化剂，也广泛地应用于非肿瘤疾病(即自身免疫性疾病)，按照其标准剂量和方法服用是安全的，可避免严重的急性和慢性毒性作用。用含有ADA和ALDH基因的载体转导的骨髓细胞来进行自体移植的病人如果短期内服药多个疗程，这样便可期望为感染细胞提供一个选择优势，可使这些细胞在体内优先增殖。过一原理同样也适用于不同的基因治疗模式，只要靶细胞是环磷酰胺敏感细胞(即T淋巴细胞、肿瘤细胞等)(综述见W.F.Anderson，1992)。
可用Aldh1基因作为选择性标记导入人类谷氨酰半胱氨酸合成酶基因来产生对于诸如顺氯氨铂、苯丙氨酸氮芥、离子放射等抗癌烷化剂具有抗性的细胞。在体外多种肿瘤细胞系中已经证明人类r-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因(r-GCS)的表达与烷化作用抗性的获得相关。可以用Aldh基因作为选择性标记，以利于将r-GCS基因导入细胞。
另一个实例是产生能够抵抗人类免疫缺陷病毒(HIV)感染的细胞。可以用Aldh1基因作为选择性标记，将能够在不同水平上干扰HIV感染的编码显性阴性产物的DNA序列或反义RNA导入CD34+细胞。这些DNA序列的导入应该在体内建立起一个HIV-抗性的T细胞室。
将用Aldh1基因作为选择性标记的一种方法是将Aldh1基因和至少一种所需基因插入到反转录病毒载体中。可以将带有Aldh基因和所需基因的反转录病毒载体导入包装细胞形成能够产生病毒的细胞系。然后用产生的病毒感染细胞。本领域熟悉的将选择性标记导入细胞的其它方法也包括在本发明中。根据本发明可使用的方法之一是电穿孔法。其它方法，包括但不限于磷酸钙沉淀技术，诸如腺病毒相关的病毒系统的其它病毒载体系统、脂染法和显微注射法。
概括地讲，可以用带有Aldh1基因的反转录病毒载体(i)为造血细胞及其子代细胞提供CP抗性，以便在抗癌化疗法中可以使用高剂量CP治疗；(ii)用CP抗性作为通用标记来选择在体外或体内用反转录病毒转导的细胞。
从下述的实验细节中可更深入地理解本发明，然而，本领域专业人员很容易看出讨论的具体的方法和结果只不过是为了解释本发明，其后的权利要求书中有更详细的介绍。
实验细节I.构建带有醛脱氢酶基因的反转录病毒载体A.pLAldo-SN质粒的建立(图1)1)克隆人类细胞溶质醛脱氢酶(Aldh1)的全长cDNA用由L.C.Hsu赠送(Hsu，L.，et al.，1985)的部分cDNA探针从Clonentech(HL1115A)中筛选人类肝脏cDNA文库。命名为Aldh1的探针，含有1020个密码子和540bp的3′侧翼序列。
用1471bp的编码序列和缺失了到ATG的46bp的272bp的3′侧翼序列来分离部分的cDNA克隆，pGAldh1-A。
为了获得剩余的5′序列，采用按照基因组序列设计的5′末端引物(Hsu，et al.，1989)和以现有序列为基础的3′末端引物进行基因组DNA的PCR扩增。为克隆的需要，引物中含有XbaI和BglII位点。经XbaI和BglII消化后，将PCR产物亚克隆进pGAldh1-A，得到含有1518bp编码序列的全长cDNA的质粒pGAldo，在该质粒中用BgIII正常位点的5′端到pGAldh1-A和3′端的基因组PCR产物保留解读框架。2)构建带有人类细胞溶质醛脱氢酶基因的反转录病毒载体质粒pGAldo经EcoRI和SalI消化并填补3′凹末端，将由此获得的人类细胞溶质醛脱氢酶全长cDNA Aldo(图6，SEQ ID No.I)亚克隆到pLXSN的HpaI的位点上形成pLAldo-SN，pLXSN是一种亲两性(amphotropic)的反转录病毒载体，由D.MIller赠送(Miller，D.，and Rosman，G.，1989)。B.pLAldoX质粒的建立(图2)pGAldo经EcoRI和SalI消化并填补3′凹末端，将由此获得的人类细胞溶质醛脱氢酶全长cDNA Aldo，亚克隆到含有新霉素基因的pLNSX载体中，该载体由Dr.Miller赠送(Miller，D.，and Rosman，G.，1989)。得到的质粒含有6137碱基对。用BclI消化切割出新霉素基因。然后补平消化的载体，用StuI进一步消化，用牛肠磷酶酶(CIP)处理，再进行LMP纯化。将这种消化的载体再与前面纯化的含有醛脱氢酶-1基因的pAldo片段相连接，醛脱氢酶-1基因位于载体5′LTR的下游，由此形成的质粒称作pLAldoX，其长度为6,495个碱基对。C.反转录病毒的产生为产生载有Aldo的亲两性反转录病毒载体，用磷酸钙沉淀法将pLAldo-SN质粒转染到ψ2单向性包装细胞系中，该细胞系由Mulligan，R.赠送(Mann，et al.，(1983)Cell 33153-159)。48小时后用含有单向性Aldo-SN病毒的转染细胞系上清液来感染亲两性包装细胞系PA317(从ATCC CRL 9078获得)(Miller，D.，and Buttimore，C.，(1986)Mol.Cell.Biol.62895)。在含有新霉素的培养基中选择感染的细胞，分离出30个克隆来进一步测定病毒滴度和Aldh1 RNA表达的特性。pLAldo-SN PA317 cl.6，22和3被证实具有最高滴度和Aldh1 RNA的表达。
上述实验是用pLAl do-SN质粒进行的，反转录病毒也可用pLAldoX质粒以相似的方法产生。II.在pLAldo-SN转导的细胞中证实吗磷酰胺抗性1)感染K562细胞用pLAldo-SN PA317 cl.6细胞的含有病毒上清液来感染K562细胞，一种人类多功能白血病细胞系。以每毫升1×106个细胞，37℃将野生型(ctr)和pLAldo-SN感染的K562细胞暴露于不同浓度的吗磷酰胺(MPA)30分钟，然后以每平皿3-5×103个细胞将其置35mm3％琼脂平皿中。37℃5％CO2温育12天后用MPA选择生长细胞对非MPA选择生长细胞克隆百分比来评价MPA抗性。图3中的曲线图表示三次不同实验的均值±标准差。实验结果说明pLAldo-SN转导的K562细胞在20-80μm的MPA浓度中均表现出抗性的增高。2)感染人类正常造血前细胞提取白细胞后再经Ficol-Hypaque离心而获得的人类造血前细胞在Iscove改性的Dulbecco培养基(IMDM)+20％FCS+IL3+IL6中预培养2天，再用各种PA317-pLAdo-SN克隆上清液来感染预培养细胞，37℃再以每1×106个细胞/ml将细胞暴露于5μm吗磷酰胺(MPA)30分钟再用IMDM+20％FCS+10％5637CM(膀胱瘤条件培养基)+IL3+IL6+GM-CSF+氢化可的松10-6M制备的96孔多孔平皿上将细胞注入其中60个孔，每孔100个细胞。37℃5％CO2温育12天后用细胞生长阳性孔的数量来评价MPA抗性下列表1所示的结果说明三种不同的LAldo-SN病毒克隆(来源于相应的PA317-pLAldo-SN细胞克隆)具有MPA抗性，其抗性是用经MPA处理后仍能生长的细胞数量来评价的。表1.pLAldo-SN-转导的人类造血前细胞的环磷酰胺抗性阳性孔数量样本-MPA +MPA MMPA抗性孔％对照585 8.6cl.22-感染 6015 25cl.6-感染 6020 33cl.3-感染 6041 68III.人类细胞溶质醛脱氢酶基因作为体内选择性标记的应用构建载有人类细胞溶质醛脱氢酶基因和人类葡萄糖脑苷脂酶(GCase)基因的反转录病毒载体从NTG质粒(Correll，1989)中除去NEO选择性标记再插入人类细胞溶质醛脱氢酶基因的编码序列便可制得Aldo-GCase反转录病毒载体。
从Gaucher病人中提取白细胞来获得人类造血前细胞，病人需用r-hu-IL3治疗(5g/kg/日静脉注射诱导7天)，再用rhGM-CSF或rhG-CSF治疗3-5天(剂量均为5g/kg/日)。可以每日重复提取白细胞直至获得3×109个CD34+细胞(Siena et al.，1991)。
每次提取的白细胞经Ficol-Hypaque离心便可获得低密度细胞，用能产生高滴度Aldo-GCase载体而且不含有辅助病毒的PA317克隆的临床级上清液来感染低密度细胞。
感染之后，37℃将从每次白细胞提取中得到的纯净细胞与5μmMPA作用30分钟，用上述方法将其注入平皿。12天之后评价MPA抗性，以确定转导效率。
将感染细胞合并可用离心法洗涤并立刻回输不需冷冻，先确定抗MPA克隆的比例，12天后即可开始环磷酰胺体内治疗，只有在感染效率达30％的情况下(Bregni，et al.，1992)病人才可用环磷酰胺治疗。
依次验证两种不同的选择方案。根据第一种方案，参照联合化疗采用的标准疗程，每疗程环磷酰胺可以给药每日100mg/m2，连续给药14天(Canellos，et al.，1976)。治疗前可先进行骨髓穿刺以测定Aldo-GCase感染的抗MPA克隆的基底频率，治疗结束后再做骨髓穿刺并将结果与基底数据比较。如果观察到的转染细胞比例无变化或变化不大，而且检出了载有Aldo-GCase基因的细胞，这时便可以检验采用高剂量环磷酰胺的另一种方案。注射环磷酰胺5-7g/m2再服用rhGM-CSF或rhG-CSF(Gianni，et al.，1990)。注射持续时间可以比介绍的时间长些(24小时，而不是12小时)，以避免环磷酰胺浓度升高到5μm左右。在环磷酰胺治疗前后用PCR法和MPA抗性分析来评价MPA阳性骨髓克隆的增殖情况。IV.构建载有谷氨酰半胱氨酸合成酶基因的反转录病毒载体A.pLGCS-X质粒的建立(图8)为了获得全长r-GCS cDNA，用R.T.Mulcahy提供的部分r-GCS cDNA探针(Pst I片段，图2所示的序列中核苷酸1137-1897)筛选了人类肾脏cDNA文库(Clonentech，HL1123)。两个相互重叠的cDNA克隆总长为2904bp的cDNA序列插入体用内HindIII位点(位置1047)连接成pBK2-3G GCS质粒(图8)。然后用SacII消化这种质粒，用T4聚合酶填补3′凸末端，再用低熔点(图8中的LMP)琼脂糖制备电泳分离插入体。然后用T4连接酶将该片段连接到pLX载体的平头末端上即形成pLGCS-X载体，其中pLX载体是经BcII消化，用Klenow片段聚合酶填补5′凸末端，StuI消化，再用牛肠道磷酸酶脱去磷酸而获得的。参考文献Anderson.W.F.，(1992)256808.
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序列清单(1)一般情况(i)申请人纽约Columbia大学理事(ii)发明题目能够转导醛脱氢酶-1基因并能够使细胞产生化疗制剂环磷酰胺及其衍生物和类似物抗性的反转录病毒载体(iii)序列数量4(iv)通讯地址(A)收信人Cooper和Dunham(B)街30 Rockefeller Plaza(C)市New York(D)州New York(E)国家美国(F)邮编10112(V)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn发行号1.24(vi)本申请书资料(A)申请号(B)申请日期1994年4月1日(vii)前申请书资料(A)申请号US 08/041,722
(B)申请日期1993年4月1日(viii)律师/代理人情况(A)姓名White，John P(B)注册号28,678(C)参考/摘要号42990-A-PCT(ix)电信情况(A)电话212-977-9550(B)传真212-664-0525(2)SEQ ID No.1的资料(i)序列特性(A)长度1842个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假设类型无(iv)反义链无(v)片段类型N-末端(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置2..1568(xi)序列说明SEQ ID No.1C TAG AAC CAA ATT GCT GAG CCA GTC ACC TGT GTT CCA GGA GCC GAA 46. Asn Gln Ile Ala Glu Pro Val Thr Cys Val Pro Gly Ala Glu15 10 15TCA GAA ATG TCA TCC TCA GGC ACG CCA GAC TTA CCT GTC CTA CTC ACC94Ser Glu Met Ser Ser Ser Gly Thr Pro Asp Leu Pro Val Leu Leu Thr20 25 30GAT TTG AAG ATT CAA TAT ACT AAG ATC TTC ATA AAC AAT GAA TGG CAT142Asp Leu Lys Ile Gln Tyr Thr Lys Ile Phe Ile Asn Asn Glu Trp His35 40 45GAT TCA GTG AGT GGC AAG AAA TTT CCT GTC TTT AAT CCT GCA ACT GAG190Asp Ser Val Ser Gly Lys Lys Phe Pro Val Phe Asn Pro Ala Thr Glu50 55 60GAG GAG GTC TGC CAG GTA GAA GAA GGA GAT AAG GAG GAT GTT GAC AAG238Glu Glu Leu Cys Gln Val Glu Glu Gly Asp Lys Glu Asp Val Asp Lys65 70 75GCA GTG AAG GCC GCA AGA CAG GCT TTT CAG ATT GGA TCT CCG TGG CGT286Ala Val Lys Ala Ala Arg Gln Ala Phe Gln Ile Gly Ser Pro Trp Arg80 85 90 95ACT ATG GAT GCT TCC GAG AGG GGG CGA CTA TTA TAC AAG TTG GCT GAT334Thr Met Asp Ala Ser Glu Arg Gly Arg Leu Leu Tyr Lys Leu Ala Asp100 105 110TTA ATC GAA AGA GAT CGT CTG CTG GCG ACA ATG TCG ATG ATG GAG TCA382Leu Ile Glu Arg Asp Arg Leu Leu Ala Thr Met Glu Ser Met Glu Ser115 120 125ATG AAT GGT GGA AAA CTC TAT TCC AAT GCA TAT CTG AAT GAT TTA GCA430Met Asn Gly Gly Lys Leu Ttr Ser Ala Ala Tyr Leu Asn Asp Leu Ala130 135 140GGC TGC ATC AAA ACA TTG CGC TAC TGT GCA GGT TGG GCT GAC AAG ATC478Gly Cys Ile Lys Thr Leu Arg Tyr Cys Ala Gly Trp Ala Asp Lys Ile145 150 155CAG GGC CAG GGC CGT ACA ATA ATT ATT GAT GGA AAT TTT TTT ACA TAT526Gln Gly Gln Gly Arg Thr Ile Pro Ile Asn Gly Asn Phe Phe Thr Tyr160 165 170 175ACA AGA CAT GAA CCT ATT GGG GTA TGT GGC ATC ATC AAT CCT TGG AAT574Thr Arg His Glu Pro Ile Gly Val Cys Gly Gln Ile Ile Pro Trp Asn180 185 190TTC CCG TTG GTT ATG CTC ATT TGG AAG ATA GGG CCT GCA CTG AGC TGT622Phe Pro Leu Val Met Leu Ile Trp Lys Ile Gly Pro Ala Leu Ser Cys195 200 205GGA AAC ACA GTG GTT GTC AAA CCA GCA GAG CAA ACT CCT CTC ACT GCT670Gly Asn Thr Val Val Val Lys Pro Ala Glu Gln Thr Pro Leu Thr Ala210 215 220CTC CAC GTG GCA TCT TTA ATA AAA GCA GCA GGG TTT CCT CCT GGA GTA718Ley His Val Ala Ser Leu Ile Lys Glu Ala Gly Phe Pro Pro Gly Val225 230 235GTG AAT ATT GTT CCT GGT TAT GGG CCT ACA GCA GGG GCA GCC ATT TCT766Val Asb Ile Val Pre Gly Tyr Gly Pro Thr Ala Gly Ala Ala Ile Ser240 245 250 255TCT CAC ATG GAT ATA GAC AAA GTA GCC TTC ACA GGA TCA ACA GAG GTT 814Ser His Met AAp Ile Asp Lys Val Ala Phe Thr Gly Ser Thr Glu Val260 265 270GGC AAG TTG ATC AAA GAA GCT GCC GGG AAA AGC AAT CTG AAG AGG GTG 862Gly Lys Leu Ile Lys Glu Ala Ala Gly Lys Ser Asn Leu Lys Arg Val275 280 285ACC CTG GAG CTT GGA GGA AAG AGC CCT TGC ATT GTG TTA GCT GAT GCC 910Thr Leu Glu Leu Gly Gly Lys Ser Pro Cys Ile Val Leu Ala Asp Ala290 295 300GAC TTG GAC AAT GCT GTT GAA TTT GCA CAC CAT GGG GTA TTC TAC CAC 958Asp Leu Asp Asn Ala Val Glu Phe Ala His His Gly Val Phe Tyr His305 310 315CAG GGC CAG TGT TGT ATA GCC GCA TCC AGG ATT TTT GTG GAA GAA TCA 1006Gln Gly Gln Cys Cys Ile Ala Ala Ser Arg Ile Phe Val Glu Glu Ser320 325 330 335ATT TAT GAT GAG TTT GTT CGA AGG AGT GTT GAG CGG GCT AAG AAG TAT 1054Ile Tyr Asp Glu Phe Val Arg Arg Ser Val Glu Arg Ala Lys Lys Tyr340 345 350ATC CTT GGA AAT CCT CTG ACC CCA GGA GTC ACT CAA GGC CCT CAG ATT 1102Ile Leu Gly Asn Pro Leu Thr Pro Gly Val Thr Gln Gly Pro Gln Ile355 360 365GAC AAG GAA CAA TAT GAT AAA ATA CTT GAC CTC ATT GAG AGT GGG AAG 1150Asp Lys Glu Gln Tyr Asp Lys Ile Leu Asp Leu Ile Glu Ser Gly Lys370 375 380AAA GAA GGG GCC AAA CTG GAA TGT GGA GGA GGC CCG TGG GGG AAT AAA 1198Lys Glu Gly Ala Lys Leu Glu Cys Gly Gly Gly Pro Trp Gly Asn Lys385 390 395GGC TAC TTT GTC CAG CCC ACA GTG TTC TCT AAT GTT ACA GAT GAG ATG 1246Gly Tyr Phe Val Gln Pro Thr Val Phe Ser Asn Val Thr Asp Glu Met400 405 410 415CGC ATT GCC AAA GAG GAG ATT TTT GGA CCA GTG CAG CAA ATC ATG AAG 1294Arg Ile Ala Lys Glu Glu Ile Phe Gly Pro Val Gln Gln Ile Met Lys420 425 430TTT AAA TCT TTA GAT GAC GTG ATC AAA AGA GCA AAC AAT ACT TTC TAT 1342Phe Lys Ser Leu Asp Asp Val Ile Lys Arg Ala Asn Asn Thr Phe Tyr435 440 445GGC TTA TCA GCA GGA GTG TTT ACC AAA GAC ATT GAT AAA GCC ATA ACA 1390Gly Leu Ser Ala Gly Val Phe Thr Lys Asp Ile Asp Lys Ala Ile Thr450 455 460ATC TCC TCT GCT CTG CAG GCA GGA ACA GTG TGG GTG AAT TGC TAT GGC 1438Ile Ser Ser Ala Leu Gln Ala Gly Thr Val Trp Val Asn Cys Tyr Gly465 470 475GTG GTA AGT GCC CAG TGC CCC TTT GGT GGA TTC AAG ATG TCT GGA AAT 1486Val Val Ser Ala Gln Cys Pro Phe Gly Gly Phe Lys Met Ser Gly Asn480 485 490 495GGA AGA GAA CTG GGA GAG TAC GGT TTC CAT GAA TAT ACA GAG GTC AAA 1534Gly Arg Glu Leu Gly Glu Tyr Gly Phe His Glu Tyr Thr Glu Val Lys500 505 510ACA GTC ACA GTG AAA ATC TCT CAG AAG AAC TCA T AAAGAAAATA 1578Thr Val Thr Val Lys Ile Ser Gln Lys Asn Ser515 520
CAAGAGTGGA GAGAAGCTCT TCAATAGCTA AGCATCTCCT TACAGTCACT AATAAGGTAG1638ATTTTAAAGA CAAAATTTTT CTTTTCTTGA TTTTTTTTAA ACATAAGCTA AATCATATTA1698GTATTAATAC TACCCATAGA AAACTTGACA TGTAGCTTCT TCTGAAAGAA TTATTTGCCT1758TCTGAAATGT GACCCCCAAG TCCTATCCTA AATAAAAAAA GACAAATTCG GATGTATGAT1818CTCTCTAGCT TTGTCATAGT TATG 1842(2)SEQ ID No.2的资料(i)序列特性(A)长度522个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列说明SEQ ID No.2. Asn Gln Ile Ala Glu Pro Val Thr Cys Val Pro Gly Ala Glu Ser1 5 10 15Glu Met Ser Ser Ser Gly Thr Pro Asp Leu Pro Val Leu Leu Thr Asp20 25 30Leu Lys Ile Gln Tyr Thr Lys Ile Phe Ile Asn Asn Glu Trp His Asp35 40 45Ser Val Ser Gly Lys Lys Phe Pro Val Phe Asn Pro Ala Thr Glu Glu50 55 60Glu Leu Cys Gln Val Glu Glu Gly Asp Lys Glu Asp Val Asp Lys Ala65 70 75 80Val Lys Ala Ala Arg Gln Ala Phe Gln Ile Gly Ser Pro Trp Arg Thr85 90 95Met Asp Ala Ser Glu Arg Gly Arg Leu Leu Tyr Lys Leu Ala Asp Leu100 105 110Ile Glu Arg Asp Arg Leu Leu Ala Thr Met Glu Ser Met Glu Ser Met115 120 125Asn Gly Gly Lys Leu Tyr Ser Asn Ala Tyr Leu Asn Asp Leu Ala Gly130 135 140Cys Ile Lys Thr Leu Arg Tyr Cys Ala Gly Trp Ala Asp Lys Ile Gln145 150 155 160Gly Gln Gly Arg Thr Ile Pro Ile Asp Gly Asn Phe Phe Thr Tyr Thr165 170 175Arg His Glu Pre Ile Gly Val Cys Gly Gln Ile Ile Pro Trp Asn Phe180 185 190Pro Leu Val Met Leu Ile Trp Lys Ile Gly Pro Ala Leu Ser Cys Gly195 200 205Asn Thr Val Val Val Lys Pro Ala Glu Gln Thr Pro Leu Thr Ala Leu210 215 220His Val Ala Ser Leu Ile Lys Glu Ala Gly Phe Pro Pro Gly Val Val225 230 235 240Asn Ile Val Pro Gly Tyr Gly Pro Thr Ala Gly Ala Ala Ile Ser Ser245 250 255His Met Asp Ile Asp Lys Val Ala Phe Thr Gly Ser Thr Glu Val Gly260 265 270Lys Leu Ile Lys Glu Ala Ala Gly Lys Ser Asn Leu Lys Arg Val Thr275 280 285Leu Glu Leu Gly Gly Lys Ser Pre Cys Ile Val Leu Ala Asp Ala Asp290 295 300Leu Asp Asn Ala Val Glu Phe Ala His His Gly Val Phe Tyr His Gln305 310 315 320Gly Gln Cys Cys Ile Ala Ala Ser Arg Ile Phe Val Glu Glu Ser Ile325 330 335Tyr Asp Glu Phe Val Arg Arg Ser Val Glu Arg Ala Lys Lys Tyr Ile340 345 350Leu Gly Asn Pro Leu Thr Prg Gly Val Thr Gln Gly Pro Gln Ile Asp355 360 365Lys Glu Gln Tyr Asp Lys Ile Leu Asp Leu Ile Glu Ser Gly Lys Lys370 375 380Glu Gly Ala Lys Leu Glu Cys Gly Gly Gly Pro Trp Gly Asn Lys Gly385 390 395 400Tyr Phe Val Gln Pro Thr Val Pne Ser Asn Val Thr Asp Glu Met Arg405 410 415Ile Ala Lys Glu Glu Ile Phe Gly Pro Val Gln Gln Ile Met Lys Phe420 425 430Lys Ser Leu Asp Asp Val Ile Lys Arg Ala Asn Asn Thr Phe Tyr Gly435 440 445Leu Ser Ala Gly Val Phe Thr Lys Asp Ile Asp Lys Ala Ile Thr Ile450 455 460Ser Ser Ala Leu Gln Ala Gly Thr Val Trp Val Asn Cys Tyr Gly Val465 470 475 480Val Ser Ala Gln Cys Pro Phe Gly Gly Phe Lys Met Ser Gly Asn Gly485 490 495Arg Glu Leu Gly Glu Tyr Gly Phe His Glu Tyr Thr Glu Val Lys Thr500 505 510Val Thr Val Lys Ile Ser Gln Lys Asn Ser515 520(2)SEQ ID No.3的资料(i)序列特性(A)长度2904个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假设类型无(iv)反义链无(v)片段类型N-末端(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置363..2274(D)其它资料(xi)序列说明SEQ ID No.3GAATTCCGGG CGGGAGCCGC CGCGGCAGCG CGGCCGTGGG GTCCGCCGCC GCCGCATCGG 60AGCGGGAGGA GGAGCAGCGG GGAGGGCGAG GCCGCCGGGC CGAGAGCCGT CCCGCCTGCT 120CTCGGTCTTC TGCCTTCGCC TCCGCGCGGT GCGTCGGACC CAGGGTCTGT CACCTGGGCG 180CCAGGGGCCG CCGCCGGGGA GCCGGAGCGG GCAGGACCCT CCCTCCGCCG ACTGCGGCCC 240GAGAGCGCCC CCGCGGGGTG GAGCGGCAGC CGCCTTCTGC GGGCGGCTGA GTGTCCGTCT 300CGCGCCCGGA GCGGGCGACC GCCGTCAGCC CGGAGGAGGA GGAGGAGGAG GAGGGGGCGT 360CC ATG GGG CTG CTG TCC CAG GGC TCG CCG CTG AGC TGG GAG GAA ACC407Met Gly Leu Leu Ser Gln Gly Ser Pro Leu Ser Trp Glu Glu Thr1 5 10 15AAG CGC CAT GCC GAC CAC GTG CGG CGG CAC GGG ATC CTC CAG TTC CTG 455Lys Arg His Ala Asp His Val Arg Arg His Gly Ile Leu Gln Phe Leu20 25 30CAC ATC TAC CAC GCC GTC AAG GAC CGG CAC AAG GAC GTT CTC AAG TGG 503His Ile Tyr His Ala Val Lys Asp Arg His Lys Asp Val Leu Lys Trp35 40 45GGC GAT GAG GTG GAA TAC ATG TTG GTA TCT TTT CAT CAT GAA AAT AAA 551Gly Asp Glu Val Glu Tyr Met Leu Val Ser Phe Asp His Glu Asn Lys50 55 60AAA GTC CGG TTG GTC CTG TCT GGG GAG AAA GTT CTT GAA ACT CTG CAA 599Lys Val Arg Leu Val Leu Ser Gly Glu Lys Val Leu Glu Thr Leu Gln65 70 75GAG AAG GGG GAA AGG ACA AAC CCA AAC CAT CCT ACC CTT TGG AGA CCA 647Glu Lys Gly Glu Arg Thr Asn Pro Asn His Pro Thr Leu Trp Arg Pro80 85 90 95GAG TAT GGG AGT TAC ATG ATT GAA GGG ACA CCA GGA CAG CCC TAC GGA 695Glu Tyr Gly Ser Tyr Met Ile Glu Gly Thr Pro Gly Gln Pro Tyr Gly100 105 110GGA ACA ATG TCC GAG TTC AAT ACA GTT GAG GCC AAC ATG CGA AAA CGC 743Gly Thr Met Ser Glu Phe Asn Thr Val Glu Ala Asn Met Arg Lys Arg115 120 125CGG AAG GAG GCT ACT TCT ATA TTA GAA GAA AAT CAG GCT CTT TGC ACA 791Arg Lys Glu Ala Thr Ser Ile Leu Glu Glu Asn Gln Ala Leu Cys Thr130 135 140ATA ACT TCA TTT CCC AGA TTA GGC TGT CCT GGG TTC ACA CTG CCC GAG 839Ile Thr Ser Phe Pro Arg Leu Gly Cys Pro Gly Phe Thr Leu Pro Glu145 150 155GTC AAA CCC AAC CCA GTG GAA GGA GGA GCT TCC AAG TCC CTC TTC TTT 887Val Lys Prg Ash Pro Val Glu Gly Gly Ala Ser Lys Ser Leu Phe Phe160 165 170 175CCA GAT GAA GCA ATA AAC AAG CAC CCT CGC TTC AGT ACC TTA ACA AGA 935Pro Asp Glu Ala Ile Asn Lys His Pro Arg Phe Ser Thr Leu Thr Arg180 185 190AAT ATC CGA CAT AGG AGA GGA GAA AAG GTT GTC ATC AAT GTA CCA ATA 983Asn Ile Arg His Arg Arg Gly Glu Lys Val Val Ile Asn Val Pro Ile195 200 205TTT AAG GAC AAG AAT ACA CCA TCT CCA TTT ATA GAA ACA TTT ACT GAG 1031Phe Lys Asp Lys Asn Thr Pro Ser Pro Phe Ile Glu Thr Phe Thr Glu210 215 220GAT GAT GAA GCT TCA AGG GCT TCT AAG CCG GAT CAT ATT TAC ATG GAT 1079Asp Asp Glu Ala Ser Arg Ala Ser Pro Pro Asp His Ile Tyr Met Asp225 230 235GCC ATG GGA TTT GGA ATG GGC AAT TGC TGT CTC CAG GTG ACA TTC CAA 1127Ala MeC Gly Phe Gly Met Gly Asn Cys Cys Leu Gln Val Thr Phe Gln240 245 250 255GCC TGC AGT ATA TCT GAG GCC AGA TAC CTT TAT GAT CAG TTG GGT ACT 1175Ala Cys Ser Ile Ser Glu Ala Arg Tyr Leu Tyr Asp Gln Leu Ala Thr260 265 270ATC TGT CCA ATT GTT ATG GCT TTG AGT GCT GCA TCT CCC TTT TAC CGA 1223Ile Cys Pro Ile Val Met Ala Leu Ser Ala Ala Ser Pro Phe Tyr Arg275 280 285GGC TAT GTG TCA GAC ATT GAT TGT CGC TGG GGA GTG ATT TCT GCA TCT 1271Gly Tyr Val Ser Asp Ile Asp Csy Arg Trp Gly Val Ile Ser Ala Ser290 295 300GTA GAT GAT AGA ACT CGG GAG GAG CGA GGA CTG GAG CCA TTG AAG AAC 1319Val Asp Asp Arg Thr Arg Glu Glu Arg Gly Leu Glu Pro Leu Lys Asn305 310 315AAT AAC TAT AGG ATC AGT AAA TCC CGA TAT GAC TCA ATA GAC AGC TAT 1367Asn Asn Tyr Arg Ile Ser Lys S4r Ar9 Tyr Asp Ser Ile Asp Ser Tyr320 325 330 335TTA TCT AAG TGT GGT GAG AAA TAT AAT GAC ATC GAC TTG ACG ATA GAT 1475Leu Ser Lys Cys Gly Glu Lys Tyr Asn Asp Ile Asp Leu Thr Ile Asp340 345 350AAA GAG ATC TAC GAA CAG CTG TTG CA6 GAA 6GC ATT GAT CAT CTC CTG 1463Lys Glu Ile Tyr Glu Gln Leu Leu Gln Glu Gly Ile Aso His Leu Leu355 360 365GCC CAG CAT GTT GCT CAT CTC TTT ATT AGA GAC CCA CTG ACA CTG TTT 1511Ala Gln His Val Ala His Leu Phe Ile Arg Asp Pro Leu Thr Leu Phe370 375 380GAA GAG AAA ATA CAC CTG GAT GAT GCT AAT GAG TCT GAC CAT TTT GAG 1559Glu Glu Lys ILe His Leu Asp Asp Ala Asn Glu Ser Asp His Phe Glu385 390 395AAT ATT GAG TCC ACA AAT TGG CAG ACA ATG AGA TTT AAG CCC CCT CCT 1607Asn Ile Gln Ser Thr Asn Trp Gln Thr Met Arg Phe Lys Pro Pro Pro400 405 410 415CCA AAC TCA GAC ATT GGA TGG AGA GTA GAA TTT CGA CCC ATG GAG GTG 1655Pro Asn Ser Asp Ile Gly Trp Arg Val Glu Phe Arg Pro Met Glu Val420 425 430CAA TTA ACA GAC TTT GAG AAC TCT GCC TAT GTG GTG TTT GTG GTA CTG 1703Gln Leu Thr Asp Phe Glu Asn Ser Ala Tyr Val Val Phe Val Val Leu435 440 445CTC ACC AGA GTG ATC CTT TCC TAC AAA TTG GAT TTT CTC ATT CCA CTG 1751Leu Thr Arg Val Ile Leu Ser Tyr Lys Leu Asp Phe Leu Ile Pro Leu450 455 460TCA AAG GTT GAT GAG AAC ATG AAG GTA GCA CAG AAA AGA GAT GCT GTC 1799Ser Lys Val Asp Glu Asn Met Lys Val Ala Gln Lys Arg Asp Ala Val465 470 475TTG CAG GGA ATG TTT TAT TTC AGG AAA GAT ATT TGC GGT GGT GGC AAT 1847Leu Gln Gly Met Phe Tyr Phe Arg Lys Asp Ile Cys Lys Gly Gly Asn480 485 490 495GCA GTG GTG GAT GGT TGT GGC AAG GCC CAG AAC AGC ACG GAG CTC GCT 1895Ala Val Val Asp Gly Cys Gly Lys Ala Gln Asn Ser Thr Glu Leu Ala500 505 510GCA GAG GAG TAC ACC CTC ATG ACC ATA GAC ACC ATC ATC AAT GGG AAG 1943Ala Glu Glu Tyr Thr Leu Met Ser Ile Asp Thr Ile Ile Asn Gly Lys515 520 525GAA GGT GTG TTT CCT GGA GTG ATC CCA ATT CTG AAC TCT TAC CTT GAA 1991Glu Gly Val Phe Pro Gly Leu Ile Pro Ile Leu Asn Ser Tyr Leu Glu530 535 540AAC ATG GAA GTG GAT GTG GAC ACC AGA TGT AGT ATT CTG AAC TAC CTA 2039Asn Met Glu Val Asp Val Asp Thr Arg Cys Ser Ile Leu Asn Tyr Leu545 550 555AAG CTA ATT AAG AAG AGA GCA TCT GGA GAA CTA ATG ACA GTT GCC AGA 2087Lys Leu Ile Lys Lys Arg Ala Ser Gly Glu Leu Met Thr Val Ala Arg560 565 570 575TGG ATG AGG GAG TTT ATC GCA AAC CAT CCT GAC TAC AAG CAA GAC AGT 2135Trp Met Arg Glu Phe Ile Ala Asn His Pro Asp Tyr Lys Gln Asp Ser580 585 590GTC ATA ACT GAT GAA ATG AAT TAT AGC CTT ATT TTG AAG TGT AAC CAA 2183Val Ile Thr Asp Glu Met Asn Tyr Ser Lle Ile Lys Lys Cys Asn Gln595 600 605ATT GCA AAT GAA TTA TGT GAA TGC CCA GAG TTA CTT GGA TCA GCA TTT 2231Ile Ala Asn Glu Leu Cys Glu Cys Pro Glu Leu Leu Gly Ser Ala Phe610 615 620
AGG AAA GTA AAA TAT AGT GGA AGT AAA ACT GAC TCA TCC AAC T2274Arg Lys Val Lys Tyr Ser Gly Ser Lys Thr Asp Ser Ser Asn625 630 635AGACATTCTA CAGAAAGAAA AATGCATTAT TGACGAACTG GCTACAGTAC CATGCCTCTC2334AGCCCGTGTG TATAATATGA AGACCAAATG ATAGAACTGT ACTGTTTTCT GGGCCAGTGA2394GCCAGAAATT GATTAAGGCT TTCTTTGGTA GGTAAATCTA GAGTTTATAC AGTGTACATG2454TACATAGTAA AGTATTTTTG ATTAACAATG TATTTTAATA ACATATCTAA AGTCATCATG2514AACTGGCTTG TACATTTTTA AATTCTTACT CTGGAGCAAC CTACTGTCTA AGCAGTTTTG2574TAAATGTACT GGTAATTGTA CAATACTTGC ATTCCAGAGT TAAAATGTTT ACTGTAAATT2634TTTGTTCTTT TAAAGACTAC CTGGGACCTG ATTTATTGAA ATTTTTCTCT TTAAAAACAT2694TTTCTCTCGT TAATTTTCCT TTGTCATTTC CTTTGTTGTC TACATTAAAT CACTTGAATC2754CATTGAAAGT GCTTCAAGGG TAATCTTGGG TTTCTAGCAC CTTATCTATG ATGTTTCTTT2814TGCAATTGGA ATAATCACTT GGTCACCTTG CCCCAAGCTT TCCCCTCTGA ATAAATACCC2874ATTGAACTCT GAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 2904(2)SEQ ID No.4的资料(i)序列特性(A)长度637个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列说明SEQ ID No.4Met Gly Leu Leu Ser Gln Gly Ser Pro Leu Ser Trp Glu Glu Thr Lys1 5 10 15Arg His Ala Asp His Val Arg Arg His Gly Ile Leu Gln Phe Leu His20 25 30Ile Tyr His Ala Val Lys Asp Arg His Lys Asp Val Leu Lys Trp Gly35 40 45Asp Glu Val Glu Tyr Met Leu Val Ser Phe Asp His Glu Asn Lys Lys50 55 60Val Arg Leu Val Leu Ser Gly Glu Lys Val Leu Glu Thr Leu Gln Glu65 70 75 80Lys Gly Glu Arg Thr Asn Pro Asn His Pro Thr Leu Trp Arg Pro Glu85 90 95Tyr Gly Ser Tyr Met Ile Glu Gly Thr Pro Gly Gln Pro Tyr Gly Gly100 105 110Thr Met Ser Glu Phe Asn Thr Vel Glu Ala Asn Met Arg Lys Arg Arg115 120 125Lys Glu Ala Thr Ser Ile Leu Glu Glu Asn Gln Ala Leu Cys Thr Ile130 135 140Thr Ser Phe Pro Arg Leu Gly Cys Pro Gly Phe Thr Leu Pro Glu Val145 150 155 160Lys Pro Asn Pro Val Glu Gly Gly Ala Ser Lys Ser Leu Phe Phe Pro165 170 175Asp Glu Ala Ile Asn Lys His Pro Arg Phe Ser Thr Leu Thr Arg Asn180 185 190Ile Arg His Arg Arg Gly Glu Lys Val Val Ile Asn Val Pro Ile Phe195 200 205Lys Asp Lys Asn Thr Pro Ser Pro Phe Ile Glu Thr Phe Thr Glu Asp210 215 220Ase Glu Ala Ser Arg Ala Ser Lys Pro Asp His Ile Tyr Met Asp Ala225 230 235 240Met Gly Phe Gly Met Gly Asn Cys Cys Leu Gln Val Thr Phe Gln Ala245 250 255Cys Ser Ile Ser Glu Ala Arg Tyr Leu Tyr Asp Gln Leu Ala Thr Ile260 265 270Cys Pro Ile Val Met Ala Leu Ser Ala Ala Ser Pro Phe Tyr Arg Gly275 280 285Tyr Val Ser Asp Ile Asp Cys Arg Trp Gly Val Ile Ser Ala Ser Val290 295 300Asp Asp Arg Thr Arg Glu Glu Ar9 Gly Leu Glu Pro Leu Lys Asn Asn305 310 315 320Asn Tyr Arg Ile Ser Lys Ser Arg Tyr Asp Ser Ile Asp Ser Tyr Leu325 330 335Ser Lys Cys Gly Glu Lys Tyr Asn Asp Ile Asp Leu Thr Ile Asp Lys340 345 350Glu Ile Tyr Glu Gln Leu Leu Gln Glu Gly Ile Asp His Leu Leu Ala355 360 365Gln His Val Ala His Leu Phe Ile Arg Asp Pro Leu Thr Leu Phe Glu370 375 380Glu Lys Ile His Leu Asp Asp Ala Asn Glu Ser Asp His Phe Glu Asn385 390 395 400Ile Gln Ser Thr Asn Trp Gln Thr Met Arg Phe Lys Pro Pro Pro Pro405 410 415Asn Ser Asp Ile Gly Trp Arg Val Glu Phe Arg Pro Met Glu Val Gln420 425 430Leu Thr Asp Phe Glu Asn Ser Ala Tyr Val Val Phe Val Val Leu Leu435 440 445Thr Arg Val Ile Leu Ser Tyr Lys Leu Asp Phe Leu Ile Pro Leu Ser450 455 460Lys Val Asp Glu Asn Met Lys Val Ala Gln Lys Arg Asp Ala Val Leu465 470 475 480Gln Gly Met Phe Tyr Phe Arg Lys Asp Ile Cys Lys Gly Gly Asn Ala485 490 495Val Val Asp Gly Cys Gly Lys Ala Gln Asn Ser Thr Glu Leu Ala Ala500 505 510Glu Glu Tyr Thr Leu Mer Ser Ile Asp Thr Ile Ile Asn Gly Lys Glu515 520 525Gly Val Phe Pro Gly Leu Ile Pro Ile Leu Asn Ser Tyr Leu Glu Asn530 535 540Met Glu Val Asp Val Asp Thr Arg Cys Ser Ile Leu Asn Tyr Leu Lys545 550 555 560Leu Ile Lys Lys Arg Ala Ser Gly Glu Leu Met Thr Vel Ala Arg Trp565 570 575Met Arg Glu Phe Ile Ala Asn His Pro Asp Tyr Lys GlA Asp Ser Val580 585 590Ile Thr Asp Glu Met Asn Tyr Ser Leu Ile Leu Lys Cys Asn Gln Ile595 600 605Ala Asn Glu Leu Cys Glu Cys Pro Glu Leu Leu Gly Ser Ala Phe Arg610 615 620Lys Val Lys Tyr Ser Gly Ser Lys Thr Asp Ser Ser Asn625 630 63权利要求
1.一种载体，它含有编码人类细胞溶质醛脱氢酶的核酸分子。
2.权利要求1的载体，其中载体是双链DNA病毒载体。
3.权利要求2的双链DNA病毒载体，其中编码细胞溶质醛脱氢酶的核酸分子与图4所示序列(SEQ ID No.1)基本相同。
4.一种反转录病毒载体，它含有编码人类细胞溶质醛脱氢酶的核酸分子。
5.权利要求4的反转录病毒载体，其中反转录病毒载体是双链DNA反转录病毒载体。
6.权利要求5的双链DNA反转录病毒载体，其中编码细胞溶质醛脱氢酶的核酸分子与图4所示的序列(SEQ ID No.1)基本相同。
7.一种载体，它含有编码人类谷氨酰半胱氨酸合成酶的核酸分子。
8.权利要求7的载体，其中载体是双链DNA病毒载体。
9.权利要求8的双链DNA病毒载体，其中编码谷氨酰半胱氨酸合成酶的核酸分子与图6所示的序列(SEQ ID No.3)基本相同。
10.一种反转录病毒载体，它含有编码人类谷氨酰半胱氨酸合成酶的核酸分子。
11.权利要求10的反转录病毒载体，其中反转录病毒载体是双链DNA反转录病毒载体。
12.权利要求11的双链DNA反转录病毒载体，其中编码谷氨酰半胱氨酸合成酶的核酸分子与图6所示的序列(SEQ ID No.3)基本相同。
13.一种载体，它含有编码人类细胞溶质醛脱氢酶和谷氨酰半胱氨酸合成酶的核酸分子。
14.权利要求4或10的反转录病毒载体，其中小鼠病毒是Moloney小鼠白血病病毒。
15.权利要求4或10的反转录病毒载体，其中小鼠病毒是Moloney小鼠肉瘤病毒。
16.权利要求4或10的反转录病毒载体，其中3′长末端重复与Moloney小鼠白血病病毒的3′长末端重复一致，5′长末端重复与Moloney小鼠肉瘤病毒的5′长末端重复一致。
17.一种质粒，它含有权利要求4或10的反转录病毒载体。
18.权利要求17中命名为pLAldo-SN的质粒(ATCC注册号69238)。
19.权利要求18中命名为pLAldo的质粒。
20.权利要求17中命名为pLGCS-X的质粒(ATCC注册号＿＿＿)。
21.一种哺乳动物反转录病毒生产细胞，它含有权利要求4或10的载体，或权利要求18、19或20的质粒。
22.权利要求18中命名为pLAldo-SN PA317.cl.6的生产细胞(ATCC注册号CRL 11265)。
23.一种人类细胞，它含有权利要求1或7的载体，或权利要求18或19的质粒。
24.权利要求23的人类造血细胞。
25.权利要求24的骨髓细胞。
26.生产具有细胞溶质醛脱氢酶生物活性多肽的宿主载体系统，它包括权利要求18、19或20的质粒和适当的宿主。
27.权利要求26的宿主载体系统，其中适当的宿主是细菌细胞、昆虫细胞、病毒寄生的细胞或哺乳动物细胞。
28.一种降低环磷酰胺对病人毒性作用的方法，它包括用权利要求23的造血细胞来替换病人造血细胞以便降低环磷酰胺对病人的毒性作用。
29.将选择性标记导入哺乳动物细胞的方法，它包括用编码人类细胞溶质醛脱氢酶的核酸分子来转染细胞。
30.权利要求29的方法，其中核酸分子是DNA、RNA或cDNA。
31.权利要求30的方法，其中核酸分子与图4所示的序列(SEQID No.1)基本相同。
32.选择表达所需蛋白质的哺乳动物细胞的方法，它包括a.将核酸分子导入细胞，该核酸分子包括编码所需蛋白质的核酸分子和编码人类细胞溶质醛脱氢酶的核酸分子；b.培养由此转染的细胞；c.选择表达人类细胞溶质醛脱氢酶的细胞，以便获得表达所需蛋白质的细胞。
33.权利要求32的方法，其中核酸分子是DNA、RNA或cDNA。
34.权利要求32的方法，其中编码人类细胞溶质醛脱氢酶的核酸分子与图4所示序列(SEQ ID No.1)基本相同。
35.权利要求32的方法，其中步骤(a)的DNA分子是反转录病毒载体的一部分。
36.将选择性标记导入哺乳动物细胞的方法，它包括用编码人类谷氨酰半胱氨酸合成酶的核酸分子来转染细胞。
37.权利要求36的方法，其中核酸分子是DNA、RNA或cDNA。
38.权利要求37的方法，其中核酸分子与图6所示的序列(SEQID No.3)基本相同。
39.选择表达所需蛋白质的哺乳动物细胞的方法，它包括a.将核酸分子导入细胞，核酸分子包括编码所需蛋白质的核酸分子和编码人类谷氨酰半胱氨酸合成酶的核酸分子；b.培养由此转染的细胞；c.选择表达人类谷氨酰半胱氨酸合成酶的细胞以便获得表达所需蛋白质的细胞。
40.权利要求39的方法，其中核酸分子是DNA、RNA或cDNA。
41.权利要求39的方法，其中编码人类谷氨酰半胱氨酸合成酶的核酸分子与图6所示的序列(SEQ ID No.3)基本相同。
42.权利要求39的方法，其中步骤(a)的DNA分子是反转录病毒载体的一部分。
43.一种编码细胞溶质醛脱氢酶的分离的哺乳动物核酸分子。
44.权利要求43中分离的哺乳动物核酸分子，其中核酸分子与图4所示序列(SEQ ID No.1)基本相同。
45.一种分离的编码谷氨酰半胱氨酸合成酶的哺乳动物核酸分子。
46.权利要求45中分离的哺乳动物核酸分子，其中核酸分子与图6所示的序列(SEQ ID No.3)基本相同。
47.权利要求43或45的分离的哺乳动物DNA分子。
48.权利要求43或45的分离的哺乳动物cDNA分子。
49.权利要求43或45的分离的哺乳动物RNA分子。
50.权利要求44或46的分离的哺乳动物核酸分子，其中核酸分子是从人类衍生的。
51.含有至少15个核苷酸的核酸分子，它能与权利要求43或45的核酸分子的序列进行特异性杂交。
52.权利要求51的含有至少15个核苷酸的核酸分子，其中分子是DNA或RNA。
53.细胞中醛脱氢酶表达的检测方法，它包括提取细胞中全部mRNA，将由此获得的mRNA与权利要求49的标记的核酸分子在杂交条件下相互作用，确定与之杂交的分子中mRNA的存在，由此检测细胞中细胞溶质醛脱氢酶的表达。
54.具有哺乳动物细胞溶质醛脱氢酶生物活性多肽的生产方法，它包括在能够产生多肽并能回收由此产生的多肽的适当条件下，使权利要求26的宿主载体系统的宿主细胞培养生长。
55.细胞中谷氨酰半胱氨酸合成酶表达的检测方法，它包括提取细胞中全部mRNA，将由此获得的mRNA与权利要求49的标记的核酸分子在杂交条件下相互作用，确定与之杂交的分子中mRNA的存在，由此检测细胞中细胞溶质谷氨酰半胱氨酸合成酶的表达。
56.具有哺乳动物细胞溶质谷氨酰半胱氨酸合成酶生物活性多肽的生产方法，它包括在能够产生多肽并能回收由此产生的多肽的适当条件下，使权利要求26的宿主载体系统中宿主细胞培养生长。
57.一种抗氨基酸分子，即细胞溶质醛脱氢酶的抗体。
58.权利要求57的抗体，其中氨基酸顺序与图5所示的序列(SEQ ID No.2)基本相同。
59.一种抗氨基酸分子，即谷氨酰半胱氨酸合成酶的抗体。
60.权利要求59的抗体，其中氨基酸顺序与图6所示的序列(SEQ ID No.4)基本相同。
61.权利要求57或59的抗体，其中抗体是单克隆抗体。
62.权利要求57或59的抗体，其中抗体是多克隆抗体。
63.测定生物样本中哺乳动物细胞溶质醛脱氢酶含量的免疫检验法，其步骤包括(a)将生物样本与至少一种权利要求57的抗体相作用，形成该抗体与细胞溶质醛脱氢酶的复合物。(b)测定该复合物的含量以便测得该生物样本中细胞溶质醛脱氢酶的含量。
64.一种非人类转基因哺乳动物，它含有权利要求43或45的分离的核酸分子。
65.权利要求64的非人类转基因哺乳动物，其中分离的哺乳动物核酸分子与图4所示的序列(SEQ ID No.1)基本相同。
66.一种非人类转基因哺乳动物，其基因组中含有与编码细胞溶质醛脱氢酶的DNA相互补的反义DNA，如此设计目的是将其转录成与编码细胞溶质醛脱氢酶的mRNA相互补的反义mRNA，再将其与编码哺乳动物细胞溶质醛脱氢酶的mRNA杂交，由此使其降低翻译功能。
67.测定生物样本中哺乳动物谷氨酰半胱氨酸合成酶含量的免疫检验法，其步骤包括(a)将生物样本与至少一种权利要求59的抗体相作用，形成该抗体与谷氨酰半胱氨酸合成酶的复合物。(b)测定该复合物含量便测得该生物样本中细胞溶质谷氨酰半胱氨酸合成酶的含量。
全文摘要
本发明提供了含有编码人类细胞质中醛脱氢酶或谷氨酰半胱氨酸合成酶或其结合物的核酸分子的病毒载体和反转灵病毒载体。本发明还提供了分离的编码细胞质中醛脱氢酶和谷氨酰半胱氨酸合成酶的哺乳动物核酸分子。此外，本发明还提供了降低环磷酰胺对病人毒性作用的方法；将可选择性标记导入哺乳动物细胞的方法；和表达所需蛋白质的哺乳动物细胞的选择方法。
文档编号C07K16/40GK1109260SQ94190257
公开日1995年9月27日 申请日期1994年4月1日 优先权日1993年4月1日
发明者R·达拉-发维拉, A·M·吉安尼 申请人:纽约市哥伦比亚大学理事