专利名称：通过T细胞α链的抗原特异性的免疫调节方法
本申请为1991年8月30日提交的申请编号07/752820的部分继续。发明背景1.发明领域本发明涉及以抗原特异性方式调节免疫系统的方法。
能够与令人感兴趣的抗原相结合的T细胞α链被用于为抑制或加强对特定抗原的免疫反应设计的方案中。本文描述的治疗方案可用于治疗过敏反应，自身免疫，移植排异和癌症。2.相关技术的描述免疫学家和其它学者长期以来一直在研究免疫系统试图找到一种调节免疫反应的机制。为此目的，以非特异性方式完全抑制或加强免疫反应的多种药物或方案被采用。然而，由于影响了整个免疫系统，这种类型的调节不能令人满意。这种类型的调节未考虑到可只对特异性抗原的免疫反应进行调节的免疫系统特殊组成。例如，在治疗过敏反应时，只选择性地抑制对特定致敏原的免疫反应而不抑制个体的整个免疫系统是有利的。本文描述和权利要求的发明，部分基于发现了可溶性T细胞受体α链是免疫反应的抗原特异性介质，涉及将那些T细胞受体α链用于抑制或加强对特异性抗原的免疫反应的方法。2.1免疫反应的调节外源抗原引入个体中引发包括细胞免疫和体液免疫两种主要组成的免疫反应。这两种免疫反应分别由功能不同的T细胞和B细胞淋巴细胞群介导。T细胞通过产生淋巴因子对抗原刺激起反应，这些淋巴因子“辅助”或激活免疫系统中各种其它细胞类型。另外，某些T细胞可成为细胞毒性效应细胞。另一方面，B细胞反应主要包括它们的分泌产物，即抗体，抗体可直接与抗原结合。辅助T细胞(TH)可通过其细胞表面糖蛋白标记CD4的表达与细胞毒性T细胞和B细胞区别开来。虽然CD4+辅助T细胞调节其它细胞类型的机制尚未完全阐明，但CD4+T细胞区划内的某些亚群的作用已有研究(Mosmann和Coffman，1989，Ann.Rev.Immunol.7145-173)。I型辅助细胞(TH1)在激活后产生白介素-2(IL-2)和γ-干扰素，而II型辅助细胞(TH2)产生IL-4和IL-5。基于淋巴因子产生的分布型，TH1表现为涉及促进其它T细胞的增殖，而TH2因子特异地调节B细胞增殖，抗体合成，和抗体类型的转变。而且，这两种TH群可互相调节，因为TH1产生的γ-干扰素抑制TH2的增殖和功能。
B细胞和T细胞反应两者的一个显著特点是它们对免疫抗原的精确特异性，但它们的抗原识别机制不同。抗体在固体表面或溶液中直接与抗原结合，而T细胞只与呈递在固相如抗原呈递细胞表面上呈递的抗原反应。另外，抗原必须在主要组织相容性复合体(MHC)-编码的I类或II类分子的组织中呈递至T细胞。MHC指编码具有多种免疫功能的蛋白质的一个基因簇。I类基因产物可见于所有细胞并且它们是主要移植排异反应的靶。II类基因产物主要在各种造血谱系的细胞上表达并且它们在免疫反应中涉及细胞-细胞相互作用。一类和二类蛋白质还显示可作为抗原呈递细胞表面上的抗原的受体。T细胞和抗原间相互作用的复杂性的另一水平在于，这种相互作用仅在抗原呈递细胞和反应性T细胞间的MHC单倍型(复合体中所有等位基因的组合)相同时发生。因此，对特定抗原特异性的T细胞只在抗原由表达匹配MHC的细胞所呈递时产生反应。这种现象即MHC-限制性。
1970年，Gershon和Kondo(Gershon和Kondo，1970，Immunology18723)提出T细胞也可负性地影响免疫反应过程。虽然免疫调节概念最初受到怀疑，但最终它仍被大多数免疫学家接受，因为它为抗原已被所给定免疫反应消除，并且继续反应不再需要时，免疫系统中动态平衡的维持提供了概念性框架。从那以后，抗原特异性抑制T细胞(Ts)在许多实验系统中被报告(Green等，1983，Ann，Rev.Immunol.1439-463；Dorf和Denacerraf，1984，Ann，Rev.Immunol.2127-158)。
描绘Ts作用机制的试尝导致在T细胞培养上清液中发现了许多可溶性介体。因此，提出假定Ts通过释放T抑制因子(TsF)起作用，TsF随后作用于其它T和B细胞。基于实验数据提出了多种复杂的模式以阐明不同Ts亚群和它们的TsF之间的复杂相互作用(Asherson等，1986，Ann.Rev.Immunol.437-68)。
由于不同T细胞功能亚群确立了特异性表面标记，开始进行了Ts和它们的FsF的独特标记的搜寻。一项Ts表面表型的研究首先显示它们表达CD8(Lyt-2)，一种具细胞毒性潜力的T细胞共享的标记。1976年，报道了一种看来与小鼠Ts特异性表达的结构相作用的抗血清(Murphy等，1976，J.Exp.Med.144699；Tada等，1976，J.Exp.Med.144713)。对编码抗原的基因图谱研究将该基因定位于小鼠MHC中I-Eα和1-Eβ间的I区。(此位点称为I-J。
20世纪80年代早期，细胞免疫领域开始从现象学转向分子特征。该转变导致若干发现如T细胞受体(TCR)的特征(见部分2.2，见下)。多种淋巴因子的鉴定，和MHC蛋白三维结构的阐明。然而，将分子克隆技术应用于T细胞介导的抑制的研究并未得到丰富的见识。例如，生化地纯化TsF至均质的尝试基本上是失败的。当小鼠MHC I区的基因被分离并测序时，在I-Eα和I-Eβ间并未显示有足够的DNA来说明I-J基因。而且，当一大组T细胞克隆和T细胞杂交瘤被检测TCRβ基因重排时，只有辅助和细胞毒性T细胞含有这样的重排而所有测试的Ts均为阴性，表明Ts可能不表达功能性受体(Hedrick等，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82531-535)。2.2 T细胞受体的结构和功能T细胞和B细胞对抗原反应的特异性是这些细胞表达的独特受体的功能。当发现B细胞以抗体形式分泌其受体后，B细胞受体研究的进展很快。浆细胞瘤是自然发生的，单克隆起源的抗体产生细胞的肿瘤。这些肿瘤提供连续来源的均质的蛋白质，用于最初的抗体分子结构的提纯和特征鉴定(Potter，1972，Physiol.Res.52631-710)。现已证实，除了细胞表面形式含有跨膜固定区外，抗体与它们的膜结合配对物是一致的(Tonegawa，1983，Nature 302575-581)。
另一方面，TCR方面的早期工作未能检测出一种TCR的分泌形式，因而使用可溶性抗体的方法不能被有效地采用。另外，T细胞抗原识别中MHC限制性的发现为TCR的分析增加了另一重困难(Zinkernagel和Doherty，1974，Nature 248701-702)。当时曾争议是单个TCR与抗原加MHC两者结合，还是涉及两个单独的受体。然而，看来清楚的是TCR不象是与B细胞受体相同。
在20世纪80年代，单克隆抗体，重组DNA技术和抗原特异性T细胞长期培养方法的发展的到来，大大易化了TCR的鉴定。针对克隆的T细胞群产生的单克隆抗体发现只与免疫的T细胞特异性地反应(Allison等，1982，J.Immunol.1292293；Haskin等，1983，J.Exp.Med.1571149；Samelion等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 806972)。使用这些克隆的特异性抗体免疫沉淀T细胞膜通过SDS-PAGE显示了一个46000道尔顿分子量的带。在非还原条件下，检测出90000道尔顿的带提示TCR具有二聚体结构。随后的实验确定了功能性的TCR是含有两个称为α和β的由二硫键连接的糖蛋白的异二聚体(Marrack和Kappler，1987，Science 2381073-1079)。大约在同时，从人和小鼠中分离出了编码α和β链的互补DNA(cDNA)克隆(Hedrick等，1984，Nature 308149-153；Hedrick等，1984，Nature 308153-158；Yanagi等，1984，Nature 308145-149)。cDNA的序列分析证明该编码序列由类似于抗体的重排基因片段的重排基因片段构成。结果显示将α和β基因转移入受体细胞对赋予受体细胞抗原特异性和MHC限制性是必需而且足够的(Dembic等，1986，Nature 320232-238)。因此，看来异二聚TCR是负责对抗原和MHC结合的识别的。一些研究提示α和β的可变区分别偏向于抗原的识别和MHC的识别(Kappler等，1987，Cell 49263-271；Winoto等，1986，Nature324679-682；Tan等，1988，Cell 54247-261)，而其它研究提示识别是整个受体自然发生的特性(Kuo和Hood，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 817614-7618；Danska等，1990，J.Exp.Med.17227-33)。
CD3是多肽复合体，它非共价地与TCR连接，并涉及由占据TCR所引发的导致T细胞激活的跨膜信号事件(Clevers等，1988，Ann.Rev.Immunol.6629)。结果表明用抗体直接刺激CD3能模拟T细胞激活的正常途径(Meuer等，1983，J.Exp.Med.158988)CD3要转运至T细胞表面需要它在细胞内与完整的异二聚TCR复合体的联结。也证实TCRα和β链的复合体和CD3多肽的复合体都在内质网中装配(Minami等，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 842688-2692；Alarcon等，1988.J.Biol.Chem.2362953-2961)。正确形成的完整的受体，TCR/CD3，随后作为功能单位被转运至细胞表面。装配不完整的受体复合体通过高尔基体转运至溶酶体，并在那里被降解。因此，通常未连接的α和β链似乎不到达T细胞外部。甚至在细胞外连完整的分泌形式的TCRα和β受体也不能检测到。因此，它们在抗原识别中的功能被认为仅限于T细胞表面和以异二聚体形式。
现已清楚，大多数的功能性T细胞都表达αβTCR。虽然包含γδ异二聚体的第二种类型的TCR已被鉴定，但这些受体只有很小比例的外周T细胞表达并且它们在抗原特异性识别中的作用尚仍需证实。结构上，T细胞的αβ和γδ受体在一级序列，基因结构和DNA重排模式方面与抗体分子高度同源(Davis和Bjorkman，1988，Nature 334395-402)。然而，T细胞抗原受体在两个主要方面不同于抗体TCR只在细胞表现发现和它们只识别MHC-编码分子结构中的抗原。2.3可溶性T细胞受体最近的研究提示在某些情况下TCR可从细胞排出或释放(Guy等，1989，Science 2441477-1480；Fairchild等，1990，J.Immunol.1452001-2009)。然而，尚未证实这些分泌的分子是完整的TCR，部分片断，还是具有TCR交叉反应表位的其它分子。在本文描述的实施例所证实的发现之前，功能上活性的TCRα链可从T细胞释放而不管剩下的TCR组份的观点是有争议的和受到怀疑的。Klausner和同事(Bonifacino等，1990，Science 24779-82)已证明除非与CD3δ复合，TCRα就被保留在内质网中并被降解，而且(Minami等，1987，Proc.Natl.Acad.Bci.USA 842688-2692)不作为CD3-TCR复合体的一部分而排出到细胞表面的TCRα在溶酶体中被降解。这些观察结果不支持TCRα可能从细胞释放的途径的存在。对类似地保留在内质网中并降解的TCRβ的研究(Wileman等，1990，Cell Regulation 1907-917)提示TCR的装配和转运要更加复杂。例如，在表达TCRβ转基因(Transgene)的SCID小鼠中，在缺乏TCRα或CD3成分时，TCRβ在未成熟胸腺细胞的表面上表达(Kishi等，1991，EMBOJ.1093-100)。进一步，构建了只包含VDJ和Cβ1结构域的截短的TCRβ链基因，而且被分泌出来。虽然预期这种分子会被降解(Gascoigne，1990，J.Biol.Chem.2659296-9301)。因此在一些细胞中存在这样的可能性，TCR可小量地被释放，可能以与其它未鉴定分子形成的复合体形式和/或以翻译后截短的形式。
一些实验报告存在一种未鉴定的可溶性调节因子或与针对TCRα的抗体反应的因子。例如，在CD4+辅助T细胞杂交瘤A1.1的体外测定中检测到无细胞免疫调节活性，该A1.1对合成的多肽抗原，poly 18，加I-Ad特异，该因子的抗原精细特异性与T细胞杂交瘤的精细特异性相对应(Zheng等，1988，J.Immunol.1401351-1358)。已发现对应于TCRVα和Vβ的反义寡核苷酸特异性地抑制细胞表面TCR-CD3表达，但只有Vα的反义而不是Vβ的(或对照寡核苷酸)抑制A1.1的可溶性调节活性的产生(Zheng等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 863758-3762)。在最近的研究中A1.1的抗原特异性调节活性被对TCRα特异性的单克隆抗体柱结合并从该柱上洗脱，并从代谢地标记的上清液分辨为46000道尔顿分子量的蛋白质；该活性不被抗TCRβ，抗TCRVβ，或抗CD3ε抗体结合(Bissonnette等，1991，J.Immunol.1462898-2907)。虽然共有TCRα链决定簇，不是从表面TCR衍生的Ts活性，有报告但未有特征描述(Collins等，1990，J.Immunol.1452809-2812)。Takada(1990，J.Immunol.1452846-2853)也报告了共有TCRα链决定簇的Ts活性，但它是MHC限制性的。与这些结果相反，Fairchild(1990，J.Immunol.1452001-2009)报告了与抗TCRCα反应但不与抗Vβ和抗TCR-β抗体反应的DNP特异性Ts因子。在本文所述的发明前，无人鉴定或阐明TCRα作为对观察到的抗原特异性调节作用负责的可溶性免疫调节介质的作用。
三种取代或取消TCR跨膜区的主要策略被试尝用于生产可溶性TCR分子。在最直接的方法中，翻译中止密码子被引入TCRα或TCRα/β二聚体的上游。在cDNA转染的COS-1细胞，COS-7细胞或Hela细胞，TCRα被报告可在进入高尔基体前在一种非溶酶体的结构中快速降解(Wileman等，J.Cell.Biol.，110973-986，1990；Lippincott-Schwartz等，Cell，54209-220，1988；Baniyash等，J.Biol.Chem.，2639874-9878，1988；Bonifacino等，Science，24779-82，1990；Bonifacino等，Cell，63505-513，1990；Manolios等，Science，249274-277，1990；Shin等，Science，2591901-1904，1993)。在第二种策略中，TCRα和β链的细胞外V和C结构阈被推至胞盘碱性磷酸酶或Thy-1分子的糖基磷脂酰肌醇膜固定装置上(Lin，等，Science，249677-679，1990；Slanetz等，Eur.J.Immunol.，21179-183，1991)。通过用磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C处理细胞，对应的脂连接的TCR多肽以可溶形式从膜上释放，并且可溶解的TCRαβ异二聚体显示与抗Clonotypic单克隆抗体特异性反应。但是，释放的TCR多肽产率过低，使该分子不能应用于临床使用。第3种方法是构建TCR的杂种蛋白质。用免疫球蛋白恒定区(Gregoire等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 888077-8081，1991；Weber等，Nature，356793-796，1992)和CD3Z(zeta)链(Engel，等，Science，2561318-1321，1992)。这些融合蛋白质由转染的骨髓瘤或白血病细胞分泌入培养液，并且这些可溶性TCRs显示保留了相应细胞表面结合TCR的所有血清学上可测定表位。然而，这些融合蛋白质显示抗原的低亲合性识别并可能是免疫原性的。此外，单独TCRα链的功能表达从未成功过。
以前已报告使用Vα和Vβ多肽的融合蛋白在大肠杆菌中表达TCR(见Hoo，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.894759-4763，1992)。然而，只有1％的蛋白质能以再折叠蛋白质形式回收。在本发明中，再折叠蛋白质的产量与典型的可溶性蛋白质如细胞因子同样多，这使之有可能为临床应用提供均质的TCRα分子。
为在大肠杆菌中表达动物蛋白质，很多研究者发展了各种系统。然而，在此微生物中表达异源基因时常遇到一些困难。例如大肠杆菌和动物基因在它们的密码子使用类型和翻译起始信号两方面的显著不同，可妨碍在细菌的核糖体上对动物mRNA的有效翻译(Orormo，等，Nucl.AcidsRes.102971-2996，1982)。换言之，在大肠杆菌中合成的异源蛋白质由于宿主细胞的蛋白水解酶活性可能不能积累到显著水平(Gottesman.，Annu.Rev.Genet.，23163-198，1989)。另外，治疗学上有用的蛋白质的物理特性可引起问题，因为一些分泌的分子或膜相关分子如TCR为了稳定性和可溶性需要糖基化和二硫键连接。因为在细菌细胞质中不能得到这样的稳定化过程，在大肠杆菌内产生的异源蛋白质常形成被称为“包涵体”的不可溶聚合体(Schein，等，Bio/Technology.71141-1149，1989)。本发明提供在大肠杆菌包涵体中表达截短形式的TCRα多肽和再折叠并提纯有生物活性TCRα的方法。
3.本发明的概要本发明涉及应用TCRα链从抗原特异性方式调节免疫反应的方法。表现下列两种可在体外被评价的重要特性的TCRα链被用于生产和使用本发明的实践中本发明的方法中使用的TCRα链必须能够结合所研究的抗原，和在本文描述的辅助成分存在下调节针对此抗原产生的特异性免疫反应，即，通过抑制或增强该抗原特异性免疫反应。
表现这种特性的TCRα链可有利地用于在人类或动物体内或在体外抗原特异性免疫反应的下调或上调的方法中。例如，在超免疫的反应的病人，如过敏，自身免疫疾病，或移植物排异中，在辅助成分的存在下，可体内施用抑制抗原特异性免疫反应的针对该反应原的有效剂量的TCRα链。相反地，免疫抑制的病人的体液可测到表现免疫抑制作用的可溶性TCRα链存在。可通过使用对TCRα链特异性的抗体，或抑制TCRα链表达的反义寡核苷酸去除或中和可溶性TCRα链获得病人对抗原免疫反应的增强。
在本文中描述了可用于评价本发明中使用的TCRα链的体外测定法。例如，一些免疫亲合技术可用于评价抗原结合，和下文中详述的斑形成细胞(PFC)法(以后称为“PFC”法)可用于评价所检测的TCRα链的调节功能。简言之，在PFC测定中在辅助成分存在下，将被检测的TCRα链加至含有所感兴趣的抗原的脾细胞培养体系中，该抗原与免疫原性的，可溶解(lysable)载体如外源性红血细胞结合。通过测定经数天后所产生的免疫反应来评价TCRα链的免疫调节作用，如培养中空斑形成细胞的产生所表明的那样。即这种免疫反应产生的细胞生产针对载体(如红细胞)的补体固定的抗体，并且这些细胞可通过一种细胞与补体和载体(如红细胞)混合并形成单层的测定法检测。载体的溶解导致形成一个清楚的空斑，对应于一个空斑形成细胞(PFC)的存在。抑制培养中PFC的产生表明即抑制了由对偶联的抗原特异性的TCRα链所介导的免疫反应。如在下文中更详细地解释的，用于测定的辅助成分是从去除了可溶性成分如TCRα链的受刺激的T细胞上清液制备，这些可溶性因子直接与用于刺激T细胞的抗原结合。除非TCRα链存在，该辅助成分本身对免疫反应无作用。
本发明部分基于组成性的由T细胞杂交瘤分泌的可溶性TCRα链的发现。如在工作实施例中所证实，这种分泌的TCRα链能直接结合于其抗原，并在辅助成分存在下，抑制通常针对该抗原产生的免疫反应。然而，本发明不限于使用自然分泌的TCRα链，因为任何TCRα链基因可被克隆，表达并且使用本文描述的技术和方法测定这些基因产物在本发明的实践中的适合性。另外，本文描述的测定法可用于评价其它分子，如抗体，其它TCR成分，它们以抗原特异性方式显示免疫调节功能。
在本发明的一项实施方案中，提供了基于使用大鼠钙调蛋白作为融合伴侣(fusion partner)的一种新的融合基因表达系统。该系统可优选用于具有生物活性的TCRα蛋白的高表达和提纯。大鼠钙调蛋白在大肠杆菌中通过使用含有大肠杆菌trp启动子和trpA终止子的表达载体表达成功(Matsuki等，Biotech，Appl.Biochem.，12284-291，1990)。在此系统中，大鼠钙调蛋白cDNA被修饰以去除5’-非翻译序列并为大肠杆菌核糖体结合位点掺入了合适的序列。为配合围绕翻译起始密码子的大肠杆菌一致核苷酸序列，而选择了数种N-末端氨基酸的密码子。通过在大肠杆菌中诱导表达，可溶级钙调蛋白占总细胞蛋白质的30％以上。通过使用苯基琼脂糖凝胶柱层析，约100mg90％纯度的重组钙调蛋白可从1升培养液中得到。在本发明中为在大鼠钙调蛋白基因3’末端融合TCRα基因，由凝血酶识别的(Chang，Eur.J.Biochem.，151217-224，1985)编码蛋白水解酶裂解位点的附加序列，Lys-Val-Pro-Arg-Gly(SEQ ID NO1)，被插入钙调蛋白的C-末端。本方法有许多原因使分离TCRα蛋白成为可能1)表达水平高，2)融合蛋白以可溶形式表达，3)蛋白质的提纯惊人地容易，4)每个TCRα蛋白的单个再折叠过程是不必要的。
4.图的简述
图1A和B.T细胞杂交瘤3-1-V，产生辅助成分，在存在得自A1.1细胞的抗原特异性TCRα链时介导免疫调节活性。图2.从A1.1细胞分离的TCRα基因的完整核苷酸序列。在该基因的恒定区下划线。(SEQ ID NO14)。图3.TCRα从A1.1细胞向175.2细胞的基因传递(175.2-A1.1α)传递了产生抗原特异性调节活性的能力。(A)A1.1 TCRα传递前后CD3在175.2细胞上的表达。在存在(B)相关抗原，(C)仅有载体(SRBC)，和(D)不相关对照抗原(SEQ ID NO15)时A1.1和175.2-A1.1α上清液中的抗原特异性调节活性。图4.来自杂交瘤A1.1的TCRα链调节活性测试中使用的肽(SEQ IDNOS16，17，18，19，20，21，22，23和24)。图5.A1.1细胞产生的免疫调节活性被针对TCRα链的抗体中和。图6(A)和(B).在A1.1 TCRα传递后在图6(A)AF5和图6(B)AF6细胞(175.2的两个亚克隆)上CD3的表达和用抗CD3抗体选择。图7A和B.TCRα从BB19细胞向175.2细胞的基因传递不传递产生抗SRBC PFC测定显示的抗原特异性免疫调节活性的能力。图8.TCRα从A1.1细胞向B9细胞(B9-A1.1α)的基因传递传递产生抗原特异性调节活性的能力。图9.从B9-A1.1α释放的调节活性被抗TCRα结合并显示与A1.1细胞的活性相同的抗原特异性。图10A和B.A1.1 TCRα在缺乏TCRβ的细胞中的表达足以产生抗原特异性调节活性。图11A.在A1.1和其它表达A1.1 TCRα的细胞系的上清液中的抗原特异性结合活性。图11B.肽对在A1.1和其它表达A1.1 TCRα的细胞系的上清液中抗原特异性结合活性的竞争。图12.体外翻译的A1.1 TCRα和β多肽的SDS-PAGE。图13A和B.体外翻译的A1.1 TCRα基因产物的调节活性被抗TCRα而不被抗TCRβ结合。图14.显示A1.1 TCRαcDNA的完整核苷酸序列和推断的氨基酸序列(SEQ ID NOS25和26)。图15.显示3B3衍生的TCRαcDNA的完整核苷酸和推断的氨基酸序列(SEQ ID NOS27和28)。图16.显示携带trp启动子和trpA终止子的表达质粒PST811。图17.显示表达质粒PST811-A1.1 TCRαS5。图18.显示携带大鼠钙调蛋白cDNA和trp启动子的表达质粒PTCAL7。图19.显示携带大鼠钙调蛋白和trp启动子并含有来自PTCAL7的附加克隆位点的表达质粒PCF1。图20.显示表达质粒PCF1-3B3 TCRα。图21.显示来自两个表达质粒的大肠杆菌产生的钙调蛋白-TCRα的SDS-PAGE。图22.大肠杆菌表达的A1.1 TCRαS5蛋白的SDS-PAGE。图23.大肠杆菌表达的3B3 TCRα(钙调蛋白-TCRα融合蛋白)的SDS-PAGE。图24a.重组体A1.1 TCRαS5的免疫抑制活性是剂量信赖的。图24b.重组体A1.1 TCRαS3的免疫抑制活性是剂量信赖的。图25.在使用poly-18或EYKEYAEYAEYAEYA(SEQ ID NO2)时可观察到TCRα链的免疫抑制活性。
5.发明详述本发明涉及在抗原特异性免疫反应中使用T细胞抗原受体的抗原结合链。按照本发明的一个方面，评价TCRα链结合抗原和调节针对该抗原的特异免疫反应的能力。本文描述了可用于此目的的体外测定法。表现适当活性的TCRα链可用如重组DNA和/或化学合成方法大量生产并可用于对特异抗原免疫反应的下调或上调。例如，超敏反应，自身免疫反应和移植物排异反应可通过使用对相应抗原特异并诱导抗原特异性抑制的TCRα链而被抑制。另外，可通过去除这种α链，或通过抑制在受试者中产生这种α链增强对抗原的免疫性，以特异性地增强针对特定抗原的免疫反应。相反地，增强对抗原的免疫反应的TCRα链可被鉴定和使用。
本发明部分基于分泌形式的TCRα链的发现，该链直接与抗原结合并抑制针对该抗原产生的免疫反应。特别地，对合成多肽抗原，poly 18，加I-Ad特异性的CD4+辅助T细胞杂交瘤A1.1被描述，它组成性的释放其与抗原结合的TCRα链的分泌形式，并在合适的辅助成分存在下，抑制对该抗原的免疫反应。本文描述的A1.1 TCRα链基因的分离与其传递入poly 18非活性T细胞系(见下文第6部分)，以及A1.1 TCRα链基因体外转录和翻译产物介导这种调节活性的证实(见下文第7部分)，证明了是TCRα链基因而不是TCRβ链基因负责编码调节因子，该调节因子直接结合抗原并介导调节功能。
TCRα链的产生和其作为抗原特异性免疫调节剂的应用在下面部分中详细描述和举例说明。5.1 TCRα链的生产本发明涉及具有抗原结合和免疫调节活性两者的TCRα链(不是完整T细胞表面抗原受体α和β)。具有抗原特异性调节活性的抗原结合TCRα蛋白可用多种方法生产。例如，TCRα链蛋白的表达可通过重组DNA技术和/或基于已知氨基酸序列的化学合成技术获得。另外，TCRα链可从释放此活性的连续T细胞系的培养上清液直接提纯。5.1.1 TCRα链的评价不管使用什么方法生产这样的TCRα链，都应该评价该分子的抗原结合力和免疫调节活性。例如，TCRα链直接与所研究抗原结合的能力可通过改进的免疫测定技术评价，这些技术包括但不限于ELISA(酶联免疫吸附测定法)，免疫沉淀，Western印迹，或放射免疫测定法，其中在这些方法中通常使的抗体被TCRα链取代。
抗原结合TCRα链的免疫调节能力可使用允许以抗原特异方式检测免疫反应的任何测定系统予以评价。例如本文描述和例举的PFC测定法可用于鉴定抑制直接针对特定抗原的免疫反应的TCRα链。当脾细胞在高度免疫原性载体如绵羊红细胞(SRBC)存在下培养时，一种导致空斑形成细胞产生的免疫反应发生了。通过将培养的脾细胞与SRBC(或适合的可溶解载体)和补体混合，并将混合物培养为单层，确定每一培养产生的PFC数。被一个清楚的空斑(即溶解的红细胞)围绕的细胞计数为PFCs。脾细胞培养中PFC产生的抑制，即PFC/培养物数的减少，表示免疫反应的抑制。为测试TCRα链的抑制活性，并保证此抑制为抗原特异性的，PFC测定可按下述进行将被研究抗原与SRBC连接(Ag-SRBC)并加入未免疫小鼠的脾细胞中。通过在存在下述辅助成分时(即，辅助成分应在被测试的TCRα链前或同时加至培养物中)向培养物中加入被测TCRα链评价针对抗原特异的TCRα链的免疫调节作用。对照培养物在缺乏辅助成分时加入TCRα链或反过来加入TCRα但又缺乏辅助成分，或者可涉及非相关抗原的应用。培养后，确定每种情况的PFC/培养数。与在对照组中所观察到的相比，被测试培养物中PFC产生的抑制表明被测TCRα链以抗原特异性方式抑制通常在该培养系统中产生的免疫反应。
在测定系统中使用的辅助成分包括去除了任何可溶性因子的被刺激T细胞上清液。这些可溶性因子，包括TCRα链，它可直接与用于刺激该T细胞的抗原结合。因此这些辅助成分本身不抑制免疫反应。这些辅助成分得自在体内用抗原-特异性PFC测定的载体/指示剂刺激的T细胞例如，下述步骤可用于制备供上述PFC测定系统使用的辅助成分，以其中的靶是Ag-SRBC。得自SRBC-免疫的小鼠的脾细胞被去除B细胞后，将浓缩的T细胞培养或用于产生一个可再生的连续供给培养上清液的T细胞杂交瘤。使用PFC测定法测试T细胞培养物上清液抑制抗-SRBC免疫反应的能力，其中SRBC是在存在或缺乏T细胞上清液情况下被加至培养的脾细胞中。被发现可抑制抗SRBC反应的T细胞培养上清液随后用SRBC吸收以去除任何可溶性因子如可与SRBC直接结合的可溶性TCRα链。随后使用PFC测定法测试被吸附的上清液抑制抗SRBC免疫反应的能力。不抑制抗SRBC反应的那些被吸附的上清液被用作PFC测定法中的辅助成分，该PFC测定法被设计用于鉴定表现抗原特异性免疫抑制活性的TCRα链(即，使用Ag-SRBC靶的PFC测定法)。另外，可得到不需要吸附步骤产生辅助成分的T细胞杂交瘤；例如，下文中第8部分中描述的杂交瘤3-1-V(见图1)组成性的在培养上清液中产生辅助成分。因此，辅助成分本身无抑制性，它含有一或多种因子，可使抗原特异性因子即TCRα链以抗原-特异性方式抑制免疫反应。这种测定系统的实例在下文6.1.5部分中给出。
相反地，增强免疫反应的TCRα链也可用类似方法鉴定。在这种情况下，一种证实在吸收前增加PFC产生而吸收后无活性的，从T细胞杂交瘤或从T细胞培养上清液制备的辅助成分可被用于PFC测定法中，该PFC测定法被设计用于鉴定以抗原特异性方式增强针对Ag-SRBC的免疫反应的TCRα链。
由于上述测定系统使用未接触抗原的脾细胞培养物测定免疫反应，和接触载体的脾细胞培养物制备辅助成分，所用的培养的脾细胞可限于是动物材料来源的(如，小鼠、大鼠、兔、和非人类灵长类)。然而，这不妨碍它们用于测定人类TCRα链的免疫调节活性。实际上许多人类免疫功能可在基于动物的测定系统中检测；例如，人类抗体效应物功能如补体介导的溶解作用和抗体依赖的细胞的细胞毒性可分别使用动物血清和动物效应物细胞证实。然而，使用人类细胞培养物取代动物脾细胞培养物改良PFC测定法可能是优选的。例如，可使用Thomas等人，1980，J.Immunol.1252402中描述的反相溶血PFC测定法(亦参见Thomas，1982，J.Immunol.1281386)评价TCRα链对针对特定抗原的免疫反应的作用。美国商陆有丝分裂原刺激的T细胞上清液可用作本测定系统中辅助成分的一种来源。5.1.2.细胞的选择用作TCRα链来源和/或用于产生在本发明方法中使用的用以产生TCRα链的遗传学材料来源的抗原特异性T细胞可用本领域中熟知的一些体外技术产生和选择。T细胞的来源可为外周血，淋巴结，脾，和其它淋巴样器官以及T细胞已侵润的组织位点如肿瘤结节。T细胞类群可通过密度梯度离心或使用针对T细胞表面标记如CD2，CD3，CD4，CD8等的抗体的细胞分选方法与其它细胞类型分离。这些方法包括但不限于淘洗法，亲合层析法，流式细胞计，磁珠分离。也可采用负选择方法以浓缩T细胞包括通过使用针对不被T细胞表达的标记的抗体或利用非T细胞的膜特性如对各种基质的粘附去除非T细胞群。所研究的T细胞亚群的进一步选择可应用上述技术，这些技术使用针对更特异标记物的抗体如分别选择辅助和细胞毒/抑制T细胞的抗CD4和抗CD8，或针对在T细胞亚群如记忆细胞上表达的标记物的抗体。
抗原特异性T细胞系可在适当的经射线照射的抗原呈递细胞和细胞因子存在下用最适浓度的特异性抗原反复刺激在体外产生。抗原呈递细胞应得自自身的或MHC相匹配的来源，他们可为巨噬细胞，树突状细胞，郎格尔汉斯细胞，EBV转化的B细胞或未分离的外周血单核细胞。细胞因子可包括各种血介素如自然的或重组形式的自介素1，2，4，和6。这种技术，参见，如Takata等，1990，J.Immunol.1452846-2853。
抗原特异性T细胞的克隆群可通过在经射线照射的滋养细胞，抗原和细胞因子存在下使用有限稀释克隆法的T细胞克隆术取得。替代地，T细胞杂交瘤可通过将抗原特异性T细胞与融合伴侣(fusion partner)肿瘤系如BW5 147或BW1100融继以HAT选择和再克隆而产生。抗原特异性T细胞也可通过使用对CD3的单克隆抗体克隆和繁殖。T细胞克隆和T细胞杂交瘤可使用直接由体内来源的细胞产生并随后对抗原特异性进行测试和选择，或抗原特异性T细胞系在克隆和融合事件前得到。通过每7～14天用抗原或抗-CD3反复刺激随后用细胞因子扩大(expansion)，T细胞克隆可在培养中长期维持，而T细胞杂交瘤不需周期性抗原刺激就可在合适培养基中生长。
单克隆T细胞群的抗原特异性可在测定增殖和/或这些细胞对抗原反应的淋巴因子产量的体外测定中被评价。T细胞的表型可通过用针对各种T细胞标记物的抗体染色来证实。
这种抗原特异性T细胞可组成性的分泌TCRα链或它们可能需要激活信号以供释放它们的α链。优选地，抗原特异性T细胞可被用作通过重组DNA和/或化学合成技术生产TCRα链所需要的遗传学物质来源。使用这种方法，某些不能分泌自然产生的TCRα链的抗原特异性T细胞可用作本发明使用的TCRα链的遗传学物质来源。5.1.3 TCRα链编码序列的分离用于制备cDNA的信使RNA(mRNA)可来自产生所要的α链的细胞，而TCRα基因组序列可得自任何细胞来源。按照上文5.1.2部分中所述产生的任何T细胞既可用作TCRα链编码序列来源，又和./或可用于制备cDNA或基因组文库。另外部分淋巴器官(如脾、淋巴结、胸腺、和外周血淋巴细胞)可被研碎并用作提取DNA或RNA的来源。替代地，T细胞系可用作方便的DNA或RNA来源。遗传操纵的含有TCRα编码序列的微生物或细胞系可用作此目的的方便的DNA来源。
cDNA或基因组文库可从用本领域熟知技术产生的DNA片段制备。编码TCRα的片段可通过用与TCRα序列的一部分同源的核苷酸探针筛选这种文库来鉴定。在这点上，应指出人和小鼠中有一个TCRα的单一恒定区基因(Cα)。由于编码此二物种Cα的核苷酸序列是已知的，可用本领域中标准方法合成与恒定区同源的DNA探针并用于从上文5.1.2部分中描述的T细胞分离TCRα基因或mRNA转录本，TCRα基因或mRNA转录本可用于合成TCRα，cDNA或在从这种T细胞或基因组克隆制备的cDNA文库中鉴定合适的TCRα序列。替代地，也可构建针对所需的TCRα链的可变区特异的寡核苷酸，但这些必须在一例一例的基础上设计，信赖于可变区的序列。在此方面，基于恒定区设计的寡核苷酸探针具有优越性，因为它们可用于“探出”任何TCRα链基因或编码序列。虽然编码序列的部分可用于克隆和表达，全长克隆即那些含TCRα整个编码区者，对于表达可能是优选的。为此，用于分离DNA，产生合适限制性片段，构建克隆和文库，和筛取重组体的，可使用本领域技术人员熟知的技术。本领域技术人员熟知的各种方法可用于此。见，如，在Maniatis等，1989，分子克隆，实验室手册，Cold Spring HarborLaboratory，纽约，中描述的各种技术。在一项特别实施方案中，在下文6部分中以示例方式从T细胞杂交瘤A1.1分离了TCRα链基因的完整核苷酸编码序列，描绘于图2中。
替代地，得自特异TCRα序列的寡核苷酸探针可用作PCR(多聚酶链反应)方法中的引物，以产生可被直接克隆的TCRα序列的cDNA或基因组拷贝。这种PCR技术的综述，见，如，Gelfand，D.H.1989，“PCRTechnology.Principles and Applicutions for DNA Amplification”Ed.，H.A.Erlish，Stockton Press，纽约，和“Current-protocols inmolecutar Biology”卷2，Ch.15，Eds.Ausubel等，John Wiley &Sons，1988。
不管选择任何方法去鉴定和克隆TCRα编码序列，可用表达克隆方法基本减去筛选的努力。最近报告了一种用于克隆和表达抗体的一步法(McCaffererty等，1990，Nature 348552-554；Winter和Milstein 1991，Nature 3492-299)。基于此技术，TCRα链基因可在邻近噬菌体如λ或fd的包被蛋白基因的位点被直接克隆入载体。携带TCRα基因的噬菌体在其表面表达融合蛋白，这样可用含抗原或TCRα特异性抗体的柱通过亲合活性分离噬菌体颗粒。暂时的基因表达系统可用于鉴定正确的TCRα基因。例如，可使用COS细胞系统(如Cerard & Gluzman，1986，Mol.Cell.Biol.6(12)4570-4577)；然而，TCRα链的表达应在已被CD3δ链基因转染的COS细胞提取液中被检测(Bonifacin等，1990，Cell 63503-513)。
由于核苷酸编码序列的简并性，编码任何已知抗原特异性TCRα链基因的类似氨基酸序列的其它DNA序列可用于本发明TCRα克隆和表达的实践中。这种改变包括缺失，添加或不同核苷酸残基的替换导致编码相同或功能相当的基因产物。这种基因产物可包含序列中氨基酸残基的缺失，添加或替换，导致静止变化从而产生生物活性产物。这种氨基酸替换可在所涉及的残基在极性电荷，可溶性，疏水性，亲水性和/或两亲性方面类似性的基础上制造。例如，带负电的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸，带正电的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；带有具有类似亲水值的不带电极性头基团的氨基酸包括下列亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸；甘氨酸，丙氨酸；天冬酰胺，谷氨酰胺；丝氨酸，苏氨酸；苯丙氨酸，酪氨酸。
TCRα链序列可被修饰以取得供体内使用的改良特性的基因产物，如改良稳定性和半衰期。例如，杂种基因可通过将TCRα链基因，或其可变区，连接于人类免疫球蛋白基因如IgG的恒定区构建。为可应用的技术，可参见Capon等，1989，Nature 337525-531。5.1.4.α链编码序列的表达为表达具有生物活性的TCRα链，将上文5.1.3部分中描述的编码TCRα的核苷酸序列或功能相当物插入合适的表达载体，即，含有转录和翻译所插入的编码序列所必须的元件的载体。可构建TCRα编码序列的改良型以增加表达产物的稳定性，产量，提纯和产出。例如，可构建表达融合蛋白或包含TCRα和异源蛋白的可剪切融合蛋白。这种融合蛋白可用亲和层析法很容易地分离；例如，通过固定在对异源蛋白特异性的柱上。由于将剪切位点构建在TCRα部分和异源蛋白之间，TCRα链可通过用破坏剪切位点的合适的酶或试剂处理而从层析柱上释放(如，见Booth等，1988，Immunol.Lett.1965-70；和Gardella等，1990，J.Biol.Chem.26515854-15859)。
可用本领域技术人员熟知的方法构建含TCRα编码序列和合适转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术，合成技术和体内重组/遗传学重组。见，如，Maniatis等，1989，MolecularCloning A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.中描述的技术。
许多宿主表达载体系统可用于表达TCRα编码序列。这些包括但不限于微生物如用含有TCRα编码序列的重组体噬菌体DNA，质粒DNA或柯斯质粒DNA表达载体转化的细菌；用含TCRα编码序列的重组体酵母表达载体转化的酵母；用重组体病毒表达载体(如，花椰菜镶嵌病毒，CaMV；烟草镶嵌病毒，TMV)感染的或用含TCRα编码序列的重组质粒表达载体(如，Ti质粒)转化的植物细胞体系；用含TCRα编码序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用含TCRα编码序列的重组病毒表达载体(如，逆转录病毒，腺病毒，牛痘病毒)感染的动物细胞，或为稳定表达而构建的转化的动物细胞系统。如下文第7部分中工作实施例所证实，TCRα免疫调节活性似乎不需要表达产物的糖基化。因此，细菌表达体系将有利于大量生产TCRα产物。然而，糖基化对体内应用可能是重要的，尽管它对免疫调节活性是不必要的；例如，糖基化产物显示在体内半衰期增长。在这种情况下，可采用提供翻译和翻译后修饰的表达系统；如，哺乳类，昆虫，酵母菌或植物表达系统。
按照所采用的宿主/载体系统，一些合适的转录或翻译元件中任何一个，包括组成性和可诱导性启动子，转录增强子元件，转录终止子等，可在表达载体中使用(见，如，Bitter等，1987，Methods inEnzymology 153516-544)。例如，当在细菌系统中克隆时，可应用可诱导的启动子如噬菌体λ的PL，plac，ptrp，ptac(ptrp-lac杂合启动子)。当在哺乳动物细胞系统中克隆时，可应用来源于哺乳动物细胞基因组(如金属硫因(metallothionein)启动子)或来源于哺乳动物病毒(如逆转录病毒长末端重复序列；腺病毒迟启动子；牛痘病毒7.5K启动子)的启动子。也可用重组DNA或合成技术生产的启动子转录插入的TCRα编码序列。
在细菌系统中，可根据对表达TCRα的用途有利与不选用一些表达载体。例如，当希望大量生产TCRα时，所需要的是能指导高水平表达易于提纯的融合蛋白产物的载体。优选的是那些构建有一个助于TCRα回收的剪切位点的载体。这种载体包括但不限于大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther等，1983，EMBO.J.2l791)，其中TCRα编码序列可在带有1acZ编码区的框架区连接于载体，从而产生杂种TCRα-lacZ蛋白；pIN载体(Inouye & Inouye，1985，Nucleic acid Res.133101-3109；Van Heeke & Schuster，1989，J.Biol.Chem.2645503-5509)；等。在酵母中，许多含组成性的或可诱导的启动子的载体可被应用。综述，见Current Protocols in Molecular-Biology Vol 2，1988，Ed.Ausubel等，Greene Publish ASSOC. & Wiley Interscience，Ch，.13，Grant等，1987，Expression and Secretion Vectors foryeast，在Methods in Enzymology中，Eds，Wu & Grossman，31987，Acad Press，纽约，Vol 153，pp516-544；Glover，1986，DNACloning，Vol.II，IRL Press，Wash.，D.C.，Ch.3，和Bitter，1987，Heterologous Gene Expression in Yeast，Methods in Enzymology，Eds.Berger & Kimmel，Acad.Press，纽约，Vol.152，pp 673-684；和The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces，1982，Eds.Strathem等，Cold Spring Harbor Press，Vols I和II。可使用组成性的酵母菌启动子如ADH或LEU 2或可诱导的启动子如GAL(Cloning in Yeast，Ch.3，R.Rothstein于DNA Cloning Vol.11，A Practical Approach，Ed.DM Glover，1986，IRL.Press，Wash.，D.C.)。替代地，可使用促使外源DNA序列掺入酵母菌染色体的载体。
在使用植物表达载体的情况下，TCRα编码序列的表达可被许多启动子中任何一个启动。例如，病毒启动子如CaMV的35S RNA和19S RNA启动子(Brisson等，1984，Nature 310511-514)，或TMV的包被蛋白启动子(Takamatsu等，1987，EMBO J.6307-311)可被使用；替代地，可使用植物启动子如RUBISCO的小亚单位(Coruzzi等，1984，EMBO J.31671-1680；Broglie等，1984，Science 224838-843)；或热休克启动子如大豆hsp 17.5-E或hsp 17.3-B(Gurley等，1986，Mol.Cell.Biol.6559-565)。这些结构可使用Ti质粒，Ri质粒，植物病毒载体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等方法引入植物细胞。为综述这些技术见，如Weissbach & Weissbach，1988，Methods for Plant Molecular Biology，Academic Press，纽约，Section VIII，pp 421-463；和Grierson & Corey，1988，PlantMolecular Biology，2d Ed.，Blackie，伦敦，Ch.7-9。
可用于表达TCRα的另一个表达系统是一种昆虫系统。在一种这样的系统中，苜蓿银纹夜蛾核多角体病病毒(AcNPV)被用作表达外源基因的载体。该病毒在草地贪夜蛾细胞中生长。该TCRα编码序列可被克隆入病毒的次要区(如polyhedrin基因)并置于AcNPV启动子(如polyhedrin启动子)的控制下。TCRα编码序列的成功插入将导致polyhedrin基因的灭活和产生非封闭型的重组体病毒(即，缺乏由polyhedrin基因编码的蛋白的包被)。这些重组体病毒随后用于感染草地贪夜蛾细胞，在这些细胞中表达所插入的基因。(如，见Smith等，1983，J.Viol.46584；Smith U.S.Patent No.4215051)。
真核系统，并优选哺乳动物表达系统，允许被表达哺乳动物蛋白的适当翻译后修饰发生。具有供适当加工初级转录本，糖基化，磷酸化和进一步分泌基因产物的细胞机器的真核细胞应用作表达TCRα的宿主细胞。优选哺乳动物细胞系。这样的宿主细胞系可包括但不限于CHO，VERO，BHK，Hela，COS，MDCK，-293，和WI38。
可能TCRα在T细胞宿主中的产生增加其活性，例如，因为优先加工和/或与其它T细胞分子相联系。当希望这种表达时，T细胞宿主包括但不限于T细胞肿瘤细胞系，T细胞杂交瘤，产生辅助成分的T细胞，或可应用产生免疫调节因子的T细胞。
可构建利用重组体病毒或病毒元件进行直接表达的哺乳动物细胞。例如，当使用腺病毒表达载体时，TCRα编码序列可与腺病毒转录/翻译控制复合体连接，例如，迟启动子和分成三部分的先导序列。该嵌合基因可随后通过体外或体内重组插入腺病毒基因组。病毒基因组的非必要区(如E1区或3区)中的插入将导致产生存活的并能在被感染的宿主中表达TCRα链的重组体病毒(例如，见Logan & Shenk，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 813655-3659)。或者，可使用牛痘病毒7.5k启动子(例如，见Mackett等，1982，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 797415-7419；Mackett等，1984，J.Virol.49857-864；Panicali等，1982，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 794927-4931)。特别有兴趣的是基于具有作为染色体外元件复制能力的牛乳头状瘤病毒的载体(Sarver等，1981，Mol.Cell.Biol.1486)。这种DNA进入小鼠细胞不久，质粒复制约每细胞100至200拷贝。插入的cDNA的转录不需要质粒掺入宿主染色体中，因而产生高水平的表达。通过在质粒中包括进一个可选择的标记如neo基因，这些载体可用于稳定表达。另外，逆转录病毒基因组可被修饰以供用作载体，此载体能在宿主细胞中引入和指导TCRα链基因的表达(Cone & Mulligan，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA816349-6353)。高水平表达还可得自应用可诱导的启动子。包括，但不限于，金属硫因(metallo thionine)IIA启动子和热休克启动子。
为了长期，高产量的生产重组体蛋白，应优选稳定的表达。宿主可被由适当表达控制元件(如，启动子，增强子，序列，转录终止子，多腺苷酸化位点等)，和可选择标记的TCRα cDNA转化，而不是使用含有病毒复制起点的表达载体。重组体质粒的可选择性标记授予对选择的抗药性并允许细胞将质粒稳定地掺入染色体中并生长形成中心，此中心随后可被克隆并扩展形成细胞系。例如，在外源DNA引入后，构建的细胞可在富营养化培养基中培养1-2天，随后转换至选择性培养基。许多选择系统可被使用，包括但不限于单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(Wigler等，1977，Cell.11223)，次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖基酶(Szybalska& Szybalski，1962，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 482026)，和腺苷转磷酸核糖基酶(Lowy等，1980 Cell 22817)基因可分别用于tk-，hgprt-、或aprt-细胞。另外，抗代谢物抗药性可被用作下列选择的基础授予对氨甲喋呤抗药性的dhfr(Wigler等，1980，Natl.Acad.Sci.USA773567；O’Hare等，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 781527)；授予对霉酚酸抗药性的gpt(Mulligan & Berg，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 782072)授予对氨基糖苷G418抗药性的neo(Colberre-Garapin等，1981，J.Mol.Biol.1501)和授予对匀霉素抗药性的hygro(Santerre等，1984，Gene 30147)。最近，其它可选择的基因已被描述，即，trpB，它可允许细胞使用吲哚替换色氨酸；hisD，它允许细胞使用histinol替换组氨酸(Hartman & Mulligan，1988)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 858047)；和DOC(鸟氨酸脱羧酶)它授予对鸟氨酸脱羧酶抑制剂2-(二氟甲基)-DL-鸟氨酸，DFMO的抗药性(McConlogue L.1987，在Current Communications in MolecularBiology，Cold Spring Harbor Laboratory ed.中)。5.1.5 TCRα链表达产物的提纯用遗传操纵的细胞表达的TCRα蛋白产物可用免疫学方法测定，如Western印迹，免疫测定如放射免疫沉淀，酶联免疫测定等。然而该表达系统成功的最终测定涉及生物活性TCRα基因产物的产生。当宿主细胞分泌基因产物时，可测定来自培养的转染的宿主细胞的无细胞培养基的TCRα或其免疫调节活性。当基因产物不被分泌时，可测定细胞溶解物的这种活性。在这两种情况下，可使用许多测定法以确定TCRα活性，包括但不限于测定被表达的TCRα结合抗原的能力的测定法，评价其免疫学功能的测定法，如在上文5.1.1部分中描述并在下文6.1.5部分中例举的PFC测定法。
一旦一种产高水平生物活性TCRα的克隆被鉴定，该克隆即可被扩大并用于生产大量蛋白质，并用本领域中熟知的技术提纯，这些技术包括但不限于免疫亲和提纯，色谱方法包括高效液相色谱法等。当蛋白质由培养的细胞分泌时，TCRα可很容易地从培养液中回收。
从T细胞粗培养液提纯TCRα的方法可适用于克隆表达的产物的提纯。如，在下文实施例中使用的得自A1.1细胞的TCRα可从T细胞粗培养液中通过硫酸铵沉淀继以亲合层析法提纯(Zheng等，1988，J.Immunol 1401351-1358；Bissonnette等，1991，J.Immunol.1462898-2907)。对所有鼠TCRα链上共亨的决定簇或含有其特异性抗原性表位的抗原或片段特异的纯化的单克隆抗体可偶联在溴化氰活化的Sepharose 4B(Pharmacia)上并用于亲合层析。结果表明以此方法从粗培养液提纯的蛋白质的生物活性已浓缩了3000倍。替代地，如果知道哪一个特异性Vα基因片段编码所研究的α链蛋白，可使用针对不同Vα基因族产物的抗体。此外，可产生针对特异性TCRα链可变区的抗体并用于从其它非相关TCRα链中提纯该α链。在这种情况下，只要足够量的蛋白存在，特异性α链甚至可从大量培养的T细胞粗培养液中分离。
当TCRα编码序列被构建成编码一种可剪切的融合蛋白时，TCRα的提纯应用亲合层析技术而很易于完成。例如，蛋白酶因子Xa剪切识别序列可构建在TCRα羧基末端和麦芽糖结合蛋白之间。所产生的融合蛋白在使用直链淀粉结合的柱子时很容易提纯，麦芽糖结合蛋白与直链淀粉结合。随后用含麦芽糖的缓冲液将TCRα融合蛋白从柱上洗脱，然后用因子Xa处理。被剪切的TCRα链通过第2个直链淀粉柱而去除麦芽糖结合蛋白而进一步提纯(New England Biolabs，Beverly，MA)。通过使用本发明的这一方面，任何剪切位点或酶剪切底物可构建在TCRα序列和具有可用于提纯的结合伴侣(binding partner)的第二肽或蛋白之间，例如，可为之制备免疫亲和柱的任何抗原。5.1.6 产生TCRα链的其它技术一旦一种特异性TCRα链基因克隆并且其DNA序列测定后，其蛋白产物除可通过上文描述的那些方法以外还可通过许多方法生产。例如，可用固相化学合成技术生产全部或部分基于从DNA序列推断的氨基酸序列的TCRα链(见Creighton，1983，Proteins Structures andMolecular Principles，W.H.Freeman and Co.，NP.pp.50-60)。这种方法在产生对应于分子活性位点的蛋白质的小部分方面特别有用。在可结合抗原的TCRα情况下，很可能由V和J基因片段编码的蛋白质的氨基末端可变区对抗原结合是重要的。因此，可以生产对应于α链可变区的合成肽。另外，例如，如果已知一个区域对其与辅助因子相互作用产生完全的免疫调节作用是重要的，则也可合成含该α链恒定区的特异性部分的大片段肽。
基于其克隆的DNA序列的产生TCRα链的另一方法是通过在体外无细胞系统中转录和翻译其基因。在下文部分7中作为示例的一项特殊实施方案中，A1.1 TCRα链基因在体外转录和翻译并且其产物经SDS-PAGE显示为约32000道尔顿分子量的蛋白质。此蛋白质对应于赤糖基化的TCRα多肽链。虽然这种无细胞体外系统不是为大量蛋白质生产设计的，本方法的优势是提供了一种方法用于明确地证实在缺乏其它蛋白的情况下在特异性免疫反应中特异性TCRα链的作用。
抗体结合位点的蛋白质构型的分子拟态提供了另一种用于生产具有与特异性TCRα链相类似的结合特异性的蛋白质的方法。例如象特异性TCRα链一样针对相同抗原决定簇的抗独特型抗体或单克隆抗体可以具有与TCRα链可变区结构上相同的结合位点。这种证实有TCRα链免疫调节功能的抗体可代替TCRα链。这种证实是用本文描述的PFC测定法。这种抗体在某些情况下优选使用，如，在证明该抗体比自然的α链具有更长的体内半衰期时，在下文描述的代替的治疗应用中，结合于并中和TCRα链的单克隆抗体可能是需要的。这些抗体也可用于体外诊断测定，如，放射免疫测定，ELISAs，以检测人类中循环的TCRα链。这种单克隆抗体易于使用本领域熟知的技术大量生产。
为生产模拟TCRα的抗体，可用所希望的抗原或抗TCRα链抗体免疫接种多种宿主动物，包括但不限于小鼠、兔、仓鼠、大鼠、和非人类灵长类，以产生模拟TCRα链的抗体，如通过测定它们竞争性地抑制TCRα链对其抗原的抗原特异性结合的能力，以及如在本文中描述的PFC测定法中所评价的它们调节对抗原特异的免疫反应的能力。为产生结合并中和TCRα链的抗体，宿主动物将用TCRα链本身免疫接种。可用各种佐剂增加免疫反应，取决于宿主种类，包括但不限于弗氏佐剂(完全的和和不完全的)，矿物质凝胶如氢氧化铝，表面活性物质如溶血卵磷脂，普卢尼克多元醇类，聚阴离子，肽类，油乳剂，钥孔墄血蓝蛋白，二硝基苯酚，和潜在有用的人类佐剂如BCG(卡介苗)和棒状杆菌parvum。
可使用供用培养的连续细胞系生产单克隆抗体的任何技术制备单克隆抗体。这些包括但不限于最早由Kohler和Milstein描述的杂交瘤技术(Nature，1975 256.495-497)，人类B细胞杂交瘤技术(Kosbor等，1983，Immunology Today，472 Cote等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.802026-2030)和EBV杂交瘤技术(Cole等，1985，MonoclonalAntibodies；and Cancer Therapy.Alan R.Liss，Inc.，pp 77-96)。可应用为通过剪接来自有合适抗原特异性的小鼠抗体的基因与得自人类抗体分子基因生产“嵌合抗体”而发展的技术(如，Morrison等，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.，816851-6855；Neuberger等，1984，Nature，312604-608；Takeda等，1985，Nature，314452-454)。另外，为单链抗体的生产所介绍的技术(U.S.专利4946778)可适用于生产单链抗体。
可用已知的技术生产含有所需要的特异性的结合位点的抗体片段。例如，这种片段包括但不限于可通过胃蛋白酶消化抗体分子产生的F(ab’)2片段和通过还原F(ab’)2片段的二硫桥键产生的Fab片段。另外，可使用为进行快速和简易的单克隆Fab片段鉴定而构建Fab表达文库(Huse等，1989，Science，246.1275-1281)所介绍的技术。5.2 TCRα链作为免疫调节剂的应用TCRα链抗原特异性免疫调节活性使它在人类或动物受试者体内以及体外的有广泛的用途。任何能结合抗原并在体外测定中表现免疫调节活性的TCRα链，或其片段和衍生物都可用于本发明方法的实践中，如果受试者血清中存在辅助成分的各因子，TCRα链可作为单一活性剂施用。然而，TCRα链可与在辅助成分，生长因子，或抑制剂中发现的生物活性因子联合应用。能够结合抗原并抑制通常针对该抗原产生的免疫反应的TCRα链在诸如超敏反应，移植排异，和自身免疫疾病的抗原特异性免疫反应的下调中特别有用。另外，去除或中和这样的TCRα链，或与这样的TCRα链相关联的因子，可用作一种增强对癌症和免疫缺陷等疾病的免疫反应的方法。在本发明的一项可选择的实施方案中，增强免疫反应的对抗原特异性的TCRα链可用于在体内增强这种抗原特异性反应。5.2.1抗原特异性免疫抑制证实抗原特异性免疫抑制作用的抗原结合TCRα链可在免疫反应有害的情况下用于治疗而且希望以抗原特异的方式抑制这种反应。可根据本发明治疗的这些疾病包括但不限于超敏反应(I-III)，自身免疫疾病以及器官和组织移植后的移植物排异反应。
超敏反应通常分为四组。I型反应是一种抗原特异性IgE触发的肥大细胞脱颗粒导致的速发型超敏反应。I型疾病的实例包括由下列物质引起的常见过敏反应，这些物质如植物花粉、霉菌孢子、昆虫身体部件、动物毛发皮屑、蜂毒和蛇毒。工业粉尘、室内尘埃、食物产品、化学物质和药剂。II型反应由特异性抗体通常为IgG和IgM对靶细胞的作用引起，导致细胞破坏。II型疾病的实例包括输血反应，胎儿成红细胞增多症，自身免疫性溶血性贫血，重症肌无力和突眼性甲状腺肿。III型反应由抗原抗体复合物形成和随后的抗体效应机制激活引起。III型疾病的实例包括免疫复合物型肾小球肾炎，肾小球性肾炎咯血综合征和某些型的关节炎。IV型反应为细胞介导的反应包括T细胞，巨噬细胞，成纤维细胞和其它细胞类型。它们也被称为迟发型超敏反应。过敏性接触性皮炎是本组的典型实例。
自身免疫疾病指一组由免疫系统对自身抗体反应导致组织破坏而引起的疾病。这些反应可由抗体，自身反应T细胞或两者激活。这些疾病中很多与上面超敏反应中描述的疾病重叠。一些重要的自身免疫疾病包括糖尿病，自身免疫性甲状腺炎，多发性硬化，类风湿性关节炎，系统性红斑狼疮，和重症肌无力。
MHC的基本认识导致了组织分型的技术进步，而这些进步又大大提高了器官和组织移植的成功率。一些目前通常施行的移植外科手术包括器官和组织如肾脏、心脏，肝脏，皮肤，胰岛和骨髓。然而，在供者和受者遗传学上不一致时，移植物排异仍可发生。
对于所有上面确定的疾患，包括但不限于所提及的特定疾病，对有害免疫反应的下调对宿主是有利的。在此方面，抗原特异性TCRα可用于特异性地抑制由T细胞，抗体或两者介导的免疫反应而保持所有其它正常的免疫功能。例如，实验性过敏性脑脊髓炎(EAE)是人类多发性硬化的一种动物模型，可通过施用经提纯的髓磷脂碱性蛋白在小鼠中被诱导。已显示TH在此疾病的发病机制中起至关重要的作用(Wraith等，1989，Cell 57709-715)。在所给定小鼠株系中自身反应T细胞识别的抗原决定簇数目是有限的。而且，用于构建自身免疫性TCR的Vα和Vβ基因片段也同样受限制，从而使对少数致脑炎性表位反应的多数T细胞具有相同的TCR。针对TCR决定子的抗体已被成功地用于去除体内抗原特异性T细胞，从而避免疾病(Owhashi和Heber-Katz，1988，J.Exp.Med.1682153-2164)。为实践本发明，TCRα链基因可从这样的自身反应细胞中分离，在适当的宿主细胞中表达并测定其抑制体内和体外抗原特异性免疫反应的能力。为此目的应用TCRα链特别重要，因为根据最近的发现，在某些人类疾病如多发性硬化和重症肌无力中，已检测到自身免疫性T细胞并且它们似乎类似地具有某些Vα和Vβ等位基因的有限的用途(Oksenberg等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86988-992)。
根据本发明，前述疾病可通过向病人施用有效剂量的对相关抗原特异的TCRα链进行治疗，此TCRα链抑制针对该抗原产生的免疫反应。被选用的TCR链可用体外免疫调节测定法如本文描述的PFC测定法评价。此TCRα链可通过许多方式施用，包括但不限于注射，输注，非肠道途径，和口服。TCRα和及相关的衍生物，类似物如从可变区衍生的肽类，可用作单一活性剂，或与其它化合物一起使用。这种组合物可与生理学上可接受的载体包括磷酸盐缓冲盐溶液，盐水和灭菌水一起施用。另外，脂质体可用于运送TCRα。在此方面，脂质体可与识别并结合细胞特异性抗原的抗体配合，从而提供使TCRα组合物“对准目标”(“targeting”)的一种方法。
有效剂量为抑制在体内针对相关抗原本来会产生的免疫反应所需的量。所使用的TCRα量将随用药方式，其它活性化合物的使用等而不同。总的来说，可使用使循环血清水平为0.1～100μg/ml的剂量。抑制抗原特异性反应的最有效剂量可通过在下文6.1.5部分中描述的如PFC测定法的体外测定法中加入不同浓度的TCRα并监测所取得的抑制水平而在体外确定。5.2.2抗原特异性免疫刺激作用某些疾病是免疫反应缺乏或缺陷的结果。免疫反应受损可能是由于免疫系统某些部分功能缺乏或异常，或存在特异地下调这些反应的因子。在后一种情况，例如，可能涉及病人过量产生抑制针对特定抗原的免疫反应的抗原特异性TCRα。在这种情况下，系统地去除或中和TCRα可能能使应答细胞免受这种抑制从而增加它们针对它们所识别的抗原的效能。本文描述的PFC测定法可用于测定病人体液如血清中发挥抗原特异性免疫抑制效应的循环或可溶性TCRα链的存在。这种病人可随即使用针对TCRα链的抗体治疗以去除或中和循环的抑制性分子。
T细胞介导的抑制作用可解释为什么肿瘤即使在证实肿瘤特异性免疫反应时仍能不断地生长。在许多实验性肿瘤系统中，已有报道消除抗原特异性Ts和TsF可暴露潜在的抗肿瘤反应(North，1982，J.Exp.Med.55106-107；Hellstorm等，J.Exp.Med.49799-804；Nepom等，1977，Biochim Biophy，Acta；121-148)。抗原特异性抑制因子可直接由肿瘤细胞或Ts释放，Ts在识别肿瘤抗原的某些抑制产生性表位后被激活(Sercarz和Krzych，1991，Immunol，Today 12111-118)。最初针对TsF产生的单克隆抗体也可与T细胞杂交瘤产生的肿瘤特异性T抑制因子反应(Steele等，1985，J.Immunol，1342767-2778)。数种与此抗体结合的TsF与抗TCRα抗体结合。因此，具有对肿瘤抗原适当特异性的TCRα链可参与肿瘤免疫的阻抑，在这种情况下，去除或中和这种TCRα对恢复和增强肿瘤特异性反应将可能是有利的。
这种病人体内自然的TCRα链的活性可通过体内施用中和其活性，即其结合抗体的能力和/或其导致的抗原特异性免疫抑制效应的对α链特异的抗体而被抑制(见上文5.1.4部分)。尽管针对TCRα恒定区和可变区的抗体都可使用，但与可变区结合者可能是优选的，因为只有对那种特定抗原特异的TCRα链将被中和从而使免疫反应以抗原特异性方式被增强。替代地，含有可测定水平的可溶性肿瘤抗原特异性TCRα链的癌症病人血清可经体外通过含有针对α链或抗原或其肽的抗体的柱而被吸附；即，血浆去除法。
为体内使用，抗体可以许多方法施用，包括但不限于注射，输注，非肠道途径和口服。该抗体可在任何生理学上可接受的载体中施用，这些载体包括磷酸盐缓冲盐溶液，盐水和灭菌水。本抗体的使用量将随用药方法，其它活性化合物的使用等而不同，通常为饱和剂量，此剂量将导致结合游离的系统的TCRα链全部或大部分。为体外吸附，与柱偶联的抗体或抗原量应足以去除病人血清中大部分甚至全部游离TCRα。
反义寡核苷酸可用于干扰特异性免疫抑制TCRα链的表达和系统释放，从而选择性地增强抗原特异性免疫反应。在这方面，可使用表现催化活性的互补寡核苷酸，即核酶(ribozyme)方法。参见，一般如，PCT国际出版物WO90/11364；Sarver等，1990，Science 2471222-1225。使用针对每个TCRα链的Vα反义或核酶(ribozyme)寡核苷酸时要优选使用完整的TCRα，因为这将只抑制所研究的特异性TCRα。为此目的，可合成与任何已知TCRα链序列的mRNA互补的核酸酶抗性反义Vα寡脱氧核苷酸。在被摄取入抗原特异性T细胞后，这些试剂可通过碱基配对与它们的互补mRNA序列杂交，阻断翻译和破坏被编码蛋白产物的产生(这类技术的文献，见Green等，1986，Ann.Rev.Biochem.55569-597)。
在本发明的另一实施方案中，对所研究抗原特异并增强抗原特异性免疫反应的TCRα链可按上文5.1.1部分中所述予以鉴定。可将治疗学有效剂量的这种TCRα链施用于病人以增强病人针对该特定抗原的免疫反应。
在另一实施方案中，本发明提供一种其本纯的融合多肽R1-[X1]-R2，其中R1是载体肽，R2是由结构基因编码的多肽，X1是蛋白水解酶识别序列。“载体肽”位于融合肽序列的氨基末端。在原核生物，本发明融合蛋白的载体肽可用于运输融合肽至包涵体，周质，外膜或，优选地，外部环境中在真核生物，据信载体肽功能是运输融合多肽穿过内质网。该分泌蛋白随后经高尔基体转运入分泌小囊和进入细胞外空间或，优选地，进入外部环境。本发明的载体肽包括但不限于钙调蛋白多肽。按照本发明可使用的载体肽种类包括前肽原和外膜肽。它可包含蛋白水解酶识别位点。可接受的载体肽也包括激素的氨基末端原区。本文描述的具有类似特性的其它载体肽对本领域技术人员是公知的，或可不必过分的实验就易于确定。
在本发明的一项实施方案中，载体肽被包括在表达载体中，它特异地位于邻近载体蛋白N-末端处。本发明实施例中使用的载体是钙调蛋白核苷酸序列，但提供转运融合蛋白至内质网(对于真核生物)和进入外部环境或进入包涵体(对于原核生物)的方法的其它序列在本发明中也会同样有效。如上描述的这种序列对本领域技术人员是熟知的。
本发明载体肽的羧基末端含有蛋白水解酶识别位点以便结构基因编码的多肽易于从融合多肽分离。剪切识别位点的不同是可能的，因为对于蛋白水解特异性存在不同的酶。优选地，剪切位点为序列Lys-Val-Pro-Arg-Gly(SEQ ID NO1)，它被凝血酶识别。这个识别位点允许产生意想不到地高水平的由结构基因编码的活性蛋白。其它剪切位点，如由因子Xa蛋白酶识别者，对本领域技术人员应是已知的。
本发明的融合多肽包含一条由结构基因编码的多肽，优选位于融合多肽的羧基末端。任何结构基因均与载体肽和剪切位点一起表达。结构基因可操作地与表达载体中的载体和剪切位点连接，以便融合多肽作为一个单独的单位表达。可用于产生本发明的融合多肽的结构基因的一个实例编码截短的TCRα，它仅包括TCRα的细胞外膜结构域。
本发明提供一种基本纯的多肽。本文使用的术语“基本纯”指基本不含其它蛋白，脂质，碳水化合物或其它可能自然地相联系的物质的物质。本领域技术人员可使用蛋白质提纯的标准技术提纯该多肽，如应用与多肽的一种表位结合的单克隆抗体的亲和层析法。此基本纯的多肽在聚丙烯酰胺凝胶上将产生单一的主带。该多肽的纯度也可用氨基末端氨基酸序列分析确定。只要此多肽的活性存在，该多肽即包含本多肽的功能片段。在本发明中包括具有多肽的生物活性的较小的肽。
本发明还提供编码该融合多肽的多聚核苷酸。这些多聚核苷酸包括DNA，cDNA，和RNA序列。在理解为编码完整或部分融合多肽的所有多聚核苷酸也包括在本文中，只要它们编码一种其剪切产物具生物活性的多肽。这些多聚核苷酸包括自然产生的，合成的，和有意构建的多聚核苷酸。例如，多聚核苷酸可受到位点定向的突变。该多聚核苷酸序列还包括反义序列和作为遗传密码的结果简并的序列。有20种天然氨基酸，大多数由一种以上的密码子决定。因此，所有变性的核苷酸序列都包括在本发明中，只要由该核苷酸序列编码的融合多肽的氨基酸序列在功能上未改变。
本发明的DNA序列可通过上述几种方法取得，例如，DNA可使用本领域中熟知的杂交程序分离。这些包括但不限于1)探针对基因组或cDNA文库的杂交以检测共享的核苷酸序列；2)表达文库的抗体筛选以检测共享的结构特征；和3)通过聚合酶链式反应(PCR)合成。
当所希望的多肽产物氨基酸残基的整个序列已知时，DNA序列的合成是常选用的方法。当所希望的多肽的氨基酸残基的整个序列未知时，不可能直接合成DNA序列，并且可选择的方法是合成cDNA序列。分离所感兴趣的cDAN序列的标准方法中有一种是形成质粒或噬菌体携带的cDNA文库，这种文库来自在宿主细胞中大量存在并具有高水平遗传表达的mRNA的逆转录。当与多聚酶链反应技术联合应用时，甚至是稀有的表达产物也可克隆。在多肽的氨基酸序列的重要部分已知情况下，从被推断存在于目标cDNA中的序列复制的标记的单链或双链DNA或RNA探针序列产物可用于DNA/DNA杂交程序，该程序在已被变性为单链形式的cDNA的克隆拷贝上进行(Tag等，Nucl.Acid.Res.112325，1983)。
编码本发明融合多肽的DNA序列可通过DNA传递入合适的宿主细胞而在体外表达。“宿主细胞”是载体可在其中繁殖并且表达其DNA的细胞。该术语也包括该受体宿主细胞的任何后代。可理解所有的后代可能不与亲代细胞完全相同，因为在复制过程中可能发生突变。然而，当使用术语“宿主细胞”时，这种后代也被包括在内。本发明优选的宿主细胞包括大肠杆菌，金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌，然而也可使用本领域中熟知的其它革兰氏阴性和革兰氏阳性微生物，只要该表达载体含有复制起点以允许在宿主中表达。稳定传递，换言之即外源DNA连续地维持于宿主中的方法在本领域中是已知的。
在本发明中，多聚核苷酸序列可插入到重组的表达载体中。术语“重组的表达载体”指本领域中公知的通过插入或掺入TCRα的遗传序列如载体肽和剪切位点而构建的质粒，病毒，或其它载体。这种表达载体含有一个启动序列，可易化宿主的插入遗传序列的有效转录。该表达载体典型地包含一个复制起点，一个启动子，和允许对转化细胞进行表型选择的特定基因。适合用于本发明的载体包括但不限于用于在细菌中表达的基于T7的表达载体(Rosenberg等，Gene 56125，1987)，为在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体(Lee和Nathans，J.Biol.Chem.2633521，1988)和为在昆虫细胞中表达的baculovirus衍生的载体。DNA片段可存在于载体中可操作地连接于调节元件，例如，启动子(如T7，金属硫因I，或polyhedrin启动子)。
例如，本发明的融合多肽的表达可被置于包含乳糖或lac操纵子的大肠杆菌染色体DNA控制下，此操纵子通过发挥β-半乳糖苷酶的作用而调节乳糖利用。此lac控制系统可被IPTG诱导。可构建一种含lac Iq阻遏子基因的质粒，允许阻遏lac启动子直至IPTG被加入。其它本领域中公知的启动子系统包括β内酰胺酶，λ启动子，蛋白A启动子，和色氨酸启动子系统。这些是最常用的，但其它微生物启动子也可使用。该载体含有来源于与宿主细胞相容的种属的复制子位点和控制序列。另外载体可携带可供在转化细胞中表型选择的特异基因。例如，β-内酰胺酶基因将氨苄青霉素抗药性传递给那些含有带有β内酰胺酶基因的载体的转化细胞。
编码本发明的融合多肽的多聚核苷酸可在原核或真核生物中表达。宿主可包括微生物，酵母菌，昆虫和哺乳动物有机体。在原核生物中表达具有真核的或病毒的序列的DNA序列的方法在本领域中是公知的。能在宿主中表达和复制的生物学上有功能的病毒和质粒DNA载体是本领域中熟知的。这种载体被用于掺入本发明中的DNA序列。本发明的宿主细胞可天然地编码一种识别该融合蛋白剪切位点的酶。然而，如果希望在其中表达融合多肽的宿主细胞遗传上下具有识别剪切位点的酶，则编码这种酶的遗传序列可与融合蛋白的多聚核苷酸序列一起被转染至该宿主细胞。
宿主细胞用重组体DNA的转化可用本领域技术人员公知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，有DNA摄取能力的细胞可通过本领域中公知的程序从指数生长期后收获并随后用CaCl2方法处理的细胞制备。另外，也可使用MgCl2或RbCl。转化还可在形成宿主细胞的原生质后或通过电穿孔进行。
当宿主为真核生物时，可使用的DNA的转染方法如磷酸钙共沉淀，传统的机械方法如显微法注射，电穿孔，包被于脂质体中的质粒的插入，或病毒载体。真核生物细胞也可用编码本发明融合多肽的DNA序列和编码可选择性表型的第二外源DNA分子如单纯疱疹胸腺嘧啶激酶基因共转染。另一方法是使用真核生物的病毒载体，如猴病毒40(SV40)或牛乳头状瘤病毒以暂时感染或转化真核生物细胞和表达蛋白质(Eukaryotic Viral Vectors，Cold Spring Harbor Laboratory，Gluzman ed.，1982)。
分离和提纯微生物或真核细胞表达的本发明的多肽的技术可以是通过任何常规方法如，制备性色谱分离和免疫学分离如那些涉及使用单克隆或多克隆抗体者。
上面揭示的内容总体描述了本发明，更完全的理解可通过参考下列特定实施例获得，这些实施例在此只为阐明而提供，而不限制本发明的范围。6.实施例通过逆转录病毒基因转移证实的TCRα链免疫调节活性6.1材料和方法6.1.1动物C57B1/10和C57B1/6动物购自Jackson实验室(Bar Harbor，ME)。6.1.2细胞系A1.1(Fotedar等，1985，J.Immunol.1353028-3033)，B9(Fotedar等，1985，J.Immunol.1353028-3033)，BW1100(White等，1989，J.Immunol.1431822-1825)，175.2(Glaichenhaus等，1991，J.Immunol.1462095)，和这些细胞系表达A1.1 TCR基因的衍生物(见下文6.1.4部分)维持于RPMI 1640加10％胎牛血清中。很多细胞系也适应无蛋白，无血清培养基(Cell Biotechnologies，Rockville，MD)。6.1.3.抗体和抗原对CD3ε具有特异性的单克隆抗体(145-2C11，仓鼠IgG)(Leo等，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.841374-1378)，和TCRα(H28-710.16，仓鼠IgG)(Becker等，1989，细胞58911-921)用蛋白A亲和色谱法提纯(蛋白A Superose，Pharmacia)，表面CD3的荧光染色和FACS分析(Zheng等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.863758-3762)和用H28-710的抗体亲和色谱法(Bissonette等，1991，J.Immunol.1462898-2907)按以前的描述施行。SRBC购自Morse Biologicals(Edmonton，AB)或购自Colorado Serum Co.(Denver，CO)。非随机合成的多肽，poly-18，和基于其结构的肽类(列于图4中)按以前的描述产生(Fotedar等，1985，J.Immunol.1353028-3033)。6.1.4.逆转录病毒转移TCR基因进入T细胞杂交瘤细胞总RNA通过传统的异硫氰酸胍和氯化铯法从109个细胞中分离。多聚A+RNA通过寡-dT纤维素亲和色谱法回收。第一条链合成是使用寡dT引物和逆转录酶产生的而第二条链则使用DNA聚合酶I和RNA酶H。该甲基化的平末端双链(ds)cDNA与EcoRI连接子相连。在EcoRI消化后，该双链cDNA在琼脂糖凝胶上选择大小，通过精胺沉淀提纯，并克隆入λgt10。该λDNA被体外包装(Gigapack Gold，Stratagene，La Jolla，CA)。通过使用32P放射性标记的Cα和Cβ探针的原位杂交筛选了大约200,000噬菌斑。将Cβ探针和Cα探针用于筛选cDNA文库(从牛胰岛素特异性T细胞杂交瘤制备)。得自阳性克隆的插入DNA连接入M13mp18和M13mp18以供标准的双脱氧序列分析使用。
在本文中描述的实施例中使用的所有逆转录病毒载体是N2载体的衍生物(Keller等，1985，Nature 318149-154)。A1.1 TCRα和βcDNAs被完全测序。简言之，A1.1αcDNA使用Vα1，2(Arden等，1985，Nature 316783-787)和JαTA65而A1.1βcDNA使用Vβ6(Barth等，1985，Nature 316517-523)，Dβ2(Sui等，1984，Nature 311344-349)，和Jβ2.7(Gascoigne等，1984，Nature 310387-391)基因片段。αcDNA的表达被去除了逆转录病毒LTR，而β链的表达在TCRV β2启动子和TCRβ增强子的控制下。两种插入体被克隆入N2载体的XhoI位点。这些结构被转染入包装细胞系φ2(Mann等，1983，Cell 33153-159)和PA317(Miller和Buttimore，1986，Mol.Cell.Biol.62895-2902)。用标准方法测定被克隆的生产细胞系具有5×105～1×106的滴度(Millimore，1986，Mol.Cell.Biol.62895-2902)接受者T细胞杂交瘤用指示的生产系上清液感染(Keller等，1985，Nature 318149-154)并在G418(0.1-1.0mg/ml)中选择10天。在表达A1.1α的175.2细胞中，进一步的选择是通过抗CD3分子的荧光染色实施的，随后是用FACStar Plus进行细胞分选(Becton-Dickinson)。被转导的TCR基因的表达通过使用抗Vβ6单克隆抗体(Payne等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 857695-7698)或抗CD3抗体确定，或通过来自对照的和被感染的接受者T细胞杂交瘤的RNA的PCR分析确定。对Vα1和Cα基因片段特异的引物被用于PCR。扩增产物与对A1.1αcDNA连接区特异的5’末端标记的反义寡核苷酸杂交。6.1.5.抗原特异性调节活性的体外测定为测定A1.1来源的抗原特异性调节活性，而采用了一种简单的抗原特异性系统(Zheng等，1988，J.Immunol.1401351-1358；Bissonette等，1991，J.Immunol.1462898-2907；Zheng等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86375 8-3762)，得自(57B1/6或57B1/10小鼠的脾细胞(1×107)在1mL RPMI 1640中培养，该RPMI 1640用10％胎牛血清和5×10-5M2-ME补充。每份培养物接受50μl与poly-18或替换多肽偶联的1％SRBC。通过向培养物加入含或不含“辅助成分”(10-15％)的滤过灭菌的杂交瘤上清液测定抑制活性。如上文5.1.1部分中所描述的，辅助成分的制备来源于SRBC免疫的小鼠T细胞培养物，随后用SRBC吸附该上清液。(也见Zheng等，1988，J.Immunol.1401351-1358；Bissonette等，1991，J.Immunol.1462898-2907〕。另外，T细胞杂交瘤3-1-V的培养上清液(见下文8部中所述)，也可用作辅助上清液(图1A和B)。培养物在37℃饱和温度，92％空气/8％CO2条件下温育，并且抗SRBC PFC在5天后予以测定。在本文显示的所有实验中，不论单独加入T细胞杂交瘤上清液还是辅助上清液都不显著影响免疫反应。因此，本文描述的对照和实验组培养物都含有辅助成分，而未加入辅助上清液的结果未显示。6.1.6生物素偶联的肽对T细胞来源的蛋白的直接结合肽EYE(EYA)4EYK(SEQ ID NO3)和EYKEYAEYAAYAEYAEYK(SEQ ID NO4)按所述与生物素偶联(Bayer和Wilcheck，1980，Methods Biochem.Anal.261-45)，并且在上清液中抗原结合活性通过改良的ELISA测定法测定(Gallina等，1990，J.Immunol.1453570-3577)。在无蛋白，无血清培养基中培养的细胞系的上清液在Centricon30(Amicon，Danvers，MA)滤过系统上浓缩约50-200倍并在碳酸盐缓冲液(pH 9.6)中以各种稀释度在Immunolon II板(Dynatech，Chantilly，VA)上在37℃包被2小时。在用PBS加0.05％吐温20洗涤后，结合材料与100μl生物素化的肽在1∶500稀释度在37℃温育1小时，洗涤，与Extravidin碱性磷酸酶轭合物(Sigma)1∶2000稀释物温育，洗涤，并用硝苯基磷酸盐底物(Sigma)显象。经适当温育(通常为在4℃过夜)后测定OD410nm。在一些实验中，以100ng至1μg/每孔加入肽(无生物素)，同时加入活性生物素化的肽以取得结合竞争。6.2结果6.2.1.带或不带TCRβ的TCRα的转移授予产生抗原特异性活性的能力如图3B所示当与EYK(EYA)4偶联的SRBC存在于培养液中时，可观察到A1.1上清液对抗-SRBC PFC反应的抑制，但当存在未偶联的SRBC或与另一种肽偶联的SRBC时观察不到。由A1.1证实的免疫调节活性的抗原精细特异性已在以前被描述(Zheng等，1988，J.Immunol.1401351-1358；Bissonette等，1991，J.Immunol.14628-98-2903)，这些结果中的一些汇编在图4中。
细胞系175.2表达TCRβ和CD3成分，但缺乏功能性TCRα基因(Glaichenhaus等，1991，J.Immunol.1462095)。175.2细胞用表达A1.1-TCRα的逆转录病毒感染(见上文6.1.4部分)并在G418中选择这些细胞，随后通过CD3+进行细胞分选而进一步选择。在被选择的细胞上CD3的表达(图3A)，证实该TCRα链在所选择的细胞中表达(175.2-A1.1α)。收集175.2-A1.1 α的上清液并在体外测定中检测。如图3B中所示，这些上清液显示与A1.1的上清液同样的抗原特异性调节活性，而得自175.2的上清液无活性。由于175.2的最初的TCR和特异性与A1.1的那些特征完全无关(Glaichenhaus等，1991，J.Immunol.1462095)这些结果证实A1.1 TCRα链基因的表达导致抗原特异性调节活性的产生。另外，这种免疫活性可通过加入针对TCRα的抗体被中和，表明上清液中分泌的TCRα链对这些活性负责(图5)。作为对照，图6A和B显示T细胞杂交瘤BB19的TCRα基因的转染诱导在175.2的2个亚克隆的细胞表面上CD3的表达(AF5和AF6)，该BB19对poly 18的一个表位特异，该表位与A1.1所识别的不同。然而，象亲本克隆BB19一样，转染体(transtectants)在它们的上清液中也不产生任何免疫调节活性(图7A和B)。因此，不是所有的poly-18-特异性T细胞都分泌具有免疫调节活性的TCRα链。
为进一步探索本发明，用携带A1.1的TCRα的逆转录病毒载体感染另一细胞系B9。象A1.1一样，B9表达TCRα和β，并产生针对δI-Ad一起呈递的抗原poly 18的IL2(Fotedar等，1985，J.Immunol.1353028-3033)。如图8中显示，是A1.1的上清液，而不是B9的上清液，显示抗原特异性调节活性，但表达A1.1 TCRα链的B9细胞(B9-A1.1α)也产生这种活性，而那些表达A1.1 TCRβ链的细胞(B9-A1.1β)不产生这种活性。后者不是因为TCRβ的阻断作用，因为同时表达来自A1.1的TCRα和TCRβ(B9-.A1.1αβ)的B9细胞产生这种调节活性。
B9-A1.1α的上清液通过抗体亲和层析在固定的抗TCRα抗体上分离并检测抗原特异性调节活性，在测定中使用含有与SRBC偶联的4肽的板。如图9中所示，得自B9-A1.1α的可溶性活性被结合并从抗TCRα抗体上洗脱。对未被取代的肽和氨基酸7被取代的肽(但不是那些在残基3或10被取代的)的所观测到的特异性是来自A1.1抗原特异性活性的特征(Bissonette等，1991，J.Immunol，14628-98-2907)(见图4)。如以前所讨论的，这种特异性与A1.1 TCR识别的poly 18的表位相互关联(Bissonette等，1991，J.Immunol.1462898-2907)。
除B9外，还使用逆转录病毒将该A1.1TCRα基因转导入另一poly18特异性细胞系B1.1。在用G418选择后，发现B1.1-A1.1α系可产生抗原特异性免疫调节活性，尽管亲本的细胞系(B1.1)不能产生这种活性。因此在转移A1.1 TCRα基因后，两种TCRα+β+T细胞杂交瘤(B9，B1.1)和一种TCRα-β+T细胞杂交瘤(175.2)产生poly-18特异性调节活性。为进一步说明在缺少TCRβ时是否A1.1 TCRα的表达可导致产生抗原特异性活性，而将A1.1 TCRα或A1.1 TCRβ转移至BW1100细胞内。因为BW1100细胞缺乏完整的TCRα和β(White等，1989，J.Immunol.1431822-1825)，任何TCRα基因转移的效应都应直接归因于TCRα。如图10A和B中所示，BW1100-A1.1α的上清液，而不是BW1100-A1.1β的上清液，显示免疫调节活性。与其它基因传递实验一样，这种活性表现出A1.1的抗原特异性。6.2.2 TCRα的基因转移与直接的抗原结合活性的产生相关本文描述的实验证实从A1.1释放的TCRα链直接与抗原结合。是这种区别特征赋予这种TCRα链生物活性，而不赋予其它细胞的TCRα链活性。如图11A中所示，A1.1和表达A1.1 TCRα的细胞系的上清液含有可用改良ELISA测定法测定的抗原结合成分(见上方6.1.6部分)。这种抗原的结合可被未标记的肽有效地竞争，但不被两种不合适的肽竞争(图11，B)，其中一种与该抗原性肽只差一个残基。这种取代已在以前被证实可破坏肽对A1.1TCR(在抗原呈递测定中)(Boyel等，1990，Eur.J.Immunol.202145-2148)和对A1.1来源的调节活性的抗原性(Bissonette等，1991，J.Immunol.14628-98-2907)的该肽的抗原性。这些结果显示抗原结合活性是表达A1.1 TCRα的细胞的生物活性产物，并且是这种分子的抗原结合特性赋予其生物活性。6.3讨论本文给出的数据明确证实TCRα链从A1.1细胞释放，与特异性抗原结合(在我们的生物测定中偶连于SRBC)，并参予在体外诱导对SRBC的免疫反应的抑制。CD4+T细胞杂交瘤A1.1组成性释放一种对合成抗原poly 18和相关肽特异的免疫调节活性(Zheng等，1988，J.Immunol.1401351-1358；Bissonette等，1991，J.Immunol.14628-98-2907)。如本文所述A1.1 TCRα基因转移入其它细胞系授予它们组成性产生这种抗原特异性调节活性的能力(图3，8，9和10)。A1.1 TCRβ的转移既不产生也不干扰这种作用(图8)。由每种转导的受体T细胞系产生的可溶性活性的抗原特异性与A1.1产生的相同。这种活性被一种单克隆抗TCR-α抗体结合(图9)并且被洗脱的活性表现出与A1.1上清液同样的抗原精细特异性(Bissonette等，1991，J.Immunol.1462898-2907)。
本实施例结论性地证实TCRα链以不信赖CD3/TCR复合体的形式从细胞释放，并且调节抗原特异性免疫反应。特别地，将A1.1 TCRα基因转进完全缺乏TCRβ的BW1100细胞仍可组成性的产生抗原特异性调节活性(图10)。本文描述的结果还表明是A1.1 TCRα链对抗原的直接识别(图11)给了这种分子在PFC测定中的活性，并且，其它细胞释放的TCRα链不能直接结合于表位上从而不表现这种活性。
虽然并不意在限制本发明的范围，对于TCRα如何介导免疫反应，在此至少可提出两种模式。例如，有可能，TCRα和抗原的复合物是免疫原性的，导致对TCR的调节性免疫反应。最近的研究表明，用特异性T细胞(Lider等，1988，Science 239181-183；Sun等，1988，Nature 322843-845)或对应于TCR可变区中的区的肽(Vandenkark等，1989，Nature 341541-544)；Howell等，1989，Science 246668-670)免疫接种可导致体内显著的免疫调节作用。与A1.1 TCRα链相关联的调节作用可代表这种TCR体外“接种”的一种类型。
替代地，也可能有一种未鉴定的分子δ抗原结合的TCRα链相关联并且这第二种分子给予该系统生物功能。例如，Iwata等(Iwata等，1989，J.Immunol.1433917-3924)已描述一种释放入一些T细胞杂交瘤上清液的可溶性复合物，它由一个具糖基化抑制活性的分子和一个带有TCR决定簇的分子组成。7.实施例通过体外转录和翻译生产具生物活性的TCRα链7.1材料和方法7.1.1体外转录和翻译DNA寡核苷酸探针在小鼠Cα和Cβ已知序列基础上设计。这些探针被合成并用于筛选来自poly 18特异性A1.1杂交瘤细胞的cDNA文库。全长的来自A1.1的TCRα和TCRβ cDNA被描述特征并克隆入Bluescript载体(Stratagene，LaJolla，CA)。Cα和Cβ的RNA是在体外使用真核转录系统(BRL，Gaitherburg，MD)转录的。该RNA随后使用兔网状细胞溶解产物系统(BRL，Gaithersburg，MD)进行体外翻译。为放射自显影，在翻译中包括了35S-Met(New England Nuclear，Boston，MA)。作为生物测定，这些材料在没有放射性核苷酸情况下翻译。
体外翻译的产物随后通过使用单克隆抗TCRα或抗TCRβ抗体的亲合层析法浓缩。标记的物质通过SDS-PAGE分析，使用增感屏(Enhance)并使X-光片曝光。生物活性在上文6.1.5部分中描述的系统中进行测定。7.2结果除上文6部分中的发现，即，将TCRα基因从T细胞杂交瘤A1.1转移至其它细胞系可转移产生抗原特异性免疫调节能力以外，确定由这种基因产生的纯的重组TCRα蛋白在此系统中是否具有生物活性是非常重要的。以前的研究已显示来自T细胞的产生这种生物活性因子的mRNA可在体外翻译以产生调节活性。那么，类似地，TCRαRNA的体外翻译可能产生生物活性蛋白。7.2.1体外转录和翻译产物体外转录和翻译产生32000道尔顿预期大小的未糖基化的TCRα蛋白，并发现这种蛋白特异性地结合抗TCRα抗体而不结合抗TCRβ抗体(图12和13)。7.2.2体外翻译产物的免疫调节活性已发现该TCRα蛋白在PFC测定中具有生物活性，并且此活性被抗TCRα抗体完全结合(和洗脱)(图13A和B)。在图13A中，来自体外翻译的TCRα的免疫调节活性存在于抗TCRβ抗体柱的滤过液中和抗TCRα抗体柱的洗脱液中。活性滤过液(抗TCRβ)和洗脱液(抗TCRα)的滴定显示它们的活性是类似的。
体外转录和翻译的TCRα显示免疫调节活性，而从TCRβ RNA产生的蛋白不显示。7.3讨论上面详述的实验与上文第6部分中描述的研究一起证实重组的TCRα具有生物功能。因此，编码这种生物活性因子的TCRα链基因可在多种表达系统中被表达以产生具生物活性的产物；即；能特异性地抑制针对其目标抗原的免疫反应的TCRα链。8.实施例产生辅助成分活性的T细胞杂交瘤的产生8.1材料和方法8.1.1动物C57B1/6动物购自Jackson Laboratories(Bar Harbor，ME)。8.1.2细胞系和试剂BW1100和T细胞杂交瘤维持于加10％FCS的PRMI-1640中。针对CD4(GK1.5)的单克隆抗体(Dialynas等，1983，Immunol.Rev.7429)得自美国典型培养物保藏中心(Rockville，MD)。兔和豚鼠补体分别得自SciCan(Edmonton，Alberta，加拿大)和GIBCO(Grand Island，纽约)。两种补体样本在使用前先筛选低本底活性。包被抗大鼠IgG抗体的磁珠购自Dynal。8.1.3 T细胞杂交瘤的产生取得SRBC免疫的C57B1/6小鼠脾细胞并在补体存在时用针对CD4的抗体(GK1.5)处理。去除CD4的细胞随后与包被抗大鼠IgG抗体(的磁珠(Dyalbeads)反应以去除所有的IgG+细胞。剩下的细胞在lympholyteM(Cedarlane Laboratories，PA)上离心，并将存活的T细胞与BW1100在存在PEG下以1∶1的比例融合。杂交瘤在次黄嘌呤，胸腺嘧啶，氨基喋呤和ouabin存在下选择。小鼠红细胞被用作填充细胞。生长阳性的孔的上清液与A1.1上清液一起在上文第6.1.5部分中详述的PFC测定中测定其替代辅助成分的能力。具活性的培养物被分开再培养，并再测定亚系的活性。具有活性的亚系再分开并将其中具有活性者以0.4细胞/孔予以克隆。再筛选这些克隆的活性。8.2结果8.2.1一种T细胞杂交瘤产生辅助成分活性SRBC免疫接种的耗尽CD4+T细胞和IgG+B细胞的小鼠脾细胞与BW1100融合。克隆后，一种这样的T细胞杂交瘤3-1-V显示可在培养上清液中产生辅助活性，在A1.1上清液存在下进行测定可在介导抗原特异性免疫调节活性方面替代辅助上清液(图1)。3-1-V上清液与A1.1上清液一起起作用，不管此A1.1上清液是自然分泌产物还是A1.1 TCRα基因的体外翻译产物。因此，可得到可重复和组成性分泌与抗原特异性TCRα链一起使用的辅助成分的T细胞单克隆群。9.实施例TCRα基因的cDNA克隆可使用本领域公知技术从T细胞制备cDNA文库。由于在人类和小鼠中编码TCRα的单一的恒定区(Cα)核苷酸序列是已知的(Willson等，Immunol.Rev.101149-172，1988)，与Cα同源的DNA探针可使用标准方法合成并用于筛选这种文库以鉴定TCRαcDNA替代地，从特异性TCRα序列来源的寡核苷酸探针可在PCR(多聚酶链反应)方法(Millis等，Methods in Enzymol.155335-350，1987)中用作引物以产生可被指导性克隆的TCRα序列的cDNA(Roman-Roman等，Eur.J.Immunol.，21927-933，1991)。
一种辅助T细胞杂交瘤A1.1已在下面描述过(Fodelar等，J.Immunol.1353028-3033，1985)并表达对合成多肽poly-18(poly(Glu-Tyr-Lys-(Glu-Tyr-Ala)5))特异的TCRα和β分子，还在特异性抗原和1-Ad存在下释放淋巴因子。这种T细胞杂交瘤也组成性产生一种在抗原特异性抑制中涉及的poly-18-特异性可溶因子。已显示A1.1产生的因子表现与TCR对A1.1细胞展现的同样的抗原精细特异性(Zheng等，J.Immunol.1401351-1358，1988)，而且A1.1衍生因子的免疫调节活性至少部分地被TCRα蛋白编码(Bissonette等，J.Immunol.1462898-2907，1991)。
使用Cα探针从cDNA文库中克隆A1.1细胞的TCRαcDNA。mRNA通过常规的异硫氰酸胍和氯化铯方法从109细胞分离并通过寡dT纤维素亲和色谱法回收。cDNA的第一条链使用寡dT引物和逆转录酶合成而第二条链使用DNA聚合酶I和RNA酶H合成。甲基化的平末端双链cDNA连结在EcoRI连接子上。接着用EcoRI消化后，该DNA在琼脂糖凝胶上选择大小，通过精胺沉淀提纯，并克隆入λ-gt10。该噬菌体在体外使用Gigapack GoldTM(Stratagene〕包装。使用32P-放射标记的Cα探针通过原位杂交筛选了约200000个噬菌斑。将阳性克隆的插入DNA连接入M13mp18做标准的双脱氧序列测定。A1.1TCRαcDNA的完整核苷酸序列显示于图14中。
已建立一种产生蜂毒磷脂酶A2(PLA-A2)特异性糖基化抑制因子(GIF)的杂交瘤，(3B3)，它表达对PLA2特异的TCRα和β链(Mori等，Int.Immunol，5833-842，1993)。这种T细胞杂交瘤在用同源抗原和抗原呈递细胞刺激后组成性产生免疫抑制因子，GIF，和结合GIF的PLA2。积累的证据显示抗原结合GIF在体内特异地抑制对该抗原的免疫反应，以及，此抗原结合GIF至少可部分地由表达于细胞上的TCRα编码(Iwata等，J.Immunol.，1413270-3277，1988；Iwata等，J.Immunol.，1433917-3924，1989；Mori等，Int.Immunol.，5833-842，1993)。
3B3细胞的TCRαcDNA按照下述Mullis等人描述的PCR方法(Nucl.Acid.Res，83895-3950，1980)克隆。mRNA是用FastTrackTMmRNA分离试剂盒(Invitrogen)从5×1073B3细胞中分离的。cDNA则使用cDNA合成系统(Pharmacia)产生。在被产生后，使用T4连接酶(Takara)在这些cDNA5’端和3’端连接以构建成环状DNA。编码小鼠CαDNA的寡核苷酸引物通过DNAA/RNA合成仪(AppliedBiosystems)使用氨基亚磷酸酯(phosphoramidite)法(Beaucage等，Tetrahedron Lett.221859-1862，1981)合成。这些引物的序列为5’-GTGGTCCAGTTGAGGTCTGCAAGA-3’5’-TTGAAAGTTTAGGTTCATATC-3’PCR通过TaqI DNA聚合酶(Takara)在模板cDNA，引物和dNTP存在下在热循环仪中进行。PCR的争件是变性步骤为94℃，1分钟；退火步骤为54℃，1分钟；和延伸步骤为72℃，2分钟，进行35次循环。扩增的cDNA被亚克隆入TA克隆系统TM(Invitrogen)的PCR1000载体。插入的DNA序列通过双脱氧序列测定技术(Sanger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA745463-5467，1977)证实。3种不同的TCRαcDNA被克隆并测序。它们中的2种被鉴定是来自3B3杂交瘤的融合伴侣细胞BW5147(Chien等，Nature，31231-35，1984；Kumar等，J.Exp.Med.，1702183-2188，1989)。另一TCRαcDNA通过使用编码此TCRα基因的不同部分的几种PCR引物证实不在BW5147中表达，表明此TCRα来源于PLA2特异性T细胞。分离了两株编码此TCRαcDNA的独立克隆并证实它们的DNA序列是一致的。3B3衍生的TCRαcDNA的DNA序列显示于图15中。此TCRαcDNA编码268个氨基酸的开放阅读框并且证实前20氨基酸为一个信号肽(McElligott等，J.Immunol.1404123-4131，1988)。10.重组体TCRα在大肠杆菌中的表达--直接表达10.1构建TCRα表达质粒为构建编码A1.1 TCRα细胞外区域的表达质粒，寡核苷酸被用作通过PCR扩增DNA片段的引物。A1.1 TCRαcDNA编码细胞外区26至240氨基酸，并包括1个Cla1限制性酶切位点，Shine Dalgano序列(Scherer等，Nucl.Acids.Res.，83895-3950，1980)和5’端甲硫氨酸起始密码子和3’端2个终止密码子和BamHI限制性酶切位点，该cDNA可通过两个引物PCR的PCR扩增获得。这些引物的序列为5′-AACATCGATTAATTTATTAAAACTTAAGGAGGTATATTATGAGCCCAGAATCCCTCAGTGTCC-3′(SEQ ID NO5)5′-AACGGATCCCTATTATTGAAAGTTTAGGTTCATATC-3′(SEQ ID NO6)除另外指出，每一PCR循环中变性步骤设定为94℃，1分钟，延伸设定为72℃，2分钟。DNA片段用Cla1和BamHI消化，并在唯一的Cla1和BamHI位点被克隆入携带trp启动子和trpA终止子(图16，日本专利，Kokaikoho 63269983)的表达质粒pST811载体中。这种新的质粒，称为pST811-A1.1TCRαS5(图17)被转化入足够的RRI大肠杆菌宿主细胞中。含质粒细胞的选择基础是pST811载体携带的抗生素(氨苄青霉素)抗药性标记基因。合成寡核苷酸和整个TCRα基因的DNA序列通过质粒DNA的DNA序列测定被证实。
使用3’末端引物构建了含有编码26～203氨基酸的A1.1 TCRα的不同平头形式的另一种表达质粒5’-CGTTGGTCTGTTCGAAGTGGATTATCCGTAGGCAA-3’(SEQID NO7)将被扩增的DNA插入pST811载体并产生表达质粒，称为pST811-A1.1 TCRαS3。10.2产TCRα的大肠杆菌的培养携带质粒pST811-A1.1TCRαS5或pST811-A1.1 TCRαS3的RRI大肠杆菌在50ml含50μg/ml氨苄青霉素的Luria液体培养基中培养，在37℃培养过夜。将接种物培养物无菌地转移至1升含0.8％葡萄糖，0.4％酪蛋白水解物，10mg/升硫胺和50mg/升氨苄青霉素的M9培养基中，并在37℃培养3小时。在最初的温育结束时，加入40mg吲哚丙烯酸并将培养物在37℃再温育5小时。11.在大肠杆菌中重组体TCRα的表达-融合表达系统11.1表达质粒的构建Matsuki等人开发了大鼠钙调蛋白表达质粒pTCAL7，它携带钙调蛋白cDNA和trp启动子(Matsuki等，Biotech.Appl.Biochem.，12284-291，1990)(图18)。为表达融合蛋白，在钙调蛋白cDNA的3’末端产生数个克隆位点，它也含有一个凝血酶剪切序列。详细地说，插入pTCAL7的钙调蛋白通过PCR使用两种引物扩增，一种编码含有Cla1位点的钙调蛋白cDNA5’末端，另一种提供钙调蛋白cDNA3’末端序列，凝血酶剪切位点和BamHI，Xba1，Not1和BglII位点。5′CGCAATCGATTAATTTATTAAAACTTAAGGAGGTATATTATGGCA-3′(SEQ ID NO8)5′-GAAGATCTGCGGCCGCTCTAGAGGATCCACGCGGAACCAGTTTTGCAGTCATC-3′(SEQ ID NO9)
扩增的DNA片段用Cla1和BglII酶切并插入pTCAL17质粒由Cla1和BglII酶切所获得的大片段中。新的质粒，称为pCF1(图19)被转化进足够量的大肠杆菌DH5宿主细胞中。合成的寡核苷酸的DNA序列由DNA测序测定。11.2 TCRα表达质粒的构建来源于3B3细胞的编码TCRα胞外区域21～241氨基酸的DNA片段，可用PCR从pCR1000-3B3 TCRα质粒中通过两个分别包括5’端Xba1位点，终止密码子和3’端NotI位点的引物扩增获得。这些引物的序列是5′-GCTCTAGAGGACAGCAAGTGCAGCAGAGT-3′(SEQ ID NO10)5′-AAGCGGCCGCTTAGTTTTGAAAGTTTAGGTT-3′(SEQ ID NO11)扩增的DNA片段与XbaI和NotI酶切的pCFI质粒连接。新的质粒，称为pCFI-3B3 TCRα(图20)被转化入足够量的W3110大肠杆菌细胞中，并且还确定了DNA序列。
A1.1来源的编码26～240氨基酸的cDNA也通过使用两个引物用上述的方法插入pCFI中；5′-GATCTAGACAGAGCCCAGAATCCCTCAGTG-3′(SEQ ID NO12)5′-AAGCGGCCGCTTATTGAAAGTTTAGGTTCATATC-3′(SEQ ID NO13)并且新的表达质粒pCFI-A1.1 TCRαS5也被构建。产TCRα的大肠杆菌的培养在实施例10中有介绍。在该表达系统中，融合蛋白钙调蛋白-3B3 TCRα或钙调蛋白-A1.1 TCRαS5，以可溶形式表达，并且表达量大约占总蛋白的10％(图21)。12.实施例重组TCRα的提纯12.1重组TCRα的提纯和再折叠--直接表达系统约1g湿重的表达A1.1 TCRαS5的细胞悬溶于30ml水中并用French-Press在8000磅/英寸2，4次打碎。被打碎的细胞碎片通过在4℃，15000xg离心10分钟获得，并用水洗2次。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，证实碎片主要是A1.1 TCRαS5蛋白(图22)。将含有不可溶A1.1 TCRαS5的碎片估计为1至2mg，加至4ml合适的混合物中，使混合物中各成分的最终浓度为8M尿素，50mM乙酸钠和0.1mMEDTA。该混合物在室温保持了3小时以溶解A1.1 TCRαS5。在室温以15000×g离心10分钟去除剩下的不可溶物质。
为再折叠/再氧化可溶性A1.1 TCRαS5，上清液碎片被慢慢加入，同时搅拌，加至40ml合适的混合物中，使混合物中各成分的最终浓度为2.5M尿素，5mM乙酸钠，0.01mM EDTA 50mM Tris盐酸pH 8.5，1mM谷胱甘肽(还原形式)和0.1mM谷胱甘肽(氧化形式)。在4℃16小时后，加入400μl三氟乙酸盐(TFA)至混合物中。将该混合物在室温加在已用0.1％(v/v)TFA/水平衡的反相Vydac C4柱(1×10cm)上，流率每分钟1ml。上样后，用含10％(v/v)乙腈的0.1％TFA/水洗柱。A1.1与柱结合的TCRαS5物质，用在0.1％TFA/水中的30％至40％(v/v)的乙腈梯度洗脱。从C4柱收集的级分的等分试样不经还原样本即可通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，并且纯化的A1.1 TCRαS5蛋白在级分25至30中被鉴定。合并这些级分并在真空条件下干燥。干燥的蛋白溶于PBS，然而，也可使用其它类似的缓冲液。
A1.1 TCRαS3通过上述同样程序提纯和再折叠。12.2重组TCRα的提纯-融合表达系统约1g湿重表达3B3 TCRα的细胞被悬溶于100ml 50mM Tril盐酸缓冲液中，pH 8.0，并用French Press在8000磅/英寸2打碎4次。上清液通过在4℃15000xg离心10分钟收集，并对50mM Tris盐酸缓冲液透析在4℃过夜，该Tris-HCl缓冲液pH为8.0，含2mM谷胱甘肽(还原形式)和0.2mM谷胱甘肽(氧化形式)。将该样本溶液加入合适的混合物使混合物中成分的最终浓度为150mM NaCl，1mM CaCl2和5mMMgCl2。此混合物在4℃加至用50mM盐酸Tris pH 8.0，150mM NaCl，1mM CaCl2和5mM MgCl2平衡过的苯基sepharose 6快流速低胶层柱(Pharmacia，3×6cm)上并以0.5ml/分的流率过柱。用相同缓冲液洗柱后，钙调蛋白-TCRα融合蛋白用含4mM EDTA的50ml盐酸Tris pH 8.0以每分钟0.5ml的流率洗脱。各级分的等分试样通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表明此融合蛋白被高度浓缩(图23)。
洗脱级分对含150mM NaCl的50mM盐酸Tris缓冲液pH 8.0透析4℃过夜。CaCl2被加入至50ml经透析的级分至终浓度为2.5mM，并加入1％的凝血酶(Sigma)在25℃温育6小时以消化融合蛋白。为中止消化，向反应混合物加入EDTA至终浓度为4mM，随后将此混合物对50mMTris盐酸缓冲液pH 8.0透析。透析后，通过超滤将混合物浓缩为5ml并加在用2倍PBS缓冲液平衡过的TSK G2000凝胶滤过柱(Toyo Soda)上，并通过HPLC以每分钟3ml的流率分级。在级分24至26中收集到2mg经纯化的383 TCRα蛋白。13.实施例重组的TCRα的生物活性13.1重组的A1.1 TCRα的体外免疫抑制活性为测定重组体A1.1 TCRα的生物活性，使用一种简单的抗原特异性系统(Zheng等，J.Immunol.，401351-1358，1988；Zheng等，ProcNatl Acad Sci.USA.，863758-3762，1989；Bissonette等，J.Immunol.1462898-2907，1991)。得自C57B1/6或C57B1/10小鼠的1×107脾细胞被置于1ml添加10％胎牛血清的5×10-5M2-巯基乙醇(2-ME)的RPMI 1640培养液中。每一培养物接受50μl与poly-18(EYK(EYA)5)或替代多肽偶联的1％SRBC。通过向培养物加入带或不带“辅助成分”(10-15％)的重组TCRα测定抑制活性。这种辅助成分从得自对SRBC免疫的动物的小鼠T细胞培养物制备，随后用SRBC吸附上清液。此培养物在37℃饱和湿度的92％空气/8％CO2中温育并在5天后测定抗-SRBC PFC(斑形成细胞)。在所有本文显示的实验中，A1.1细胞培养上清液被用作阳性对照。
重组A1.1 TCRαS5(参见实施例10.1)的免疫抑制活性以剂量依赖形式被观察到，结果显示于图24a中。此图显示得自两个被编码的实验的结果，其中重组TCRα分子被滴定，因而每一稀释物被编码。重组A1.1TCRαS3(参见实施例10.1)的免疫抑制活性也以剂量依赖形式被观察到(图24b)。13.2重组TCRα的抗原特异性免疫抑制活性A1.1来源的TCRα链的精细抗原特异性已被描述(Bissonnette等，J.Immunol.，1462898-2907，1991；Green等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.888475-8479，1991)。当使用poly-18或EYKEYAEYAEYAEYA时可观察到TCRα链的免疫抑制活性，但当使用替换肽如EYAEYAEYAEYAEYA和EYKEYAEYAAYAEYA时检测不到免疫抑制活性。因此重组体A1.1 TCRαS5的抗原特异性通过使用这4种肽而被测定。重组体TCRα蛋白只在有poly-18或EYKEYAEYAEYAEYA存在下在终浓度为4×10-10M时显示抑制活性(图25)。此图代表来自4个实验的数据，其中每一种在左测显示的肽(或盐水)被加入编码的管中。被编码的样本随后被用于与SRBC偶联以供在存在辅助上清液情况下测定培养物。在缺乏辅助上清液时在任何情况下都未观察到抑制活性。每一实验的编码是不同的。13.3重组TCRα的体内免疫抑制活性为确定是否重组体TCRα调节体内免疫反应，而将重组3B3 TCRα蛋白用于用蜂毒PLA2免疫接种的小鼠。
作为一种抗原，蜂毒PLA2的DNP(二硝基苯)衍生物(Sigma)按标准方法制备。Balb/c小鼠通过腹腔内注射10μg吸附于2mg明矾的DNP-PLA2被免疫接种。重组的3B3 TCRα在第-1，0，2，4，6天以每次5μg的剂量腹腔内注射，而对照小鼠只接受PBS。免疫接种后2周，从每只动物取得血清并用ELISA(Iwata等，J.Immunol.，1413270-3277，1988)测定抗DNP-IgGI和抗DNP-IgE的活性。抗DNP-IgGI和抗DNP-IgE被显著抑制(表1)。为评价抗原特异性，将DNP-卵清蛋白用作抗原并测定重组体3B3 TCRα的活性。正如所预期的，用重组的TCRα处理，免疫接种的小鼠不影响抗DNP抗体对DNP-OVA的反应。
这些结果表明了重组体TCRα蛋白是一种抗原特异性方式的免疫抑制活性。没有动物对重组体TCRα蛋白有副反应，表明TCRα蛋白具有抑制介导自身免疫疾病和过敏等疾病的免疫反应的潜在用途。
表1重组3B3 TCRα对Balb/c小鼠抗-半抗原抗体反应的抑制
(a)用明矾吸附的DNP-PLA2免疫接种后2周(b)P＜0.05本发明不限于例举的实施方案范围内，它们意在阐明本发明的单一方面，任何功能上等价的微生物也在本发明范围内。事实上，除那些本文已显示和描述的以外，对本发明的各种改进根据上述描述和附图来说对于本领域技术人员是显而易见的。这种改进看来也属于所附的权利要求书范围内。
本文引用的所有出版物全文并入本文作为参考。
序列表(1)一般信息LA JOLLA INSTITUTE FOR ALLERGYAND IMMUNOLOGY and KIRIN BEERKABUSHIKI KAISHA(ii)发明名称T-细胞α链抗原特异性免疫调节的方法(iii)序列数目28(iv)通讯地址(A)收信人Spensley Hom Jubas & Lubitz(B)街道1880 Century Park East，Suite 500(C)城市洛杉矶(D)州加利福尼亚(E)国家美国(F)邮编90067(v)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release #1.0，Version #1.25(vi)本申请资料(A)申请号PCT/(B)提交日1994年12月12日(C)分类(viii)代理人/事务所信息(A)姓名Wetherell，Jr.，Ph.D.，John R(B)登记号31，678(C)参考/案号FD-3085(ix)电信信息(A)电话(619)455-5100(B)电传(619)455-5110(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度5氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线状(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键词肽(B)位置1..5(xi)序列描述SEQ ID NO1Lys Val Pro Arg Gly1 5(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)长度15氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线状(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键词肽(B)位置1..15(xi)序列描述SEQ ID NO2Glu Tyr Lys Glu Tyr Ala Glu Tyr Ala Glu Tyr Ala Glu Tyr Ala1 5 10 15(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)长度18氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线状(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键词肽(B)位置1..18(xi)序列描述SEQ ID NO3Glu Tyr Lys Glu Tyr Ala Glu Tyr Ala Glu Tyr Ala Glu Tyr Ala Glu1 5 10 15Tyr Lys(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)长度18氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线状(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键词肽(B)位置1..18(xi)序列描述SEQ ID NO4Glu Tyr Lys Glu Tyr Ala Glu Tyr Ala Ala Tyr Ala Glu Tyr Ala Glu1 5 10 15Tyr Lys(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)长度63碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线状(ii)分子类型DNA(基因组的)(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置1..63(xi)序列描述SEQ ID NO5AACATCGATT AATTTATTAA AACTTAAGGA GGTATATTAT GAGCCCAGAA TCCCTCAGTG60TCC 63(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)长度36碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线状(ii)分子类型DNA(基因组的)(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置1..36(xi)序列描述SEQ ID NO6AACGGATCCC TATTATTGAA AGTTTAGGTT CATATC 36(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)长度35碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线状(ii)分子类型DNA(基因组的)(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置1..35(xi)序列描述SEQ ID NO7CGTTGGTCTG TTCGAAGTGG ATTATCCGTA GGCAA 35(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)长度45碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线状(ii)分子类型DNA(基因组的)(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置1..45(xi)序列描述SEQ ID NO8CGCAATCGAT TAATTTATTA AAACTTAAGG AGGTATATTA TGGCA 45(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征
(A)长度53碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线状(ii)分子类型DNA(基因组的)(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置1..53(xi)序列描述SEQ ID NO9GAAGATCTGC GGCCGCTCTA GAGGATCCAC GCGGAACCAG TTTTGCAGTC ATC 53(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)长度29碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线状(ii)分子类型DNA(基因组的)(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置1..29(xi)序列描述SEQ ID NO10GCTCTAGAGG ACAGCAAGTG CAGCAGAGT 29(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)长度31碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线状(ii)分子类型DNA(基因组的)(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置1..31(xi)序列描述SEQ ID NO11AAGCGGCCGC TTAGTTTTGA AAGTTTAGGT T 31(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)长度30碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线状(ii)分子类型DNA(基因组的)(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置1..30(xi)序列描述SEQ ID NO12GATCTAGACA GAGCCCAGAA TCCCTCAGTG30(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)长度34碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线状(ii)分子类型DNA(基因组的)(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置1..34(xi)序列描述SEQ ID NO13AAGCGGCCGC TTATTGAAAG TTTAGGTTCA TATC 34(2)SEQ ID NO14的信息(i)序列特征(A)长度1092碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线状(ii)分子类型DNA(基因组的)(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置1..1092(xi)序列描述SEQ ID NO14GCTAGCAAAG CTGCTTTTTA GTGTTTCCTA TAGGAGATGT CAAAACTTAT GAACAGCAAC60TATATGAGTT TAGGATTGAG AATCTAATCC ACAGCGAAGA GGGAAGAGGA GAGAATGAAA120TCCTTGAGTG TTTTACTAGT GGTCCTGTGG CTCCAGTTAA ACTGCGTGAG GAGCCAGCAG180AAGGTGCAGC AGAGCCCAGA ATCCCTCAGT GTCCCAGAGA GCATGGCCTC TCTCAACTGC240ACTTCAAGTG ATCGTAATTT TCAGTACTTC TGGTGGTACA GACAGCATTC TGGAGAAGGC300CCCAAGGCAC TGATGTCCAT CTTCTCTGAT GGTGACAAGA AAGAAGGCAG ATTCACAGCT360ACCTCAATA AGGCCAGCCT GCATGTTTCC CTGCACATCA GAGACTCCCA GCCCAGTGAC 420TCCGCTCTCT ACTTCTGTGC AGCTAGTGAG CCGGGTTACC AGAACTTCTA TTTTGGGAAA480GGAACAAGTT TGACGTGCAT TCCAAACGAC ATCCAGAACC CAGAACCTGC TGTGTACCAG540TTAAAAGATC CTCGGTCTCA GGACAGCACC CTCTGCCTGT TCACCGACTT TGACTCCCAA600ATCAATGTGC CGAAAACCAT GGAATCTGGA ACGTTCATCA CTGACAAAAC TGTGCTGGAC660ATGAAAGCTA TGGATTCCAA GAGCAATGGG GCCATTGCCT GGAGCAACCA GACAAGCTTC720ACCTGCCAAG ATATCTTCAA AGAGACCAAC GCCACCTACC CCAGTTCAGA CGTTCCCTGT780GATGCCACGT TGACTGACAA AAGCTTTGAA ACAGATATGA ACCTAAACTT TCAAAACCTG840TCAGTTATGG GACTCCGAAT CCTCCTGCTG AAAGTAGCCG GATTTAACCT GCTCATGACG900CTGAGGCTGT GGTCCAGTTG AGGTCTGCAA GACTGACAGA GCCTGACTCC CAAGCTCCAT960CCTCCTCACC CCTCCGCTCC TTCTTCAAGC CAAAAGGAGC CCTCCCACCT CGTCAAGACG1020GCTGTCTGGG GTCTGGTTGG CCCTGATTCA CAATCCCACC TGGATCTCCC AGATTTGTGA1080GGAAGGTTG TG 1092(2)SEQ ID NO15的信息(i)序列特征(A)长度15氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线状(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键词肽(B)位置1..15(xi)序列描述SEQ ID NO15Glu Tyr Lys Glu Tyr Ala Glu Tyr Ala Ala Tyr Ala Glu Tyr Ala1 5 10 15(2)SEQ ID NO16的信息(i)序列特征(A)长度18氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线状(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键词肽(B)位置1..18(xi)序列描述SEQ ID NO16Glu Tyr Lys Glu Tyr Ala Glu Tyr Ala Glu Tyr Ala Glu Tyr Ala Glu1 5 10 15Tyr Ala(2)SEQ ID NO17的信息(i)序列特征(A)长度12氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线状(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键词肽(B)位置1..12(xi)序列描述SEQ ID NO17Glu Tyr Lys Glu Tyr Ala Glu Tyr Ala Glu Tyr Ala1 5 10(2)SEQ ID NO18的信息(i)序列特征(A)长度15氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链
(D)拓扑学线状(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键词肽(B)位置1..15(xi)序列描述SEQ ID NO18Glu Tyr Lys Glu Tyr Ala Glu Tyr Ala Glu Tyr Ala Glu Tyr Ala1 5 10 15(2)SEQ ID NO19的信息(i)序列特征(A)长度15氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线状(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键词肽(B)位置1..15(xi)序列描述SEQ ID NO19Glu Tyr Lys Glu Tyr Ala Glu Tyr Ala Glu Tyr Ala Glu Tyr Lys1 5 10 15(2)SEQ ID NO20的信息(i)序列特征(A)长度18氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线状(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键词肽(B)位置1..18(xi)序列描述SEQ ID NO20Glu Tyr Lys Glu Tyr Ala Glu Tyr Ala Glu Tyr Ala Glu Tyr Ala Glu1 5 10 15Tyr Lys(2)SEQ ID NO21的信息(i)序列特征(A)长度15氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线状(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键词肽(B)位置1..15(xi)序列描述SEQ ID NO21Glu Tyr Lys Glu Tyr Ala Glu Ala Ala Glu Tyr Ala Glu Tyr Ala1 5 10 15(2)SEQ ID NO22的信息(i)序列特征(A)长度15氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线状(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键词肽(B)位置1..15(xi)序列描述SEQ ID NO22Glu Tyr Ala Glu Tyr Ala Glu Tyr Ala Glu Tyr Ala Glu Tyr Ala1 5 10 15(2)SEQ ID NO23的信息(i)序列特征(A)长度15氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线状(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键词肽
(B)位置1..15(xi)序列描述SEQ ID NO23Glu Tyr Lys Glu Tyr Ala Glt Tyr Ala Ala Tyr Ala Glu Tyr Ala1 5 10 15(2)SEQ ID NO24的信息(i)序列特征(A)长度16氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线状(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键词肽(B)位置1..16(xi)序列描述SEQ ID NO24Asp Tyr Thr Gly Lys Ile Met Trp Thr Pro Pro Ala Ile Phe Lys Ser1 5 10 15(2)SEQ ID NO25的信息(i)序列特征(A)长度696碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线状(ii)分子类型肽(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置37..681(xi)序列描述SEQ ID NO25CATCGATTAA TTTATTAAAA CTTAAGGAGG TATATT ATG AGC CCA GAA TCC CTC 54Met Ser Pro Glu Ser Leu1 5AGT GTC CCA GAG AGC ATG GCC TCT CTC AAC TGC ACT TCA AGT GAT CGT 102Ser Val Pro Glu Ser Met Ala Ser Leu Asn Cys Thr Ser Ser Asp Arg10 15 20AAT TTT CAG TAC TTC TGG TGG TAC AGA CAG CAT TCT GGA GAA GGC CCC 150Asn Phe Gln Tyr Phe Trp Trp Tyr Arg Gln His Ser Gly Glu Gly Pro25 30 35AAG GCA CTG ATG TCC ATC TTC TCT GAT GGT GAC AAG AAA GAA GGC AGA198Lys Ala Leu Met Ser Ile Phe Ser Asp Gly Asp Lys Lys Glu Gly Arg40 45 50TTC ACA GCT CAC CTC AAT AAG GCC AGC CTG CAT GTT TCC CTG CAC ATC246Phe Thr Ala His Leu Asn Lys Ala Ser Leu His Val Ser Leu His Ile55 60 65 70AGA GAC TCC CAG CCC AGT GAC TCC GCT CTC TAC TTC TGT GCA GCT AGT294Arg Asp Ser Gln Pro Ser Asp Ser Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Ala Ser75 80 85GAG CCG GGT TAC CAG AAC TTC TAT TTT GGG AAA GGA ACA AGT TTG ACG342Glu Pro Gly Tyr Gln Asn Phe Tyr Phe Gly Lys Gly Thr Ser Leu Thr90 95 100TGC ATT CCA AAC GAC ATC CAG AAC CCA GAA CCT GCT GTG TAC CAG TTA390Cys Ile Pro Asn Asp Ile Gln Asn Pro Glu Pro Ala Val Tyr Gln Leu105 110 115AAA GAT CCT CGG TCT CAG GAC AGC ACC CTC TGC CTG TTC ACC GAC TTT438Lys Asp Pro Arg Ser Gln Asp Ser Thr Leu Cys Leu Phe Thr Asp Phe120 125 130GAC TCC CAA ATC AAT GTG CCG AAA ACC ATG GAA TCT GGA ACG TTC ATC486Asp Ser Gln Ile Asn Val Pro Lys Thr Met Glu Ser Gly Thr Phe Ile135 140 145 150ACT GAC AAA ACT GTG CTG GAC ATG AAA GCT ATG GAT TCC AAG AGC AAT534Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Lys Ala Met Asp Ser Lys Ser Asn155 160 165GGG GCC ATT GCC TGG AGC AAC CAG ACA AGC TTC ACC TGC CAA GAT ATC582Gly Ala Ile Ala Trp Ser Asn Gln Thr Ser Phe Thr Cys Gln Asp Ile170 175 180TTC AAA GAG ACC AAC GCC ACC TAC CCC AGT TCA GAC GTT CCC TGT GAT630Phe Lys Glu Thr Asn Ala Thr Tyr Pro Ser Ser Asp Val Pro Cys Asp185 190 195GCC ACG TTG ACC GAG AAA AGC TTT GAA ACA GAT ATG AAC CTA AAC TTT678Ala Thr Leu Thr Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Met Asn Leu Asn Phe
200 205 210CAA TAATAGGGAT CCGTT696Gln215(2)SEQ ID NO26的信息(i)序列特征(A)长度215氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线状(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO26Met Ser Pro Glu Ser Leu Ser Val Pro Glu Ser Met Ala Ser Leu Asn1 5 10 15Cys Thr Ser Ser Asp Arg Asn Phe Gln Tyr Phe Trp Trp Tyr Arg Gln20 25 30His Ser Gly Glu Gly Pro Lys Ala Leu Met Ser Ile Phe Ser Asp Gly35 40 45Asp Lys Lys Glu Gly Arg Phe Thr Ala His Leu Asn Lys Ala Ser Leu50 55 60His Val Ser Leu His Ile Arg Asp Ser Gln Pro Ser Asp Ser Ala Leu65 70 75 80Tyr Phe Cys Ala Ala Ser Glu Pro Gly Tyr Gln Asn Phe Tyr Phe Gly85 90 95Lys Gly Thr Ser Leu Thr Cys Ile Pro Asn Asp Ile Gln Asn Pro Glu100 105 110Pro Ala Val Tyr Gln Leu Lys Asp Pro Arg Ser Gln Asp Ser Thr Leu115 120 125Cys Leu Phe Thr Asp The Asp Ser Gln Ile Asn Val Pro Lys Thr Met130 135 140Glu Ser Gly Thr Phe Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Lys Ala145 150 155 160Met Asp Ser Lys Ser Asn Gly Ala Ile Ala Trp Ser Asn Gln Thr Ser165 170 175Phe Thr Cys Gln Asp Ile Phe Lys Glu Thr Asn Ala Thr Tyr Pro Ser180 185 190Ser Asp Val Pro Cys Asp Ala Thr Leu Thr Glu Lys Ser Phe Glu Thr195 200 205Asp Met Asn Leu Asn Phe Gln210 215(2)SEQ ID NO27的信息(i)序列特征(A)长度807碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线状(ii)分子类型DNA(基因组的)(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置1..804(xi)序列描述SEQ ID NO27ATG AAG AGC CTG CTG AGC TCT CTG CTG GGG CTT CTG TGC ACC CAG GTT 48Met Lys Ser Leu Leu Ser Ser Leu Leu Gly Leu Leu Cys Thr Gln Val1 5 10 15TGC TGG GTG AAA GGA CAG CAA GTG CAG CAG AGT CCT GCA TCC TTG GTT 96Cys Trp Val Lys Gly Gln Gln Val Gln Gln Ser Pro Ala Ser Leu Val20 25 30CTG CAG GAG GGG GAG AAC GCA GAG CTG CAG TGT AAC TTT TCC TCC ACA 144Leu Gln Glu Gly Glu Asn Ala Glu Leu Gln Cys Asn Phe Ser Ser Thr35 40 45GCA ACC CAG CTG CAG TGG TTT TAC CAA CGT CCT GGG GGA AGC CTC GTC 192Ala Thr Gln Leu Gln Trp Phe Tyr Gln Arg Pro Gly Gly Ser Leu Val50 55 60AGC CTG TTG TAC AAT CCT TCT GGG ACA AAG CAC ACT GGA AGA CTG ACA240Ser Leu Leu Tyr Asn Pro Ser Gly Thr Lys His Thr Gly Arg Leu Thr65 70 75 80TCC ACC ACA GTC ACT AAA GAA CGT CGC AGC TCT TTG CAC ATT TCC TCC288Ser Thr Thr Val Thr Lys Glu Arg Arg Ser Ser Leu His Ile Ser Ser85 90 95TCC CAG ATC ACA GAC TCA GGC ACT TAT TTC TGT GCT ATG GAA GAC ACT336Ser Gln Ile Thr Asp Ser Gly Thr Tyr Phe Cys Ala Met Glu Asp Thr100 105 110GGA GCT AAC ACT GGA AAG CTC ACG TTT GGA CAC GGC ACC ATC CTT AGG384Gly Ala Asn Thr Gly Lys Leu Thr Phe Gly His Gly Thr Ile Leu Arg115 120 125GTC CAT CCA AAC ATC CAG AAC CCA GAA CCT GCT GTG TAC CAG TTA AAA432Val His Pro Asn Ile Gln Asn Pro Glu Pro Ala Val Tyr Gln Leu Lys130 135 140GAT CCT CGG TCT CAG GAC AGC ACC CTC TGC CTG TTC ACC GAC TTT GAC480Asp Pro Arg Ser Gln Asp Ser Thr Leu Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp145 150 155 160TCC CAA ATC AAT GTG CCG AAA ACC ATG GAA TCT GGA ACG TTC ATC ACT528Ser Gln Ile Asn Val Pro Lys Thr Met Glu Ser Gly Thr Phe Ile Thr165 170 175GAC AAA ACT GTG CTG GAC ATG AAA GCT ATG GAT TCC AAG AGC AAT GGG576Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Lys Ala Met Asp Ser Lys Ser Asn Gly180 185 190GCC ATT GCC TGG AGC AAC CAG ACA AGC TTC ACC TGC CAA GAT ATC TTC624Ala Ile Ala Trp Ser Asn Gln Thr Ser Phe Thr Cys Gln Asp Ile Phe195 200 205AAA GAG ACC AAC GCC ACC TAC CCC AGT TCA GAC GTT CCC TGT GAT GCC672Lys Glu Thr Asn Ala Thr Tyr Pro Ser Ser Asp Val Pro Cys Asp Ala210 215 220ACG TTG ACC GAG AAA AGC TTT GAA ACA GAT ATG AAC CTA AAC TTT CAA720Thr Leu Thr Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Met Asn Leu Asn Phe Gln225 230 235 240AAC CTG TCA GTT ATG GGA CTC CGA ATC CTC CTG CTG AAA GTA GCG GGA768Asn Leu Ser Val Met Gly Leu Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly245 250 255TTT AAC CTG CTC ATG ACG CTG AGG CTG TGG TCC AGT TGA807Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser260 265(2)SEQ ID NO28的信息(i)序列特征(A)长度268氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线状(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO28Met Lys Ser Leu Leu Ser Ser Leu Leu Gly Leu Leu Cys Thr Gln Val1 5 10 15Cys Trp Val Lys Gly Gln Gln Val Gln Gln Sar Pro Ala Ser Leu Val20 25 30Leu Gln Glu Gly Glu Asn Ala Glu Leu Gln Cys Asn Phe Ser Ser Thr35 40 45Ala Thr Gln Leu Gln Trp Phe Tyr Gln Arg Pro Gly Gly Ser Leu Val50 55 60Ser Leu Leu Tyr Asn Pro Ser Gly Thr Lys His Thr Gly Arg Leu Thr65 70 75 80Ser Thr Thr Val Thr Lys Glu Arg Arg Ser Ser Leu His Ile Ser Ser85 90 95Ser Gln Ile Thr Asp Sar Gly Thr Tyr Phe Cys Ala Met Glu Asp Thr100 105 110Gly Ala Asn Thr Gly Lys Leu Thr Phe Gly His Gly Thr Ile Leu Arg115 120 125Val His Pro Asn Ile Gln Asn Pro Glu Pro Ala Val Tyr Gln Leu Lys130 135 140Asp Pro Arg Ser Gln Asp Ser Thr Leu Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp145 150 155 160Ser Gln Ile Asn Val Pro Lys Thr Met Glu Ser Gly Thr Phe Ile Thr165 170 175Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Lys Ala Met Asp Ser Lys Ser Asn Gly180 185 190Ala Ile Ala Trp Ser Asn Gln Thr Ser Phe Thr Cys Gln Asp Ile Phe195 200 205Lys Glu Thr Asn Ala Thr Tyr Pro Ser Ser Asp Val Pro Cys Asp Ala210 215 220Thr Leu Thr Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Met Asn Leu Asn Phe Gln225 230 235 240Asn Leu Ser Val Met Gly Leu Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly245 250 255Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser260 26权利要求
1.一种调节对抗原的免疫反应的方法，它包括将抗原与对抗原特异的有效量的TCRα链接触，以使TCRα链以抗原特异性方式调节免疫反应。
2.权利要求1的方法，其中TCRα链在辅助成分存在下与抗原接触。
3.权利要求2的方法，其中辅助成分包括由被刺激的T细胞产生的可溶性因子，这种因子在无TCRα时不具免疫调节效应。
4.权利要求3的方法，其中辅助成分包括由去除了可溶性TCRα链的被刺激的T细胞产生的可溶性因子。
5.权利要求4的方法，其中辅助成分由一种T细胞杂交瘤产生。
6.根据权利要求1，2，3，4或5的方法，其中TCRα链以抗原特异性方式抑制免疫反应。
7.根据权利要求1，2，3，4或5的方法，其中TCRα链以抗原特异性方式增强免疫反应。
8.一种增强TCRα链抑制的抗原特异性免疫反应的方法，包括将有效量的可结合TCRα链的对TCRα链特异的抗体与TCRα链接触，从而增强免疫反应。
9.权利要求8的方法，其中抗体被固定而TCRα链被去除。
10.权利要求8的方法，其中抗体结合TCRα链并中和其活性。
11.一种增强被T细胞分泌的TCRα链所抑制的抗原特异性免疫反应的方法，包括将T细胞与和TCRα链信使RNA互补的反义寡核苷酸接触，使TCRα链的表达和分泌受抑制。
12.权利要求11的方法，其中反义寡核苷酸与TCRα链信使RNA的可变区互补。
13.一种在体液中检测调节对抗原的免疫反应的可溶性抗原特异性TCRα链的方法，它包括(a)将含有偶联于可溶解载体上的抗原的脾细胞被测培养物暴露于怀疑含有TCRα链的样本中，在辅助成分存在下达足够时间，以使通过PFC产生指示的免疫反应能发生；和(b)比较被测培养物和不加样本的对照培养物中的PFC的产生，其中与对照物相比较PFC产生减少表明，存在以抗原特异性方式抑制免疫反应的TCRα链。而与对照物比较PFC产生的增加表明存在以抗原特异性方式增强免疫反应的TCRα链。
14.权利要求13的方法，其中TCRα链以抗原特异性方式抑制免疫反应。
15.权利要求13的方法，其中TCRα链以抗原特异性方式增强免疫反应。
16.一种经提纯的TCRα链，它能与抗原结合并调节如体外测定系统评价的对该抗原的免疫反应，它包括(a)将含有偶联于可溶解载体的抗原的脾细胞被测培养物在辅助成分存在下暴露于经纯化的TCRα链，达到足够通过PFC产生指示的免疫反应发生的时间；和(b)比较被测培养物和不加经提纯的TCRα链的对照培养物中的PFC产生，其中与对照物相比PFC产生减少表明TCRα链以抗原特异性方式抑制免疫反应，而与对照物相比PFC产生增加表明TCRα链以抗原特异性方式增强免疫反应。
17.权利要求16的经提纯的TCRα链，它以抗原特异性方式抑制免疫反应。
18.权利要求16的经提纯的TCRα链，它以抗原特异性方式增强免疫反应。
19.一种通式为R1-[X1]-R2的基本纯的融合多肽；其中R1是载体肽，X1是蛋白水解酶识别序列，R2是结构基因编码的多肽。
20.权利要求19的融合多肽，其中载体肽是钙调蛋白。
21.权利要求19的融合多肽，其中由结构基因编码的多肽是T细胞受体α(TCRα)链。
22.权利要求21的融合多肽，其中TCRα链是该多肽的细胞外膜结构域。
23.权利要求19的融合多肽，其中蛋白水解酶识别序列被凝血酶识别。
24.权利要求23的融合多肽，其中蛋白水解酶识别序列是Lys-Val-Pro-Arg-Gly(SEQ ID NO1)
25.一种编码权利要求19的融合多肽的已分离的多核苷酸序列。
26.一种含有权利要求25的多核苷酸序列的重组表达载体。
27.权利要求26的载体，其中该载体为病毒。
28.权利要求26的载体，其中该载体为质粒。
29.权利要求28的载体，其中该载体包含表型选择标记DNA序列。
30.权利要求29的方法，其中表型选择标记选自β-内酰胺酶和氯霉素乙酰转移酶。
31.含有权利要求26的载体的宿主细胞。
32.权利要求31的宿主细胞，其中该宿主细胞是真核生物。
33.权利要求31的宿主细胞，其中该宿主细胞是原核生物。
34.权利要求33的宿主细胞，其中原核细胞选自大肠杆菌，金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌。
35.生产基本纯的，有生物活性的TCRα链的方法，包括(a)培养被含有以可操作形式连接的编码TCRα链的多核苷酸序列的载体转化的宿主细胞；和(b)分离基本纯的有生物活性的TCRα链。
36.权利要求35的方法，其中编码TCRα链的多核苷酸可操作地连接于编码具有下列通式的多肽的多核苷酸上R1-[X1]；其中R1是载体肽而X1是蛋白水解酶识别序列。
37.权利要求36的方法，其中载体肽是钙调蛋白。
38.权利要求36的方法，其中蛋白水解酶识别序列被凝血酶识别。
39.权利要求38的方法，其中蛋白水解酶识别序列是Lys-Val-Pro-Arg-Gly(SEQ ID NO1)。
40.权利要求35的方法，其中TCRα链是多肽的细胞外膜结构域。
41.权利要求36的方法，还包括从融合蛋白剪切TCRα链。
42.一种药用组合物，包括免疫抑制剂量的基本纯的TCRα链和一种药用惰性载体。
43.一种权利要求42的药用组合物，其中TCRα链是细胞外膜结构域部分。
44.权利要求1，8或13任何一个的方法，其中TCRα链是细胞外膜结构域。
45.权利要求16的TCRα链，其中TCRα链是细胞外膜结构域。
全文摘要
以抗原特异性方式调节免疫反应的方法被公开。该方法使用能与抗原特异地结合，并在辅助成分存在下以抗原特异性方式抑制免疫反应的可溶性TCRα链。介绍了已证实具此种活性的TCRα链在治疗超免疫和免疫缺陷疾病的治疗方案中的应用。
文档编号C07K14/435GK1145589SQ94194995
公开日1997年3月19日 申请日期1994年12月13日 优先权日1993年12月13日
发明者D·格林, A·福蒂达, R·比索奈特, T·三个山, Y·石井 申请人:拉霍拉敏感及免疫学研究所, 麒麟麦酒株式会社