除去内毒素的方法

文档序号:3548923阅读:2834来源:国知局
专利名称:除去内毒素的方法
技术领域
本发明涉及从生物学产品尤其是象治疗用蛋白质等制品中除去内毒素的方法。本发明特别(而不是唯一)针对从血浆部分象白蛋白以及从得自革兰氏阴性细菌培养物象大肠杆菌培养物的生物制品中除去内毒素。
内毒素是革兰氏阴性细菌象大肠杆菌的脂多糖(LPS),存在于细胞被膜的外膜中。它们占细胞被膜的外膜重量的一半以上而且总是释放到细菌环境中(Pearson1985)。LPS的基本单位大小是10,000至20,000。然而,在水溶液中,LPS存在于泡中,分子量范围从300,000至1百万(Weary1985)。
LPS分子包含三个不同的化学区,脂类A区,中心的多糖区和O—抗原区。当细胞壁中含有内毒素时,脂类A区存在于细胞膜中。它连接到中心多糖核心上,后者又连接到O—抗原侧链,该侧链是一个随革兰氏阴性菌种不同而异的重复寡糖结构。
脂类A区是由含有磷酸基的葡糖胺双糖组成的,并且是被长链脂肪酸高度取代的。现在已知,脂类A担负与细菌内毒素有关的大部分(如果不是全部的话)活动。内毒素必须从细菌表面释放出来才能有活性(Rietschel and Brade1992)。由内毒素引起的生物活动极其多样。这些活性是通过巨噬细胞及其它细胞组分的激活而被介导的,它导致更广范围的生物效应。微小剂量时,内毒素引起轻度发热和免疫系统的刺激,它又反过来导致微生物死亡。高剂量时,它们引起高度发热,低血压播散性血液凝固和致死性休克。
鉴于内毒素分子的多样性和具有潜在危害性的生物活性,用于治疗的生物学产品(生物制品)中内毒素的存在已引起广泛关注。在生产生物制品所采用的过程中保持无菌以及对生产设备制造中的严格控制,有助于保证产品不含内毒素。然而,生产生物制品所用的原材料经常不是无菌的。实际上,当生物材料来源于革兰氏阴性细菌培养物(例如,用大肠杆菌发酵体系来表达重组蛋白质的方法)时,原材料中的内毒素水平是很高的。实践中,整个过程中保持无菌并不总是可行的或有效的。因此,通常希望有一些在保持治疗用生物成分的完整性的同时又能破坏或除去内毒素的方法。
已有很多破坏或除去内毒素的方法(Pearson1985,Weary1985)。它们包括,用酸或碱水解,氧化,烷化,热处理以及用Polymicin B处理。然而,必须就每种失活方法对所需生物产品的效果进行评价。
此外,尽管可以降低致热活性,但内毒素成分经常保留下来,这些内毒素成分在终产品中的存在并无益处并且可能是有害的。因此,更希望从最终生物制品中除去内毒素成分。
可以在带电的、疏水性的或亲和介质上进行内毒素的选择性结合或者基于大小进行内毒素的分离。在pH值高于2的情况下,内毒素聚集体带负电,将结合到带正电的表面象石棉或阴离子交换剂上(Weary1985)。内毒素也能通过疏水性的相互作用结合到脂肪族聚合物象聚丙烯、聚乙烯、聚偏氟乙烯、聚四氟乙烯和疏水色谱体系上。内毒素也可通过使用固定化Polymicin B的亲和色谱法特异性地除去。另外,因为内毒素主要是以大分子量复合物的形式存在,它们经常可通过超滤或凝胶过滤法从所需成分中除去。
上述每一种方法都存在问题。生物分子象得自血浆的人治疗用蛋白质在低pH(例如低于pH4)下通常是带正电的。尽管内毒素在相对较低的pH下带负电因而能结合到带正电的树脂上,但许多治疗用蛋白质在这些条件下是不稳定的。此外,并不总能达到蛋白质和内毒素间的完全分离。疏水色谱体系能有效地结合内毒素但也经常会结合所需的生物分子。而且,疏水色谱体系难于再生。就载体费用而言,使用Polymicin B的亲和色谱体系价格昂贵。另外,在这些体系中载体难于再生,造成载体的寿命短。也可用排阻色谱法或超滤法来降低内毒素水平。然而,只有当目的生物分子和内毒素分子有显著的大小差异时,排阻色谱体系和超滤体系才是有用的。此外,排阻色谱体系还存在着容量小的问题。
从蛋白质中分离内毒素的主要困难在于设计一种对内毒素的特异性高而对蛋白质的特异性低的载体材料。理想的载体· 应不与蛋白质相互作用· 应对内毒素具有高容量· 应能够再生· 在操作条件下(包括再生方法)应是稳定的· 用于治疗用产品的生产应是可接受的。
在导致本发明的工作中已经发现,过去为凝胶过滤而生产和使用的特定色谱凝胶载体满足上述要求,它与蛋白质的相互作用最小而且对内毒素亲和力高。另外,已经证实,在已为内毒素结合和洗脱结合的内毒素而开发的操作和再生体系中,这些载体是稳定的。
根据本发明,提出了一种从生物制品中除去内毒素的方法,该方法包括在生物制品中的内毒素能有效地与载体结合的条件下,将生物制品与包含烯丙基葡聚糖和N,N′—亚甲基二丙烯酰胺的共聚物的交联的亲水性载体接触以及回收已除去内毒素的纯化的生物制品。
优选在回收纯化的生物制品后,在能有效地从载体上洗脱结合的内毒素的条件下,将交联的亲水性载体再生。
在整篇说明书中(上下文另有要求的除外),术语“包括”应被理解为包含所述的整体或整体组,但并不排除其它的整体或整体组。
包含烯丙基葡聚糖和N,N′—亚甲基二丙烯酰胺的共聚物的交联的亲水性载体是一种优选的具有下面部分结构的产品
这些产品作为Sephacryl凝胶过滤载体(Pharmacia,Uppsala,Sweden)在商业上可得。这些Sephacryl产品作为高分辨率标准色谱的凝胶过滤载体出售,标度从毫升到千升。该凝胶是交联的亲水性载体,目前以六种不同产品的形式出售,每种产品具有不同的孔隙范围Sephacryl S200HR,S300HR,S400HR,S500HR和S1000SF。在本发明之前,没有关于Sephacryl产品结合内毒素的容量的报道或将其用于从生物制品中除去内毒素的报道。
在本发明的特别优选的实施方案中,用于除去内毒素的交联的亲水性载体是Sephacryl S200HR。
根据本发明通过除去内毒素而得以纯化的生物制品包括治疗用产品,它们得自(a)血浆(例如,白蛋白、免疫球蛋白、凝血因子、蛋白酶抑制剂和生长因子);(b)重组体或细胞培养表达体系(例如,人生长激素、干扰素、细胞素、胰岛素单克隆抗体);(c)用于疫苗生产的发酵体系(例如,来自百日咳杆菌的成分、用于百日咳疫苗的培养物)。
在一个特别优选的实施方案中,是在通过血浆分级生产白蛋白的过程中用本发明的方法除去内毒素。基于所谓的科恩分级法的分离和纯化血浆尤其是人血浆的白蛋白以及其它蛋白质和脂蛋白成分的方法,许多年来已广为人知。这些方法包括通过加入乙醇降低血浆的蛋白质成分的溶解度,以及在可变的pH、离子强度、乙醇浓度、蛋白质浓度和温度条件下将血浆分级分离。作为实例,Yap等(1993)描述了一种结合使用科恩分级法和色谱法生产白蛋白的方法。
尽管在良好的生产条件下进行血浆分级分离通常可以避免白蛋白或其它血浆制品受内毒素污染,但偶然的污染仍会发生。这经常造成废弃被污染的产品,或者必须选用上述费用昂贵的纯化步骤来除去内毒素。本发明提供了一种方法,借此可以简便地消除白蛋白或其它血浆组分的任何内毒素污染,因而避免了不经济的纯化步骤或者废弃受污染的产品。另外,本发明的方法可在有稳定剂如色氨酸和辛酸钠存在下进行,在巴氏消毒法中这些稳定剂常用于白蛋白溶液的稳定。
内毒素在Sephacryl S200HR上的分配的研究表明,它具有很高的结合内毒素的容量(至少100EU/ml凝胶)。已专门设计出Sephacryl凝胶载体以限制蛋白质间的相互作用和应用于治疗用蛋白质的分离,并设计用于凝胶过滤(蛋白质和其它生物化合物因大小不同而分离)。现已证实,使用凝胶载体内毒素并不因其大小而溶解,而是结合到载体上而且在正常的水溶性缓冲液条件下不能洗脱下来。而且现已证实,使用1M乙酸可有效地将内毒素从Sephacryl凝胶载体上洗脱,因而实现了载体的重复利用。不能用0.1M乙酸或0.1M氢氧化钠将内毒素从这些载体上洗脱,这表明Sephacryl凝胶载体能在更宽的pH范围与内毒素有效地结合。
在酸性和碱性条件下,已对Sephacryl凝胶载体的稳定性进行了评价,这项研究的结果表明当短时间(37℃下五天)暴露于1M乙酸时载体是稳定的。按照本发明,这种稳定性远远足以用1M乙酸洗脱结合的内毒素,在这些条件下使用时,可以期望Sephacryl凝胶载体的寿命长并能重复使用。
现已发现的Sephacryl凝胶载体的内毒素结合特性预示着能将该载体广泛应用于从生物制品特别是血浆部分如白蛋白中除去内毒素。
在下面的实施例中,更全面地描述了本发明的进一步的特征。然而,这里所包含的详细描述只是为了举例说明本发明,而绝不能理解为对上述发明的范围的限制。


图1表示Sephacryl S200HR色谱上从白蛋白单体中分辨内毒素。
图2表示对受内毒素污染的白蛋白的前沿层析分析。
实施例实施例1内毒素结合的研究A.材料和方法(i) 从5%(W/V)的白蛋白溶液(在室温下将其在空气中暴露几天以受到微生物污染)制备内毒素浓缩物。(ii)内毒素测定。使用Limulus Amoebocyte Lysate(LAL)测试盒(Pyrogent Plus,Bio—Whittaker,Cat.No.N284)测定内毒素。测定前,酸性和碱性溶液被调至pH7.0。(iii)Sephacryl S200HR(分配研究)将Sephacryl S200HR(Pharmacia,Uppsala,Sweden)填充于柱(30mm直径×700mm)中,在100mM乙酸钠pH5.5(2柱体积)中洗涤,然后在50mM乙酸钠pH6.8(4柱体积)中平衡。加入样品并在平衡缓冲液(流速2毫升/分钟)中洗脱。(iv)白蛋白溶液所用白蛋白溶液是0.11M乙酸钠中的14%(W/V)的溶液,pH6.8。B.结果Sephacryl S200HR内毒素分配研究的样品是通过混和18ml14%白蛋白溶液和210μl内毒素(450EU/ML)制备的。将体积为18ml的样品加入到如A(iii)所述方法制备的柱上。内毒素通常是以大分子量复合物(300,000至1百万)的形式存在。在此凝胶过滤体系中,预计将内毒素洗脱于白蛋白聚集体中,然而,没有内毒素被从该体系中洗脱(图1),表明在这些色谱条件下,内毒素结合到Sephacryl S200HR柱上。实施例2本实施例中使用的原料是白蛋白,它是通过科恩分级法制备的,配成140mM NaCl,8mM辛酸钠中的5%(W/V)白蛋白溶液,pH为7.0。Sephacryl S200HR(Phamacia)填充到3×1ml柱内并在缓冲液(50mM乙酸钠pH6.8)中平衡。每一柱上加入2ml5%(W/V)白蛋白溶液的等分试样(内毒素含量为37.5至54EU/ml)。为回收残留的白蛋白,再用6倍柱体积的平衡缓冲液洗柱,接着用6倍柱体积的洗脱缓冲液洗柱,洗脱缓冲液为(i)0.1M乙酸(柱1),(ii)1M乙酸(柱2)或(iii)0.1M氢氧化钠(柱3)。接着用Limulus Amoebocyte Lysate(LAL)测试盒(Pyrogen PlusBio—Whittaker)分析洗池(Washing Pool)和每一洗脱峰的内毒素。表明三种洗脱缓冲液洗脱结合到Sephacryl S200HR凝胶载体上的内毒素的效率的结果总结于下面的表1中。
表1内毒素洗脱剂的效率<
>表1中的结果清楚地表明,Sephacryl S200HR在结合内毒素上是有效的。此处表明,载体结合内毒素的容量高于100EU/ml载体。
对三种洗脱剂的研究结果表明,只有1M乙酸对洗脱内毒素是有效的,所加的几乎全部的内毒素都被回收。经进一步研究表明,2倍柱体积的1M乙酸足以洗脱大部分结合的内毒素。用0.1M氢氧化钠或0.1M乙酸洗涤对洗脱结合的内毒素是无效的。实施例3实施例3至5中所用原料是根据Yap等(1993)的方法结合使用科恩分级法和色谱法制备的白蛋白。简言之,采用科恩分级法将白蛋白从血浆中纯化,以从白蛋白中分离免疫球蛋白。再用离子交换和凝胶过滤色谱法纯化粗白蛋白溶液。离子交换层析后,0.11M乙酸钠中pH5.5的白蛋白洗脱物被调至pH6.8并被浓缩成约14%(W/V)的白蛋白。再于Sephacryl S200HR上处理该材料。接着将白蛋白单体配制成5%(W/V)的白蛋白,140mMNaCl,8mM辛酸钠,pH7.0。
将Sephacryl S200HR(Pharmacia)填充到1ml柱内并在缓冲液(50mM乙酸钠,pH6.8)中平衡。在后继操作中,向柱上加入不同量的含有高内毒素含量(30—60EU/ml)的5%(W/V)白蛋白溶液。每次操作后,为回收残留的白蛋白,用平衡缓冲液(6倍柱体积)洗柱并且将残留的白蛋白与未结合的白蛋白混合保存。接着用1M乙酸洗脱结合的内毒素。再用Limulus Amoebocyte Lysate(LAL)测试盒(Pyrogent Plus,Bio—Whittaker)对回收的白蛋白和1M乙酸洗脱物进行内毒素分析。结果总结于下面的表2中。
表2内毒素在柱上的不同负荷
表2中的结果表明,对白蛋白中不同的内毒素负荷,Sephacryl S200HR在从白蛋白中除去内毒素是有效的,而且接着用1M乙酸洗脱内毒素。当负荷高于90EU/ml时,在白蛋白池中出现少量内毒素。结果还表明,由于每次操作后随着结合内毒素的洗脱使得内毒素负荷被利用,凝胶可被再生。实施例4
用前沿分析法可测定Sephacryl凝胶载体吸附内毒素的最高容量。约10ml5%(W/V)的含高含量内毒素的白蛋白溶液加入到柱上,未结合的原料按级分收集,随后用Limulus Amoebocyte Lysate(LAL)测试盒(Pyrogen Plus,Bio—Whittaker)对这些级分进行内毒素分析。图2表明,直到加入量为6ml,未结合的白蛋白流经柱子而没有内毒素出现,此后内毒素从柱中洗脱出来。
表3表示出本次操作中内毒素的负荷当量,最大容量看来是120EU/ml载体(或4ml的30EU/ml溶液)。
表3前沿分析数据
该数据表明,使用Sephacryl S200HR可成功地将内毒素从白蛋白制品中除去,该凝胶载体吸附内毒素的容量大约是120EU内毒素每毫升载体。实施例5将Sephacryl S200HR(Pharmacia)填充到1ml柱内,并在酸性缓冲液(50mM乙酸钠,pH5.0)中平衡。3ml5%(W/V)的含高含量内毒素的白蛋白溶液的等分试样加到柱上,为回收残留的白蛋白再用平衡缓冲液洗柱并将残留的白蛋白与未结合的白蛋白混合保存。接着用1M乙酸洗脱结合的内毒素。再用LimulusAmoebocyte Lysate(LAL)测试盒(Pyrogent Plus,Bio—Whittaker)对回收的白蛋白池和1M乙酸洗脱物进行内毒素分析。结果总结于下面的表4。
表4酸性条件下内毒素的结合
该数据表明在低pH下Sephacryl S200HR从白蛋白制品中吸附内毒素的能力。
参考文献1. Morrison,D.C.and Ryan,J.L.(1979).Bacterial endotoxins and hostimmune responses.Adv.Immunol.28,293.2. Pearson,F.Chapter 3Endotoxin,pp203-218.In Advances inParenteral Sciences/2. "Pyrogens". EditorJ.R.Robinson.MacelDecker Inc.NY(1985).3. Rietschel,E.T.and Brade,H.Bacterial Endotoxins.Sci.American 26-33August1992.4. Weary,M.Chapter12Depyrogenation,In Advances in ParenteralSciences/2."Pyrogens".EditorJ.R.Robinson.Macel Decker Inc.NY(1985).5. Yap et al.(1993).Biotechnology of Blood Proteins,227,143-149.
权利要求
1.从生物制品中除去内毒素的方法,它包括在生物制品中的内毒素能有效地结合到载体上的条件下,将该生物制品与包含烯丙基葡聚糖和N,N′—亚甲基二丙烯酰胺的共聚物的该交联的亲水性载体接触,以及回收已除去内毒素的纯化的生物制品。
2.根据权利要求1的方法,其中交联的亲水性载体包含一种具有如下部分结构的产物
3.根据权利要求2的方法,其中交联的亲水性载体选自Sephacryl S200HR,Sephacyl S300HR,Sephacryl S400HR和Sephacryl S500HR以及Sephacryl S1000SF。
4.根据权利要求3的方法,其中交联的亲水性载体是Sephacryl S200HR。
5.根据权利要求1至4中任何一个权利要求的方法,进一步包括在能有效地从载体上洗脱结合的内毒素的条件下,再生交联的亲水性载体的步骤。
6.根据权利要求5的方法,其中通过用1M乙酸洗脱,将交联的亲水性载体再生。
7.根据权利要求1至6中任何一个权利要求的方法,其中生物制品是治疗用蛋白质。
8.根据权利要求7的方法,其中生物制品是血浆部分。
9.根据权利要求8的方法,其中生物制品是白蛋白溶液。
10.用权利要求1至9中任何一个权利要求的方法制备的已除去内毒素的生物制品。
全文摘要
从生物制品特别是血浆部分象白蛋白中除去内毒素的方法,包括在生物制品中的内毒素能有效地与载体结合的条件下,将生物制品与包含烯丙基葡聚糖和N,N′-亚甲基二丙烯酰胺的共聚物的交联的亲水性载体接触以及回收已除去内毒素的纯化的生物制品。回收纯化的生物制品后,在能有效地从载体上洗脱结合的内毒素的条件下,载体能被再生。
文档编号C07K14/245GK1123550SQ95190092
公开日1996年5月29日 申请日期1995年2月15日 优先权日1994年2月16日
发明者J·R·戴维斯 申请人:Csl有限公司
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1